Ćwiczenie 3

IZOLACJA LECYTYNY

OTRZYMYWANIE LIPOSOMÓW

ODCZYNNIKI

• jajko

• mieszanina etanol:eter dietylowy (2:1)

• eter dietylowy

• aceton

• 0,001 M alkoholowy r-r błękitu metylenowego

• etanol

• nasycony etanolowy r-r CdCl₂

• 0,01 M bufor fosforanowy o pH = 7

APARATURA

• zlewka: 100 ml, 50 ml

• cylinder: 100 ml, 50 ml, 10 ml,

• bagietka x 2

• sączek karbowany

• sączek

• lejek

• kolba gruszkowa 100 ml

• kolba stożkowa 100 ml

• wyparka

• probówki

• pipeta: 2 ml, 1 ml

• mikropipetka

• szkiełka mikroskopowe

• mikroskop

1. CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest izolacja lecytyny z żółtka jaja kurzego i otrzymanie liposomów.

II. WSTĘP TEORETYCZNY

Lecytyna - (fosfatydylocholina) — fosfolipid, który zwykle otrzymuje się z żółtek jajek kurzych lub z ziaren soi.

Jest estrem gliceryny, w której dwie grupy OH są zestryfikowane kwasami tłuszczowymi, a trzecia ma zamiast atomu wodoru resztę kwasu ortofosforowego(V) zestryfikowanego choliną. Należą do grupy związków zwanych fosfatydami.

W organizmie człowieka lecytyna jest obecna w każdej komórce ciała, zwłaszcza jako składnik błon komórkowych. Bierze udział w rozmaitych procesach przemiany materii, jest bardzo ważnym elementem składowym mózgu i tkanki nerwowej, stanowi barierę ochronną ścian żołądka, ma poważny udział w gospodarce cholesterolem. Ponadto opóźnia procesy starzenia, pełni funkcje ochronne wobec wątroby, wspomaga wykorzystanie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, podnosi sprawność krążenia.

Lecytyna jest naturalnym emulgatorem.

Liposomy - struktury powstające samoistnie z fosfolipidów. Mają postać pęcherzyków (o wielkości 0,01-1 μm) wypełnionych wodą a otoczonych dwuwarstwą lipidową.

Niektóre lipidy (substancje tłuszczowe) w kontakcie z wodą tworzą pęcherzyki - małe kuleczki puste w środku. Ich ściankę tworzy podwójna powłoka zbudowana identycznie jak błona komórkowa i zawierająca niewielką ilość roztworu wodnego, w którym powstała.

     Osłonka liposomu składa się z kilku warstw. Substancje czynne rozpuszczalne w wodzie (hydrofilne), jak np. kolagen, ekstrakty roślinne zawarte są wewnątrz liposomu, natomiast substancje rozpuszczalne w tłuszczach (lipofilne), np. niektóre witaminy, olejki roślinne, zgromadzone są w bardziej zewnętrznej warstwie lipidowej.

Liposomy zaczęto wykorzystywać w kosmetyce, ponieważ przenoszą substancje czynne do wnętrza naskórka i ułatwiają ich rozłożenie. Łączą się one także z powierzchniową warstwą naskórka (tzn. z warstwą rogową), wzmacniając ją i przywracając jej spoistość. Dzięki liposomom można do naskórka wprowadzać substancje czynne, a więc np. witaminy, proteiny, składniki nawilżające. Ich stosowanie umożliwia bezpośrednie wprowadzanie wody i substancji tłuszczowych do warstwy rogowej, co z kolei wpływa na regulację gospodarki wodno-tłuszczowej naskórka. Liposomy stosuje się przede wszystkim w kremach do pielęgnacji cery.

Zamykanie substancji czynnych w liposomach jest bardzo skomplikowane i wymaga dużo pracy. Odpowiednio dobrane substancje wtłacza się pod wysokim ciśnieniem w osłonki liposomowe.

Ważniejsze właściwości liposomów:

• doskonała tolerancja przez skórę

• ochrona dla nietrwałych substancji czynnych

• większa skuteczność przy tym samym składzie

• mniej zastosowanych substancji czynnych przy tej samej skuteczności

 Substancje czynne, zawarte w liposomach i transportowane w ten sposób w głębsze warstwy skóry, są przez nią szybciej wchłaniane i mogą w pełni skutecznie oddziaływać.

Osłonki liposomów ulegają w skórze rozpuszczeniu uwalniając powoli zamknięte w nich substancje czynne. Sprawia to, że skóra znacznie lepiej i intensywniej przyswaja potrzebne jej składniki niż w przypadku stosowania zwykłych kremów czy lotionów.

Jeśli skóra, oprócz codziennej pielęgnacji, potrzebuje bardzie intensywnego zabiegu, idealne będzie zastosowanie produktów z liposomami. Dzięki dużej skuteczności tych kosmetyków wystarczą 2-4 tygodnie, aby przywrócić równowagę w skórze. Potem można znów powrócić do zwykłej pielęgnacji i stosować produkty z liposomami jedynie od czasu do czasu w formie kuracji wspierającej codzienne zabiegi pielęgnacyjne.

III. WYKONANIE ĆWICZENIA

Izolacja lecytyny

1. Żółtko oddzielić dokładnie od białka do zlewki o pojemności 100 ml.

2. Dodać 75 ml mieszaniny etanol/eter dietylowy.

3. Wymieszać bagietką i odstawić na 10 minut od czasu do czasu mieszając.

4. Przesączyć przez sączek karbowany do kolby gruszkowej o pojemności 100 ml.

5. Odparować rozpuszczalnik na wyparce próżniowej (temp. 35^oC - 70^oC).

6. Pozostałość lipidową rozpuścić w 10 cm³ eteru dietylowego.

7. Otrzymany roztwór wlać powoli, mieszając do zlewki o pojemności 50 cm³ zawierającej 30 ml acetonu.

8. Wytrącony osad lecytyn odsączyć na sączku do kolby stożkowej o pojemności 100 ml.

9. Scharakteryzować produkt.

Reakcja na wykrywanie lecytyny

1. Niewielką część osadu przenieść do probówki, dodać około 2 ml etanolu.

2. Mieszać bagietką do rozpuszczenia osadu.

3. Dodawać kroplami wstrząsając nasycony etanolowy r-r CdCl₂ .

4. Wytrąca się trwały, krystaliczny związek kompleksowy lecytyny z CdCl₂.

Otrzymywanie liposomów

1. Do probówki odmierzyć 1,9 ml 0,01 M buforu fosforanowego o pH = 7.

2. Dodać 0,1 ml 0,001 M alkoholowego roztworu błękitu metylenowego.

3. Zamieszać i wlać do probówki z osadem lecytyn.

4. Mocno wstrząsać do otrzymania jednorodnej mlecznej zawiesiny.

5. Powstały opalizujący roztwór jest zawiesiną liposomów.

6. Pobrać mikropipetką 2-3 krople roztworu na szkiełko mikroskopowe i obejrzeć preparat pod mikroskopem.

7. Zanotować obserwacje.

8. Narysować odręczny rysunek obrazu spod mikroskopu.

IV. OPRACOWANIE WYNIKÓW

1. Charakterystyka produktu (wygląd, barwa):

2. Reakcja na wykrywanie lecytyny:

3. Odręczny rysunek obrazu spod mikroskopu:

5

---