Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych, Biotechnologia Enzymatyczna


WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI ŚLĄSKIEJ W GLIWICACH

KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII

ENZYMATYCZNA REDUKCJA
AROMATYCZNYCH ZWIĄZKÓW NITROWYCH

Prowadzący: mgr Anna Habryka, mgr inż. Katarzyna Goj

I. CEL ĆWICZENIA:

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie katalizowanej enzymatycznie redukcji
1,2-dinitrobenzenu i 2,4-dinitroanizolu, odpowiednio, do 2-nitroaniliny
i 2-metoksy-5-nitroaniliny przy użyciu drożdży piekarskich.

II. WPROWADZENIE:

Bezpośrednia redukcja aromatycznych związków nitrowych stanowi ważną reakcję otrzymywania amin aromatycznych, będących cennymi reagentami stosowanymi w syntezie organicznej. Redukcję tą przeprowadza się metodą katalitycznego uwodornienia lub za pomocą wielu odczynników, np.: metali (Zn, Sn, Fe lub nieraz inny metal) w obecności kwasu, siarczków ( NaHS lub (NH4)2S) lub hydrazyny wobec katalizatora.

Selektywną redukcję 1,2-dinitrobenzenu i 2,4-dinitroanizolu, odpowiednio, do 2-nitroaniliny
i 2-metoksy-5-nitroaniliny można przeprowadzić zarówno metodą katalitycznego uwodornienia, jak również w przypadku 1,2-dinitrobenzenu używając siarczku amonu (Schemat 1, Schemat 2).

0x01 graphic

Alternatywą w stosunku do opisanych powyżej chemicznych metod redukcji jest redukcja aromatycznych związków nitrowych z użyciem biokatalizatora. Reakcja ta charakteryzuje się wysoką regio- i chemoselektywnością.

Przemianę nitrobenzenu do aniliny z udziałem drożdży piekarskich zaobserwowali po raz pierwszy Neuberg i Welde już w 1914 roku. Wśród wielu mikroorganizmów drożdże piekarskie (Saccharomyces cerevisiae, ang. bakers' yeast) stanowią cenny biokatalizator.

Swoją popularność zawdzięczają nieograniczonej dostępności (światowa produkcja ok. 600 ton/rok), niskiej cenie oraz łatwości hodowli (nie jest konieczne doświadczenie mikrobiologiczne, sterylne warunki ani specjalistyczne wyposażenie). Reakcje za pomocą drożdży wykonuje się w warunkach fermentacyjnych w środowisku wodnym lub w rozpuszczalnikach organicznych. W warunkach wodnych żywe komórki syntezują i regenerują enzymy i kofaktory, niezbędne do prowadzenia metabolizmu, co umożliwia zredukowanie ilości drożdży, ale często komplikuje izolację produktu lub nie daje zastosować się do nierozpuszczalnych w wodzie substratów. W środowisku organicznym wykorzystuje się wyłącznie zawarte w komórkach enzymy i kofaktory bez możliwości ich regeneracji, co narzuca konieczność zwiększenia ich ilości.

Badania wykazały, że przebieg redukcji monopodstawionych nitrobenzenów silnie zależy od charakteru podstawnika. Jeśli związek zawiera grupę elektronodonorową (np.: NH2, OH, SH, OCH3, CH3, Br) to wydajność reakcji redukcji jest niska lub w ogóle ona nie zachodzi. Jeżeli podstawnik ma charakter elektronoakceptorowy (np.: NO2, CN, CF3, OOEt) redukcja nitrobenzenów zachodzi łatwo z dobrymi wydajnościami. Przykładem tego jest katalizowana drożdżami redukcja 1,2-dinitrobenzenu, w rezultacie której powstaje 2-nitoranilina z wysoką wydajnością, porównywalną z wydajnościami otrzymywanymi w redukcji metodami chemicznymi (Schemat 3).

0x01 graphic

Prowadząc w analogicznych warunkach selektywną redukcję 2,4-dinitroanizolu otrzymać można 2-metoksy-5-nitroaniliną z wydajnością wyższą niż otrzymana metodami chemicznymi (Schemat 4).

0x01 graphic

III. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA:

ZAGROŻENIA : Nitrobenzen i anilina oraz ich pochodne są substancjami działającymi toksycznie na organizm ludzki przez drogi oddechowe oraz skórę.

ŚRODKI OSTROŻNOŚCI: W czasie pracy należy zachować ostrożność!!! Stosuj ubranie ochronne (fartuch), rękawice ochronne oraz okulary.

Ćwiczenie A:

Redukcja 1,2-dinitrobenzenu do 2-nitroaniliny przy użyciu drożdży piekarskich (Schemat 3)

Odczynniki:

Wykonanie:

1) W kolbie Erlenmayera o pojemności 300 cm3 umieść 100 cm3 wody destylowanej oraz 25 g suchych drożdży (lub 50g drożdży Babuni) . Następnie delikatnie zatkaj szyję kolby korkiem z waty i umieść kolbę w cieplarce w temperaturze 300C na 2 - 3 godziny, od czasu do czasu wstrząsając zawartością kolby.

2) Odważ 0,25 g 1,2-dinitrobenzenu i umieść w probówce, następnie rozpuść w minimalnej ilości alkoholu etylowego, a otrzymany roztwór wlej w sam środek mieszaniny wyjętej z cieplarki i dokładnie wymieszaj.

3) Ponownie kolbę umieść w cieplarce w temperaturze 300C na 24 godziny.

4) Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaj celit (17,5 - 15 g) i pozostaw na 30 minut od czasu do czasu mieszając. Następnie zawiesinę przesącz na lejku Büchnera przez złoże mokrego celitu (1 cm) z dwoma sączkami, a pozostałe na lejku drożdże przemyj wodą destylowaną (50 cm3). Odczyn przesączu doprowadź do pH = 7 za pomocą 2 molowego wodnego roztworu NaOH, a następnie nasyć go stałym NaCl.

5) Oddzielone drożdże przemyj octanem etylu (2 ×50 cm3), a otrzymany przesącz użyj do ekstrakcji roztworu wodnego nasyconego NaCl z pkt. 4.

6) Metodą TLC sprawdź czy w ekstahowanej fazie wodnej znajduje się jeszcze pożądany produkt. Jeżeli faza wodna zawiera 2-nitroanilinę to należy powtórzyć ekstrakcję jeszcze jedną porcją octanu etylu (50 cm3).

7) Ekstrakty organiczne połącz i wysusz bezwodnym siarczanem (VI) magnezu. Następnie środek suszący odsącz, a otrzymany roztwór mieszaniny reakcyjnej zatęż na wyparce rotacyjnej do objętości ok. 4 - 5 cm3. Skład mieszaniny reakcyjnej sprawdź metodą TLC [układ rozwijający: eter naftowy/octan etylu, 1:1 (v/v); 1,2-dinitrobenzen Rf = 0,4 (w świetle lampy UV), 2-nitroanilina Rf = 0,55 (jasnożółta plamka widoczna w świetle dziennym)].

8) Wyciągnij wnioski z przeprowadzonej analizy TLC.

9) Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej [eluent: eter naftowy/octan etylu 10:1 następnie 4:1 (v/v)]. Wydajność teoretyczna uzyskanej 2-nitroaniliny o temp. topnienia 72-74 oC (pomarańczowe igły) wynosi 54% (0,11 g).

Ćwiczenie B:

Redukcja 2,4-dinitroanizolu do 2-metoksy-5-nitroaniliny przy użyciu drożdży piekarniczych
(Schemat 4)

Odczynniki:

Wykonanie:

1) W kolbie Erlenmayera o pojemności 300 cm3 umieść 100 cm3 wody destylowanej oraz 35,5 g suchych drożdży (lub 70 g drożdży Babubni) suchych drożdży. Następnie delikatnie zatkaj szyję kolby korkiem z waty i umieść kolbę w cieplarce w temperaturze 300C na 2 godziny, od czasu do czasu wstrząsając zawartością kolby.

2) Odważ 0,25 g 2,4-dinitroanizolu i umieść w probówce, następnie rozpuść w minimalnej ilości alkoholu etylowego, a otrzymany roztwór wlej w sam środek mieszaniny wyjętej z cieplarki i dokładnie wymieszaj.

3) Ponownie kolbę umieść w cieplarce w temperaturze 300C na 60 godzin.

4) Do mieszaniny dodaj kolejną porcję suchych drożdży (10 g) i inkubację mieszaniny prowadź w temperaturze 300C w cieplarce przez kolejne 24 godziny.

5) Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaj celit (5 g) i pozostaw na 30 minut od czasu do czasu mieszając. Następnie zawiesinę przesącz na lejku Büchnera przez 5 cm złoże mokrego celitu z dwoma sączkami. W razie konieczności odczyn przesączu doprowadź do pH = 7 za pomocą 2 molowego wodnego roztworu NaOH, a następnie nasyć go NaCl.

6) Oddzielone drożdże przemyj kilkoma porcjami octanu etylu (całość ok. 150 cm3), a otrzymany przesącz użyj do ekstrakcji roztworu wodnego nasyconego NaCl z pkt. 5.

7) Fazę wodną poddaj ponownie ekstrakcji świeżą porcją octanu etylu (100 cm3).

8) Ekstrakty organiczne połącz i wysusz bezwodnym siarczanem (VI) magnezu. Środek suszący odsącz, a uzyskamy roztwór mieszaniny reakcyjnej zatęż na wyparce rotacyjnej do objętości ok. 4 - 5 cm3. Skład mieszaniny reakcyjnej sprawdź metodą TLC [układ rozwijający: eter naftowy/octan etylu, 2:1 (v/v); 2-metoksy-5-nitroanilina Rf = 0,42 (w świetle lampy UV i jasno żółta plamka widoczna w świetle dziennym), 2,4-dinitrobenzen Rf = 0,35 (w świetle lampy UV), 4-metoksy-5-nitroanilina Rf = 0,21 (w świetle lampy UV i jasno żółta plamka widoczna w świetle dziennym)].

9) Wyciągnij wnioski z przeprowadzonej analizy TLC.

10) Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej [eluent: eter naftowy/octan etylu 4:1 (v/v)]. Wydajność uzyskanej 2-metoksy-5-nitroaniliny (pomarańczowe igły) wynosi 39% (0,06 g) o temperaturze topnienia 114,5 - 1150C.

IV. PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ:

1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej.

2. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: katalizator, enzym, kataliza enzymatyczna, utlenienie, redukcja, selektywność, regioselektywność.

3. Zastanów się czy wiesz:

a) jakie są chemiczne metody redukcji aromatycznych związków nitrowych,

b) na czym polega specyficzność katalizy enzymatycznej.

4. Porównaj reakcję redukcji wybranego przez siebie aromatycznego związku nitrowego przeprowadzoną metodą chemiczną z reakcją z użyciem biokatalizatora - opisaną w instrukcji. Jakie wady i zalety dostrzegasz w obu metodach redukcji? (Przepis na reakcję redukcji aromatycznych zw. nitrowych metodą chemiczną znajdziesz w podręcznikach do preparatyki organicznej).

IV. WARUNKI ZALICZENIA :

1. Poprawne napisanie kartkówki.

2. Staranne wykonanie części eksperymentalnej.

3. Napisanie i oddanie sprawozdania do 2 tygodni (forma sprawozdania zostanie podana przez prowadzącego w czasie trwania zajęć).

V. LITERATURA :

[1] J. March, „Chemia organiczna. Reakcje, mechanizmy, budowa.” WNT, W-wa 1975.

[2] S. M. Roberts (ed.) „ Preparative biotransformations. Whole Cells and Isolated enzymes in Organic Synthesis”. Wiley, London, 1992.

[3] J. Gawroński, K. Gawrońska, K. Kacprzak, M. Kwit, „Współczesna synteza organiczna. Wybór eksperymentów.” PWN, W-wa 2004.

[4] P. Karlson „Zarys biochemii” PWN, W-wa 1987.

[5] S. Servi, Synthesis, 1-25 (1990).


Wyszukiwarka