Ćwiczenie 2 (05.03.2010)

''Ocena stopnia degradacji kwasów nukleinowych poprzez rozdział elektroforetyczny"

Przygotowanie teoretyczne do ćwiczeń:

- elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym (PFGE);

- zastosowania elektroforezy PFGE;

- czynniki wpływające na wynik elektroforezy PFGE;

- analiza fragmentacji wewnątrzjądrowej genomowego DNA (total DNA elektrophoresis).

• CZĘŚĆ I PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)

Standardowe techniki elektroforetyczne do rozdzielania cząsteczek DNA pomimo, iż są bardzo przydatnym narzędziem biologii molekularnej, mogą zawodzić w przypadkach, kiedy pragniemy efektywnie rozdzielić bardzo duże fragmenty DNA. Migrujące przez żel fragmenty większe niż 20kb mogą przemieszczać sie w sposób niezależny od masy oraz ładunku (fragmenty większe niż 20 kb podczas migracji tworzą mocno rozciągniętą spiralę, która nie migruje na zasadzie sita molekularnego, tylko pełza). W celu rozwiązania tego problemu w 1984r zaproponowano, aby zmodyfikować procedurę elektroforezy stosując zmienne napięcie. Technikę tą nazwano elektroforezą pulsacyjną (Pulsed Field Gel Electrophoresis -PFGE). Aparat do elektroforezy PFGE składa się zazwyczaj z 24 elektrod ułożonych w sześciokąt foremny tworzących 3 jednorodne pola skierowane do siebie pod kątem 120°. Napięcie jest periodycznie zmieniane w trzech kierunkach. Czasy poszczególnych pulsów są równe dla każdego kierunku, co sprawia , iż wypadkowy kierunek przemieszczania się DNA w żelu jest taki sam , jak w przypadku standardowej elektroforezy. Dla bardzo dużych fragmentów DNA (>2Mb) stosuje się zmienne czasy pulsacji, tj. wraz z czasem zwiększa się liniowo długość pulsów (np. od 20 sekund na początku elektroforezy do 60 sekund w 20 godzinie).

Rys.1 Schemat aparatu do PFGE

Podział sekcji /materiałów/technik laboratoryjnych:

Sekcja	Materiał	Protokół
1,7	osady komórkowe K (kontrola) lub traktowane UV	A
2,8	osady komórkowe K (kontrola) lub traktowane UV	B
3,9	osady komórkowe K (kontrola) lub traktowane UV	A
4,10	osady komórkowe K (kontrola) lub traktowane UV	B
5,11	osady komórkowe K (kontrola) lub traktowane UV	A
6,12	osady komórkowe K (kontrola) lub traktowane UV	B

MATERIAŁY I METODY:

- zamrożone osady komórkowe (komórki kontrolne i traktowane promieniowaniem UV) linii nowotworowych HBL-100 (nowotwór piersi); Me45 (czerniak); K562 (białaczka);

- wyizolowane DNA z poprzednich ćwiczeń.

Roztwór lizujący	200 mM EDTA (pH 8.0) 1% SDS 0,5 mg/ml proteinaza K	r. wyjściowy: 0,5M EDTA r. wyjściowy: 10% r. wyjściowy: 20 mg/ml
Bufor TE	20 mM Tris-HCl (pH 8) 50 mM EDTA	r. wyjściowy: 0,5M EDTA
Bufor 5xTBE (1 litr)	20ml EDTA ( 0,5M, pH 8.0) 54g TRIS 27,5g kwasu borowego
Bufor do elektroforezy PFGE	0,5x TBE, (2 litry)
Żel do elektroforezy PFGE	1,2% agaroza w 0,5x TBE, (100ml)

WYKONANIE:

Protokół (A) Przygotowanie agarozowych bloczków:

1. Osad komórkowy zawiesić w 100 µl PBS ogrzanego wcześniej do 37°C i dodać równą objętość 2% niskotopliwej agarozy ( 37°C).

2. Po wymieszaniu zawartość probówki natychmiast wlać do „bloczków”( po 100 µl/ blok). Całość wstawić do 4°C na 15 min (do zastygnięcia agarozy).

1. Gotowe bloki agarozowe przenieść do probówek i dodać po 300 µl roztworu lizującego. Bloki trawić przez 1 h w 50°C z delikatnym kołysaniem. (przejść do CZĘŚĆI II!)

3. Odlać z probówek roztwór lizujący, bloki przemyć trzykrotnie po 5 min buforem TE (po 1 ml).

4. Po przemyciu bloczki agarozowe przenieść ostrożnie do żelu (umieścić w kieszonkach) i zalać 2% niskotopliwą agarozą, odczekać do zastygnięcia.

Protokół (B) Przygotowanie agarozowych pakietów - “beatsów”:

2. Osad komórkowy zawiesić w 100 µl PBS ogrzanego wcześniej do 37°C. Następnie dodać równą objętość 2% niskotopliwej agarozy ( 37°C). Mieszaninę przepipetować kilkukrotnie (uwaga! Całość wykonywać w 37°C).

3. Dodać 200 µl oleju mineralnego (37°C). Vortexować przez 30 sekund na niskich obrotach. Zwiększyć obroty na maksymalne i vortexować przez kolejne 2 sekundy.

4. Probówkę wstawić na 10 minut na lód. Następnie dodać 200 µl PBSu, wymieszać poprzez odwracanie.

5. Całość odwirować (1200rpm, 8min, minimalne przyspieszenie i minimalne hamowanie rotora!). Po zakończonym wirowaniu odrzucić olej.

6. Dodać 200 µl PBSu, ponownie odwirować w warunkach j/w. Odrzucić PBS.

7. Gotowe „beatsy” przenieść szpatułką do 1,5ml probówki, dodać 300 µl roztworu lizującego. Trawić przez 1 h w 50°C z delikatnym kołysaniem. (przejść do CZĘŚĆI II!)

8. Odlać z probówek roztwór lizujący, „beatsy” przemywać trzykrotnie w 1 ml buforu TE, każdorazowo w czasie 5 min.

9. Po przemyciu przenieść pakiety ostrożnie do żelu (umieścić w kieszonkach) i zalać 2% niskotopliwą agarową, odczekać do zastygnięcia.

Elektroforeza pulsacyjna:

Elektroforezę przeprowadzać w buforze 0.5x TBE, przez 20h w temperaturze 14°C (bufor należy uprzednio wlać do aparatu i schłodzić); czas pulsów: 50-90 s; napięcie: 6 V cm^-1.

Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwić w roztworze z dodatkiem bromku etydyny (0.5 µl/ml).

CZĘŚĆ II Elektroforeza DNA genomowego (analiza wewnątrzjądrowej fragmentacji)

W warunkach stresogennych można wywołać w komórkach apoptozę, która najczęściej obserwuje się w obrazach mikroskopowych jako formowanie ciałek apoptotycznych na terenie jadra komórkowego. Jest to wynik działania endogennyh nukleaz tnących i degradujących DNA. W czasie elektroforetycznego duże fragmenty uszkodzonego DNA rozdzielają się wg charakterystycznego schematu, zwanego ,,drabinką apoptotyczną”. Fragmenty te rozdzielają się w agarozie 1.2-1.8% w buforze 1-0.5 x TBE w czasie 1-3h i stałym napięciu 40-60 V.

Rys.2 Obraz mikroskopowy komórek kontrolnych (A) i apoptotycznych (B) oraz rozdział DNA genomowego - w ścieżce a) kontrola; b-e) DNA z komórek apoptotycznych.

WYKONANIE (każda sekcja w czasie godzinnej inkubacji w CZĘŚCI I):

1. Wyizolowane na poprzednich ćwiczeniach DNA przenieść w ilości 20 do nowych probówek i dodać 5 µl buforu odciążającego (6 x LB DNA).

2. Całość krótko wytrząsać i zwirować (short).

3. Następnie przenieść do kieszonek uformowanych na żelu agarozowym 1.2% w 0.5 x TBE.

4. Rozdział elektroforetyczny prowadzić przez 2 h w buforze 1 x TBE, 42 V.

5. Żel wybarwić roztworem bromku etydyny i obserwować w UV.

Bufor 5xTBE (1 litr)	20ml EDTA ( 0,5M, pH 8.0) 54g TRIS 27,5g kwasu borowego
Bufor do elektroforezy PFGE	1 x TBE, (700 ml)
Żel do elektroforezy PFGE	1,2% agaroza w 0,5x TBE, (30ml)

---