ENZYMY - część 1

Ogólne właściwości enzymów

Enzymy - swoiste katalizatory komórkowe przyśpieszające reakcje zachodzące w organizmie

• charakteryzują się dużą swoistością w przyspieszaniu lub nadawaniu odpowiedniego kierunku reakcjom chemicznym

• ciepłochwiejne białka proste lub złożone (wyjątek - rybozymy)

Kategorie enzymów ze względu na ich budowę chemiczną

• białka proste - amylaza, ureaza, aldolaza, RNaza

• białka złożone zawierające nieaminokwasowe grupy trwale chemicznie związane z cząsteczką enzymu (grupa prostetyczna np. hem, FAD) - oksydaza cytochromowa, katalaza, peroksydaza

• białka złożone zawierające nieaminokwasowe grupy luźno związane z cząsteczką enzymu (koenzymy np. NAD⁺, NADP⁺)) - dehydrogenazy

apoenzym + koenzym -> holoenzym (aktywny enzym)

Apoenzymy - części białkowe enzymów

Koenzymy - drobnocząsteczkowe związki organiczne lub jony nieorganiczne, których obecność w centrum aktywnym jest niezbędna do katalitycznego działania enzymu (koenzym silnie związany z cząsteczką białka = grupa prostetyczna)

Grupy prostetyczne i koenzymy (kosubstraty)

• ulegają przemianie podczas reakcji enzymatycznej

• powracają do pierwotnej postaci w wyniku reakcji wtórnej

Część białkowa - decyduje o:

• specyficzności w stosunku do substratu (jaki rodzaj substratu ulega przemianie)

• kierunku reakcji

Enzymy:

• monomeryczne - zbudowane z pojedynczego łańcucha polipeptydowego (np. lizozym, elastaza, trypsyna, heksokinaza)

- enzymy zbudowane z dwu lub więcej łańcuchów polipeptydowych połączonych mostkami S-S (np. chymotrypsyna)

• oligomeryczne - zbudowane z dwu lub więcej podjednostek połączonych ze sobą za pomocą wiązań niekowalencyjnych (np. L-asparaginaza, aldolaza)

• kompleksy wieloenzymowe (np. dehydrogenaza pirogronianowa)

Izoenzymy

• zakodowane w DNA, fizycznie odmienne postacie danego enzymu - różnią się:

- wrażliwością na temperaturę

- wrażliwością na działanie różnych związków chemicznych

- powinowactwem do substratu

- ruchliwością elektroforetyczną

- właściwościami immunologicznymi

• katalizują tę samą reakcję

• występują w różnych typach komórek lub komparmentach subkomórkowych

• dehydrogenazy, oksydazy, aminotransferazy, fosfatazy, enzymy proteolityczne

Izoformy - odmienne fizycznie postacie danego enzymu powstające w wyniku modyfikacji potranslacyjnej (np. glikozylacja, hydroksylacja, oksydacja)

Reakcje enzymatyczne

• zwiększenie szybkości reakcji 10⁶-10¹¹

• centrum aktywne - zgrupowanie reszt aminokwasowych, często z odległych sekwencji łańcucha polipeptydowego, z którymi łączy się substrat

• centrum allosteryczne - miejsce w obrębie cząsteczki enzymu, za którego pośrednictwem działają czynniki regulujące aktywność enzymu

Klasyfikacja i nazewnictwo enzymów

Podstawą klasyfikacji i nomenklatury enzymów jest katalizowana przez nie reakcja chemiczna.

Nazewnictwo enzymów:

• nazwa potoczna - zwykle krótkie, tworzone od nazw substratów (amylaza, arginaza, lipaza, ureaza, pepsyna, trypsyna)

• nazwa systematyczna

- identyfikuje enzym i określa jego działanie

- zgodna z zaleceniami Międzynarodowej Unii Biochemicznej z 1964 r.

• numer klasyfikacji międzynarodowej (EC)

Nazwa systematyczna - dwuczęściowa

- pierwsza część: nazwa katalizowanej reakcji + końcówka „aza” (oksydoreduktaza, transferaza, hydrolaza, liaza, izomeraza, ligaza/syntetaza)

- druga część: nazwa substratu w dopełniaczu liczby pojedynczej (np. hydrolaza acetylocholiny) lub jeżeli w reakcji uczestniczą 2 substraty podaje się nazwy obydwu substratów w mianowniku liczby pojedynczej rozdzielone dwukropkiem (np. oksydoreduktaza alkohol : NAD)

Numer międzynarodowej klasyfikacji (EC) składa się z 4 członów oddzielonych kropkami:

• człon I - oznacza numer klasy, do której należy enzym:

• człon II - oznacza podklasę

• człon III - oznacza pod-podklasę

• człon IV - oznacza kolejny numer w jego pod-podklasie

Przykład:

EC 2.6.1.1

Nazwa systematyczna:

aminotransferaza L-asparaginian : 2-oksoglutaran

Nazwa potoczna:

aminotransferaza asparaginianowa

Katalizowana reakcja:

L-asparaginian + 2-oksoglutaran <-> szczawiooctan + L-glutaminian

Oznaczanie enzymów

• pomiar ilości enzymu - po jego wyizolowaniu z badanego materiału

• pomiar aktywności enzymu - na podstawie szybkości katalizowanej reakcji uzyskujemy informację o ilości enzymu

Szybkość reakcji enzymatycznej (1)

• nie zawsze jest proporcjonalna do stężenia enzymu

• pozwala na ocenę aktywności enzymu w warunkach badania

• jest zmienna - zależy od wielu czynników chemicznych i fizycznych, mogących przyspieszać lub hamować reakcję

• maleje z czasem wskutek:

- zwiększenia szybkości reakcji w kierunku przeciwnym w miarę gromadzenia się

produktów

- hamowania aktywności enzymu przez produkt

- stopniowej inaktywacji enzymu

Szybkość reakcji enzymatycznej (2)

• odpowiednie stężenie substratu

• temperatura - stała (25, 30, 37°C)

• odpowiednio dobrany bufor - stałe, optymalne pH i siła jonowa

• aktywatory i inhibitory

Szybkość reakcji enzymatycznej (3)

• wykonujemy pomiary:

- szybkości początkowej reakcji

- szybkości w okresie, w którym pozostaje ona niezmieniona - przebiega zgodnie z kinetyką reakcji zerowego rzędu (stosujemy duże stężenia początkowe substratu)

• stała Michaelisa (K_M) = stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie prędkości maksymalnej (V_max)

- przy stężeniu substratu równym 10∙K_M szybkość reakcji stanowi 90% szybkości maksymalnej

- przy stężeniu substratu równym 0,1∙K_M szybkość reakcji stanowi 9% szybkości maksymalnej

Jeżeli stężenie substratu przekracza 100∙K_M

• reakcja staje się reakcją zerowego rzędu

• szybkość reakcji w dużym zakresie jest proporcjonalna do ilości enzymu

Jednostki aktywności enzymów

• konwencjonalne - ustalane przez autorów metod

• jednostka aktywności enzymatycznej (katal = kat) - jest to aktywność, która przekształca 1 mol substratów w czasie 1 sekundy (mkat, nkat, pkat)

• bezwzględna międzynarodowa jednostka standardowa enzymu (U lub IU) - jest to aktywność, która przekształca 1 mmol substratu (lub 1 mmol odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30°C i w optymalnych warunkach (szczególnie pH i stężenia substratu) (U, mU, kU)

1 kat = 6∙10⁷ U

1 U = 16,67∙10^-9 kat = 16,67 nkat

• w przypadku takich substratów jak białko, wielocukier lub inna substancja, w której więcej niż jedno wiązanie ulega reakcji określenie „1 mmol substratu” zastępuje się wyrażeniem „1 mmol odpowiednich grup” - miarą szybkości reakcji jest liczba rozłożonych wiązań peptydowych czy glikozydowych, a nie liczba całkowicie zhydrolizowanych cząsteczek

• w przypadku reakcji pomiędzy dwiema identycznymi cząsteczkami za podstawę przyjmuje się nie 1 mmol, a 2 mmol (e) danej substancji

• aktywność enzymów w płynach biologicznych wyraża się w ilości jednostek standardowych na 1000 mL płynu

SPECYFICZNOŚĆ ENZYMU

• absolutna - reakcja wyłącznie z jednym substratem np. glukokinaza

• duża - możliwa reakcja z kilkoma substratami np. heksokinaza

- substraty: D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza,

2-deoksy-D-glukoza, D-galaktoza

- inhibitory kompetycyjne - inne heksozy, pentozy

- dwucukry i alkohole pochodne cukrów - nie hamują i nie reagują

• mała - np. esterazy - hydrolizują estry organiczne do alkoholi i kwasów karboksylowych

• grupowa - np. fosfatazy - odczepiają grupę fosforanową z większości organicznych estrów fosforanowych (z różną prędkością)

• stereoizomeryczna - enzymy rozpoznają tylko jeden z możliwych stereoizomerów (np. D-cukry, L-aminokwasy)

WARUNKI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ (1)

1. STĘŻENIE SUBSTRATU

Kinetyka reakcji enzymatycznej z jednym substratem

• Krzywa Michaelisa-Menten

• Wykres Lineweavera-Burka

Kinetyka reakcji enzymatycznej z dwoma substratami

Mechanizmy:

1) sekwencyjne

• substraty biorące udział w reakcji muszą być związane z enzymem przed uwolnieniem pierwszego produktu

• mogą być:

- uporządkowane - przyłączanie substratów i

odłączanie produktów odbywa się w ściśle

określonej kolejności

- losowe

2) ping-pong - jeden lub więcej produktów jest uwalnianych przed przyłączeniem wszystkich substratów

• Mechanizm sekwencyjny uporządkowany reakcji typu dwa-dwa (bi-bi)

Przykład: LDH

• Mechanizm ping-pong w reakcji typu dwa-dwa

Przykład: AST, ALT

Stała Michaelisa

• 10^-5-10^-3 mol/l

• V_max dla reakcji 1- i 2-substratowych przy 100∙K_M

(dla 3-substratowych 1000∙K_M) - ograniczenia:

- rozpuszczalność substratu

- gęstość optyczna roztworu

- ilość oznaczanego enzymu

- koszt

Kinetyka reakcji enzymatycznej - enzymy allosteryczne

Enzymy oligomeryczne:

• przyłączenie substratu do jednej podjednostki powoduje zmiany konformacyjne w pozostałych podjednostkach = zwiększa się powinowactwo substratu do ich centrów aktywnych

Enzymy allosteryczne:

• przyłączenie ligandu (efektora allosterycznego) do centrum allosterycznego w podjednostce regulatorowej enzymu powoduje zmianę konformacji w podjednostkach z centrami aktywnymi = zwiększa/zmniejsza się ich powinowactwo do substratu

Kinetyka reakcji w przypadku enzymów oligomerycznych/allosterycznych ma wykres sigmoidalny!

WARUNKI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ (2)

2. TEMPERATURA

• współczynnik Q₁₀ = 1,7 - 2,5

• termostabilność enzymu - najwyższa temperatura, w której nie dochodzi jeszcze do termicznej inaktywacji enzymu

Temperatura oznaczeń:

• 25°-30°C - metody manualne

• 37°C - metody automatyczne

• 30°C - metody referencyjne (IFCC)

Wzorzec temperatury - temperatura topnienia galu = 29,77°C

Temperatura przechowywania:

4° do 8°C / -20 do -30°C / -70 do -80°C

WARUNKI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ (3)

3. pH i siła jonowa roztworu

Optymalne pH:

• 7-8 dla większości enzymów

• 1,5 pepsyna

• 4-6 fosfataza kwaśna

• 8-10 fosfataza alkaliczna

Skład i stężenie roztworu buforującego

WARUNKI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ (4)

4. Inhibitory

• substancje nisko- lub wysokocząsteczkowe

• jony

Inhibitory odwracalne (można je usunąć) - przykłady:

• Ca⁺² dla enzymów zależnych od Mg⁺²

• EDTA dla fosfatazy alkalicznej i kinazy kreatynowej

Inhibitory nieodwracalne (wiążą się kowalencyjnie z enzymem) - przykłady:

• związki fosforoorganiczne dla esteraz

• anty-enzymy - inhibitory o proteolitycznej aktywności hamujące aktywne enzymy np. inhibitory proteaz serynowych (serpiny)

WARUNKI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ (5)

5. Aktywatory

• jony (Mn⁺², Fe⁺², Co⁺², Zn⁺², K⁺)

- Zn⁺² - fosfataza alkaliczna i karboksypeptydaza

- Cl^-, Br^- - amylaza

- Mg⁺² - kinaza kreatynowa

• aktywatory prekursorów enzymów

• koenzymy/kosubstraty

- NAD⁺, NADP⁺, FAD - dehydrogenazy

- fosforan pirydoksalu (PLP) - aminotransferazy

- pochodne witamin z grupy B

Metody analityczne stosowane do oznaczeń aktywności enzymów

- analiza klasyczna (np. miareczkowanie)

- analiza instrumentalna - metody spektrofotometryczne, polarymetryczne, refraktometryczne, potencjometryczne itd.

Pomiar bichromatyczny

- przy dwóch długościach fali

- pozwala na eliminowanie wpływu substancji

towarzyszących i zanieczyszczeń

Metody oznaczania aktywności enzymów

• metody statyczne

- dwupunktowe - porównanie ilości substratu lub produktu w 2 punktach czasu: w czasie zero i po zakończeniu inkubacji

- należy zapewnić warunki reakcji aby zapewnić stałą szybkość reakcji przez cały czas inkubacji

• metody kinetyczne

- pomiar zmian stężenia substratu lub produktu w jednostce czasu, w początkowym okresie reakcji

- wymagają ciągłej rejestracji zmian stężeń badanego składnika w czasie (pomiar wielopunktowy lub ciągły)

STOSOWANE UKŁADY POMIAROWE

1. Test optyczny

2. Analogi naturalnych substratów

• fosfatazy

- p-nitrofenylofosforan (pNPP)

- a-naftylofosforan

• amylaza

- p-nitrofenylo-D-maltoheptozyd (pNP-G7)

- 2-chloro-p-nitrofenylo-aD-maltotriozyd (CNP-G3)

3. Substancje, z których pod wpływem enzymów powstają barwne produkty reakcji

• 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)

4. Przeciwciała - metody immunoturbidymetryczne, radioimmunologiczne, immunoenzymatyczne

Test optyczny prosty - enzym, którego aktywność oznaczamy wykorzystuje NAD⁺, NADP⁺, NADH+H⁺ lub NADPH+H⁺

Przykład: oznaczanie aktywności LDH

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ <-> mleczan + NAD⁺

spadek ekstynkcji na minutę jest miarą aktywności LDH (dehydrogenazy mleczanowej)

Test optyczny z reakcją wskaźnikową

- enzym, którego aktywność oznaczamy nie wykorzystuje koenzymów NAD⁺, NADP⁺, NADH+H⁺ lub NADPH+H⁺

- jego aktywność oznacza się przez sprzężenie ich działania z reakcją wskaźnikową podczas której wykorzystywane są te koenzymy

Przykład: oznaczanie aktywności ALT

ALT

L-alanina + a-ketoglutaran <-> L-glutaminian + pirogronian

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ <-> mleczan + NAD⁺

Test optyczny z reakcją pomocniczą i wskaźnikową

- gdy nie można oznaczyć końcowego produktu reakcji bezpośrednio za pomocą reakcji wskaźnikowej należy wprowadzić dodatkowy, pomocniczy układ enzymatyczny

Przykład: oznaczanie aktywności CK

CK

kreatyna + ATP <-> fosfokreatyna + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian <-> pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H⁺ <-> mleczan + NAD⁺

! W teście optycznym możemy wykonywać oznaczenia przy 340 nm (głównie), 334 nm lub 365 nm!

Oznaczanie aktywności enzymu metodą kinetyczną

A/min V_K

E [U/L] = ∙ 10⁶

 ∙ d V_A

A/min - zmiana absorbancji w ciągu 1 minuty

 - współczynnik molowy ekstynkcji

V_K - objętość końcowa mieszaniny reakcyjnej

V_A - objętość materiału badanego

d - długość drogi optycznej

STANDARYZACJA METOD ENZYMATYCZNYCH

Zasady standaryzacji oznaczeń aktywności katalitycznej w surowicy ludzkiej opracowane przez IFCC dla:

- kinazy kreatynowej (CK)

- aminotransferazy asparaginianowej (AST)

- aminotransferazy alaninowej (ALT)

- g-glutamylotransferazy (GT/GGT)

- fosfatazy alkalicznej (ACP)

Podstawa standaryzacji - aktywność enzymów jakie uzyskiwano w materiałach biologicznych za pomocą przyjętych przez IFCC procedur wzorcowych.

Procedury wzorcowe (referencyjne)

- dobrze zdefiniowane metody manualne oznaczania aktywności enzymów, które cechują się linową zależnością wyników pomiaru od stopnia rozcieńczenia materiału

- dla których w badaniach porównawczych wykazano najmniejszą zmienność międzylaboratoryjną w zakresie aktywności występującej w osoczu/surowicy prawidłowym i patologicznym

- opracowano nowe metody robocze do oznaczania enzymów i dostosowano je do nowoczesnych analizatorów biochemicznych = metody standaryzowane wobec wzorca IFCC

- stosowanie międzynarodowych certyfikowanych wzorców aktywności enzymów (MCRM) do kalibracji metod roboczych

Podstawowe warunki standaryzacji

• aktywność enzymu musi być stała w czasie oznaczania

• mierzona aktywność enzymu musi być proporcjonalna do rozcieńczenia próbki

• zakres roboczy metody musi odpowiadać zakresowi wielkości aktywności enzymu mierzonej w laboratorium

• reakcję enzymatyczną należy zawsze prowadzić w temperaturze 37°C

Badanie aktywności enzymatycznej

• w tkankach

• w płynach ustrojowych

- osocze lub surowica

- płyn mózgowo-rdzeniowy

- mocz

Cele diagnostyki enzymologicznej

• wykorzystanie enzymów - wskaźników schorzeń związanych z uszkodzeniem tkanek/narządów

• stwierdzenie defektów enzymatycznych

Oznaczenia enzymów wykonujemy w celu:

- rozpoznawania chorób

- monitorowania przebiegu chorób

- prognozowania (np. CK>600 U -> ok. 50% śmiertelności)

Podział enzymów w zależności od sposobu ich przedostawania się do przestrzeni pozakomórkowej

1. Enzymy komórkowe (wskaźnikowe) - uwalniane w wyniku uszkodzenia błony komórkowej lub rozpadu komórki

- mikrosomalne - GGT

- lizosomalne - ACP

- mitochondrialne - AST, CK, GLD

- cytoplazmatyczne - ALT, LDH, AST, CK

- błony plazmatyczne - ALP, 5'-NT, GGT

2. Enzymy sekrecyjne - wydzielane do krążenia, gdzie spełniają swoją funkcję

- czynniki krzepnięcia i fibrynolizy

- acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT)

- cholinesteraza ChE (pseudocholinesteraza)

3. Enzymy ekskrecyjne - produkowane przez gruczoły i wydzielane do śliny, światła przewodu pokarmowego, płynu nasiennego itp.

- amylaza

- lipaza

Stężenie enzymów w osoczu/surowicy - wypadkowa procesów:

• szybkości syntezy i sekrecji

• obrotu komórkowego

• aktywności mięśniowej

• uszkodzenia komórek

- fizycznego (oparzenia, zmiażdżenia)

- chemicznego (rozpuszczalniki organiczne,

detergenty, pestycydy, metale ciężkie)

- biologicznego (infekcje bakteryjne i wirusowe)

- wtórne (w wyniku choroby np. nowotworowej)

• eliminacji białek z łożyska naczyniowego

- mocz (białka niskocząsteczkowe)

- degradacja w komórkach

Enzymy w moczu

1. Enzymy występujące w osoczu, ale nie produkowane w nerce - niskocząsteczkowe enzymy trawienne np. amylaza

2. Enzymy nerkowe

- frakcja nerkowa fosfatazy alkalicznej

- N-acetylo-b-D-glukozaminidaza (NAG)

3. Enzymy występujące zarówno w osoczu jak i w nerce - ALT, AST, GGT, CK, ChE, LDH

10

---