TEMAT 8: Analiza mikrobiologiczna wody

Literatura uzupełniająca:

A. Grabińska-Łoniewska „Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej” str. 117 - 129

Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

• Wiedzieć, jakie są przyczyny skażenia wód i dlaczego kontrolujemy ich jakość mikrobiologiczną.

• Znać poszczególne organizmy wskaźnikowe wykorzystywane w analizie mikrobiologicznej wody i umieć scharakteryzować ich podstawowe cechy.

• Znać kryteria bakteriologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia w Polsce.

• Umieć oznaczyć liczebność organizmów wskaźnikowych w próbie wody i znać podstawowe pojęcia stosowane przy określaniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego wody (np. NPL)

Dlaczego kontrolujemy jakość sanitarną wody?

Możliwość zakażenia ludzi przez wodę zmusza do stałej kontroli higieniczno-sanitarnej, zarówno wody przeznaczonej do picia, jak też i wody w basenach kąpielowych, a nawet w zbiornikach wód powierzchniowych. Przyczyną zakażeń są mikroorganizmy chorobotwórcze wydalane przez ludzi chorych i nosicieli (osobnicy, którzy po przebyciu choroby wydalają zarazki jeszcze przez długi czas z kałem lub moczem). Zarazki występują w ściekach i w wodach powierzchniowych w znacznie mniejszych ilościach niż pozostałe drobnoustroje. Z tego też względu znacznie trudniej jest je wykryć niż występujące masowo w wodzie bakterie saprofityczne, tym bardziej, że w celu ich wykrycia konieczne jest stosowanie znacznie bardziej skomplikowanych metod diagnostycznych.

Co to są mikroorganizmy wskaźnikowe?

Obowiązujące normy oparte są na pośrednim wnioskowaniu o obecności mikroorganizmów chorobotwórczych na podstawie liczebności w wodzie bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych. Ich obecność w wodzie świadczy o jej zanieczyszczeniu fekalnym, a zatem również o niebezpieczeństwie zakażenia wody mikroorganizmami chorobotwórczymi.

Bakterie pełniące rolę wskaźników sanitarnych powinny spełniać następujące warunki:

• muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka, co pozwala zawsze na wykrycie kałowego zanieczyszczenia wody

• do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należeć także formy nie przetrwalnikujące, co umożliwia wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody

• ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod

• długość życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym musi być większa niż długość życia gatunków chorobotwórczych

• liczebność bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka i kale powinna być duża

• nie powinny się one rozmnażać w środowisku wodnym.

Jakie bakterie wskaźnikowe wykorzystywane są do oceny jakości zdrowotnej wody?

W rutynowej pracy laboratoriów, prowadzących nadzór sanitarno - epidemiologiczny, niemożliwe jest stałe badanie wody w kierunku wykrywania wszystkich drobnoustrojów chorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych, które mogą w niej występować. Dlatego też badania rutynowe koncentrują się przede wszystkim na wykrywaniu bakterii wskazujących na kałowe zanieczyszczenie wody. Do oceny jakości sanitarnej wody wykorzystywana jest mikroflora saprofityczna zasiedlająca jelito grube człowieka. Przyjęto następujące wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody:

• -Escherichia coli

• -bakterie grupy coli,

• -paciorkowce kałowe (Enterokoki),

• -laseczki z rodzaju Clostridium ( Clostridium perfringens), redukujące siarczyny

oraz w niektórych przypadkach

• gronkowce koagulazo-dodatnie

• Pseudomonas aeruginosa

• Legionella sp.

Pałeczka okrężnicy (Escherichia coli)

Fakultatywnie tlenowa, Gram-ujemna pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae. Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt stałocieplnych. W jelicie spełnia pożyteczną rolę, uczestnicząc w rozkładzie pokarmu, a także przyczyniając się do produkcji witamin z grupy B, C oraz K. E. coli spotyka się również w glebie i wodzie, gdzie trafiają z wydzielinami i kałem. Bakterie te, zwykle nieszkodliwe w jelicie, mogą jednak powodować groźne schorzenia przewodu pokarmowego, dróg moczowych, a ostatnio często dróg oddechowych.

Bakterie z grupy coli

Bakterie grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella. Wykrywane są one na podłożach z laktozą po inkubacji w temperaturze 37 ^oC.

Bakterie grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) to głównie szczepy Escherichia coli i tylko te nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają zdolność fermentacji laktozy w temperaturze 44 ^oC.

Obecność w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub bakterii grupy coli typu kałowego świadczy o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody kałem, ściekami, glebą lub gnijącym materiałem roślinnym. W zasadzie dla większości rodzajów wód zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu grup coli.

Paciorkowce kałowe

Paciorkowce kałowe to grupa bakterii kulistych lub owalnych, występujących w postaci komórek pojedynczych, dwoinek lub krótkich łańcuszków. Obejmuje ona drobnoustroje z rodzajów: Enterococcus i Streptococcus należące do grupy serologicznej Lancefield D, m. in. Streptococcus faecalis, S. faecium, S. equinus i S. bovis. Występują one powszechnie w kale ludzi i zwierząt. Stwierdzenie obecności paciorkowców kałowych w badanej próbie świadczy o jej kontakcie z zanieczyszczeniami typu kałowego, podobnie jak obecność bakterii grupy coli. Występowanie enterokoków w liczbie znacznie przewyższającej liczbę bakterii grupy coli, sugerować może zanieczyszczenie wody kałem zwierzęcym lub ściekami, pochodzącymi z ferm hodowlanych. Paciorkowce fekalne na ogół charakteryzuje dłuższa przeżywalność w wodzie oraz większa odporność na działanie chloru niż bakterie grupy coli.

Najważniejsze cechy charakterystyczne tej grupy bakterii to:

- zdolność wzrostu w temperaturze 45^oC, w obecności 40% żółci oraz obecności azydku sodowego;

- zdolność wzrostu w temperaturze 10^oC ( z wyjątkiem S. bovis i S. equinus) przy pH 9,6, w

obecności 6,5% chlorku sodowego;

- ujemny test na katalazę oraz barwienie dodatnie w metodzie Grama.

Laseczki z rodzaju Clostridium

O starym, odległym w czasie zanieczyszczeniu kałowym może świadczyć wykrycie w badanej próbce wody bakterii redukujących siarczyny (głównie szczepy Clostridium perfringens); ich przetrwalniki mogą zachować żywotność przez wiele lat w niesprzyjających warunkach. Clostridia redukujące siarczyny są też bardzo dobrym wskaźnikiem prawidłowości prowadzonych procesów uzdatniania wody, takich jak koagulacja, sedymentacja i filtracja. Przetrwalniki tych bakterii, a wraz z nimi również cysty pasożytniczych pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia) powinny być wyeliminowane właśnie w tych etapach uzdatniania wody, gdyż są one bardzo oporne na działanie środków dezynfekcyjnych. Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie znacznie bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i daje dużą pewność, że woda uzdatniona jest wolna od pierwotniaków i jaj robaków chorobotwórczych (helmintów).

Pseudomonas aeruginosa

Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej proponuje się obecnie dodatkowo wykrywanie bakterii z gatunku Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i na potrzeby gospodarcze a także w wodzie dla zakładów kąpielowych oraz w wodach powierzchniowych. Przedstawicieli tego gatunku wyizolowano z kału ludzkiego oraz w przypadkach zakażeń organizmu - z dróg moczowych, ucha środkowego, ropiejących ran itp. Bakterie te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i zwierząt. Poza tym występują one powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie. Warto także podkreślić, że mogą one bytować w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają się znaczną odpornością na zabiegi dezynfekcyjne.

Bakterie z rodzaju Legionella

Bakterie z rodzaju Legionella są to Gram ujemne pałeczki posiadające polarnie umieszczone wici w liczbie od 1 do 3. Do wzrostu potrzebują żelaza i cysteiny. Ich naturalnym rezerwuarem są wody śródlądowe i morskie. Licznie występują również w glebie i gorących źródłach wody. Wyizolowano do tej pory 46 gatunków z rodzaju Legionella, wśród których zidentyfikowano 70 grup serologicznych. Bakterie z rodzaju Legionella są wewnątrzkomórkowymi pasożytami pierwotniaków. Mogą również powodować nietypowe zapalenie płuc u ludzi, jak i gorączkę Pontiac. Szczególnie niebezpieczne dla człowieka są bakterie należące do gatunku Legionella pneumophila. Dostają się one do płuc w mikroaerozolach o średnicy 2,0 - 5,0 µm powstających np. w kabinach prysznicowych. Postaci płucnej legionellozy towarzyszy suchy kaszel, zaburzenia w oddychaniu, temperatura powyżej 40°C, zaburzenia świadomości. Śmiertelność wynosi 10-20% zachorowań. Rezerwuarem tych bakterii są systemy ciepłej wody i urządzenia wentylacyjne. Bakterie te mogą kolonizować wewnętrzne części rur z ciepłą wodą, zbiorniki na ciepłą wodę, wieże chłodnicze, perlatory zaworów czerpalnych (głowice natryskowe pryszniców).

Ogólna liczebność bakterii

W badaniach rutynowych określa się również ogólną liczbę bakterii, jako liczbę jednostek tworzących kolonie, w skrócie j.t.k.(odpowiednik angielski: cfu - colony forming units) obecnych w 1 ml wody, po wykonaniu posiewu próbki na agar odżywczy i inkubacji w temperaturach 22±2^oC przez 72 godz. (psychrofile), oraz w 36±2^oC przez 24 godz. (mezofile).

Ogólna liczebność bakterii psychrofilnych

W niższej temperaturze rosną przede wszystkim nie chorobotwórcze bakterie wodne. Należy jednak mieć na uwadze fakt, że Gram-ujemne bakterie wodne wytwarzają lipopolisachardy ściany komórkowej mogące działać toksycznie - tak jak endotoksyny bakterii chorobotwórczych. Z tego powodu ich liczba powinna być także monitorowana. Ponadnormatywny wzrost ich liczebności świadczyć może między innymi, o obecności w wodzie łatwo przyswajalnych związków organicznych. Teoretycznie, obecność w wodzie 0,1 mg węgla organicznego może spowodować wzrost liczby bakterii w 1 ml do 10⁸ j.t.k. (cfu). Również fosfor jest czynnikiem stymulującym wzrost drobnoustrojów. Dodanie niewielkiej ilości tego pierwiastka (<50mg/l) powoduje nawet 10-krotne przyspieszanie rozwoju bakterii w wodociągach.

Ogólna liczebność bakterii mezofilnych

Ze względów zdrowotnych, bardziej niebezpieczna jest ponadnormatywna liczba bakterii rosnących w temperaturze 37^oC, ponieważ mogą wśród nich być również bakterie chorobotwórcze. Duża ich liczba w badanej próbce wody, może świadczyć, między innymi, o źle przebiegających procesach uzdatniania lub zasysaniu zanieczyszczonej wody.

Co może być powodem zwiększenia ogólnej liczby bakterii w wodzie?

Zwiększenie ogólnej liczby bakterii obecnych w próbce wody może świadczyć o namnażaniu się drobnoustrojów na wewnętrznych powierzchniach instalacji wodnych, szczególnie na złączach rur i uszczelkach oraz tworzeniu się warstwy tzw. biofilmu. Przekroczenie dopuszczanego poziomu ogólnej liczby bakterii powinno być zawsze sygnałem do znalezienia przyczyny zanieczyszczenia i do podjęcia odpowiedniego postępowania. Niekiedy może istnieć konieczność dodatkowego chlorowania, np. wody do picia, powyżej 0,2 mg Cl₂/l. W niektórych przypadkach dopiero zmiany konstrukcyjne sieci wodociągowej i usunięcie biofilmu są w stanie skutecznie zabezpieczyć odbiorcę przed wzrostem liczebności drobnoustrojów w wodzie.

Kryteria jakości sanitarnej wody do picia w Polsce.

Jakość bakteriologiczna wody do picia w Polsce oceniana jest na podstawie liczebności dwóch grup bakterii wskaźnikowych: Escherichia coli i enterokoków (tabela 1). Dodatkowo dokonuje się analizy bakterii z grupy coli oraz klostridiów redukujących siarczyny (tabela 2).Według stosowanych w Polsce kryteriów w 100 ml wody podawanej do sieci wodociągowej nie może być ani jednej komórki bakterii uznanych za wskaźnikowe. Podobne normy jakości wody obowiązują w Unii Europejskiej. Dodatkowym ważnym kryterium jakości wody do picia jest także ogólna liczebność bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml wody. Według stosowanych w Polsce kryteriów w wodzie do spożycia przez ludzi liczebność bakterii psychrofilnych nie powinna przekraczać 100 komórek w 1ml, natomiast bakterii mezofilnych 50 komórek w 1 ml wody (tabela 2).

Osobne wymagania dotyczą wód wprowadzanych do jednostkowych opakowań (tabela 3) oraz wód w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego (tabela 4). Jakość wody ciepłej ocenia się na podstawie liczebności bakterii z rodzaju Legionella (tabela 5).

Tabela 1. Podstawowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Escherichia coli	0	100
2	Enterokoki	0	100

Tabela 2. Dodatkowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Bakterie grupy coli	0	100
4	Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2^oC po 48 h	50	1
	Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2^oC po 72 h	100	1
5	Clostridium perfringens	0	100

Tabela 3. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda wprowadzana do

opakowań jednostkowych.

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Escherichia coli	0	250
2	Enterokoki	0	250
3	Pseudomonas aeruginosa	0	250
4	Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2^oC po 48 h	20	1
5	Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2^oC po 72 h	100	1

Tabela 4. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego.

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody pobranej
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Escherichia coli	0	100
2	Enterokoki	0	100
3	Pseudomonas aeruginosa	0	100
4	Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2^oC po 48 h	100	1

Tabela 5. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać ciepła woda użytkowa

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Legionella sp.	<100	100

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Zadanie1. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych (FM)

Metodę tę stosuje się do wykrywania bakterii grupy coli w wodzie wodociągowej uzdatnionej i nieuzdatnionej. Metody nie należy stosować do oznaczania liczby bakterii coli w wodach powierzchniowych o mętności wyższej niż 20 mg SiO₂/dm³, przy równocześnie niskiej liczbie bakterii grupy coli, tj. poniżej 10 kolonii w 100 cm³ wody, a wysokiej liczbie (powyżej 100 komórek/cm³) bakterii wodnych mogących rozwinąć się również na zastosowanym podłożu. Metoda ta nie nadaje się do oznaczania liczby bakteri coli w ściekach. W tych przypadkach należy wykonać oznaczenia metodą fermentacyjno-probówkową (FP).

Zasada metody:

Oznaczanie liczby bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych przez określenie tzw. wskaźnika coli jako wyniku ostatecznego polega na przesączeniu przez filtr membranowy odpowiednio dobranej objętości próbki wody. Bakterie zatrzymane na filtrze umieszczonym następnie na pożywce wybiórczej dyfundującej przez pory filtru, rozwijają się w czasie inkubacji, tworząc kolonie o typowym wyglądzie. Założono, że z jednej komórki bakteryjnej rozwija się jedna kolonia. Przez obliczenie typowych kolonii bakterii należących do grupy coli określa się następnie wskaźnik coli jako liczbę komórek bakterii grupy coli w 100 cm³ próbki wody.

Objętość próbki nie powinna być mniejsza niż 250 cm³. Przed użyciem aparat filtracyjny należy wysterylizować w autoklawie w temp. 120^oC przez 15 min. Filtry membranowe (o średnicy ok. 50 mm i przeciętnej średnicy porów 0,45 μm) wysterylizować w przez dwukrotne wygotowanie w wodzie destylowanej, każdorazowo zmienianej - w ciągu 20 min.

Sposób postępowania:

1. Zmontować aparat filtracyjny. W tym celu lejek umieścić w kolbie ssawkowej, połączonej z pompą

próżniową. Przy zamkniętym kranie aparatu nałożyć pincetą (wyjałowioną przez opalanie) filtr

membranowy na porowatą płytkę, błyszczącą względnie kratkowaną stroną do góry,

2. Wlać odpowiednią ilość badanej wody do lejka, otworzyć kran i przefiltrować próbkę. Objetość próbki

użytej do filtracji powinna wynosić odpowiednio:

- dla wody wodociągowej - 200 cm³;

-dla wody powierzchniowej i wody z basenu kąpielowego - 1 i 0,1 cm³;

Całkowita objętość filtrowanej wody nie powinna być mniejsza niż 20 cm³.

3. Po przefiltrowaniu, ściany lejka spłukać dokładnie jałową wodą buforowaną;

4. Zamknąć kran i wyjałowioną pincetą przenieść filtr membranowy na powierzchnię podłoża agarowego

Endo FM. Filtr powinien być położony do góry zawiesiną bakteryjną tak, aby nie było pęcherzyków

powietrza pomiędzy filtrem a podłożem;

5. Płytki Petriego z filtrami umieścić w cieplarce dnem ku górze i inkubować w temp. 37^oC w ciągu 20

godz. Okres inkubacji należy przedłużyć do 48 godz. w przypadku braku wzrostu po 20 godzinach

lub wzrostu nielicznych, nietypowych kolonii.

6. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie typowe, tj. ciemnoczerwone z metalicznym, połyskiem

(tzw. połysk fuksynowy).

Do liczenia należy wybrać filtry, na których jest od 20 do 80 kolonii typowych, a ogólna liczba kolonii nie przekracza 200. Jeśli po 20 godz. nie stwierdza się obecności typowych kolonii, natomiast wyrosły kolonie czerwone, różowe z ciemnym środkiem i różowe, należy przeprowadzić badanie potwierdzające. Badania te należy również zastosować przy pojawieniu się kolonii z metalicznym połyskiem po przedłużonym okresie inkubacji. W tym celu od 3-6 kolonii z filtrów należy przeszczepić na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolowąi inkubować w temp. 37^oC w ciągu 24-48 godz. Pojawienie się gazu w rurce Durhama oraz zmiana zabarwienia podłoża na żółte świadczy o dodatnim wyniku badania potwierdzającego. W przypadku ujemnego wyniku na podłożu laktozowym, należy przeprowadzić badanie potwierdzające, jak w etapie II metody fermentacyjno-probówkowej (FP).

Zadanie 2. Oznaczanie Escherichia coli (bakterii grupy coli typu kałowego)

metodą filtrów membranowych (FM)

Badanie wstępne wykonać zgodnie z metodyką podaną przy oznaczaniu bakterii grupy coli (zadanie 1). Inkubację hodowli na podłożu agarowym Endo FM prowadzić w temp. 44^oC przez 24 godz.;

W razie konieczności wykonania badania potwierdzającego, materiał z kolonii należy wyizolować na skos agarowy, a nastepnie wykonac barwienie metodą Grama oraz sprawdzić zdolność do wytwarzania oksydazy cytochromowej i fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu na pożywce ze wskaźnikiem Andrade lub na pożywce z zielenią brylantową w temp.44^oC w ciągu 24 godz.

Obliczanie wyniku oznaczania

Wynik badania należy podać w jednostkach tworzących kolonie (jtk)/ 100 cm³ (wskaźnik coli)

korzystając ze wzoru:

X = a x 100/V

gdzie: X - wskaźnik coli,

a - liczba typowych kolonii,

V - objętość filtrowanej wody [cm³].

Ostateczny wynik stanowi średnią arytmetyczną, z co najmniej dwóch filtracji różnych objętości wody. Na podstawie wartości wskaźnika można obliczyć miano coli lub miano coli typu kałowego

(E. coli) wg wzoru:

miano coli = 100/X

gdzie: X - wskaźnik coli

Zadanie 3. Oznaczanie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis)

metodą filtrów membranowych (FM)

Metodę FM do oznaczania paciorkowców kałowych stosuje się do wszystkich wód, z wyjątkiem wód o dużej zawartości zawiesiny.

Oznaczenie paciorkowców kałowych polega na przesączeniu określonej objętości próbki przez filtr membranowy i przeniesieniu filtru z bakteriami na pożywkę Slanetza i Bartleya (SB) z azydkiem sodu. Paciorkowce rozwijają się na tej pożywce tworząc charakterystyczne kolonie zabarwione na kolor czerwony i różowy;

Postępowanie:

1. Przefiltrować wodę jakw zadaniu 1 i 2

2. Po filtracji (warunki sterylne), jałową pincetą przenieśc filtr membranowy na pożywkę SB

i wstawić do cieplarki o temperaturze 37^oC na 48 h

3. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Ze względu na niewielkie rozmiary kolonii (0,2 do 1 mm

średnicy), zaleca się liczyć je pod lupą. Liczba wyrosłych kolonii nie powinna być większa niż 100

i nie mniejsza niż 20, dlatego zaleca się wykonanie rozcieńczeń badanej próbki.

Obliczanie wyniku oznaczania:

liczbę paciorkowców kałowych (X) obliczyć wg wzoru:

X = a x 100/V

a - liczba typowych kolonii na pożywce SB,

V - objętość filtrowanej wody [cm³]

Wynik należy podać jako jtk /100 cm³ próbki

Zadanie 4. Oznaczanie liczby bakterii psychrofilnych i mezofilnych

1. Oznaczanie wykonać metodą płytkową Kocha, stosując posiew wgłębny na podłoże agarowe odżywcze. Posiewy wody wodociągowej wykonać z prób nierozcieńczonych (1 cm³) oraz z rozcieńczenia 10^-1 (1 cm³);

2. Inkubację bakterii psychrofilnych prowadzić w temp. 20^oC w ciągu 72 godzin, a mezofilnych - w temp. 37^oC przez 24 h;

3. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Do określenia liczby kolonii, przy posiewie wody powierzchniowej i ścieków, wybrać płytki,na których wyrosło od 30 - 300 kolonii. W przypadku, gdy liczba kolonii wyrosłych na płytce jest większa niż 300 oznaczenie należy wykonać ponownie. Licząc kolonie z próby rozcieńczonej, należy liczbę koloni pomnożyć przez krotność rozcieńczenia;

4. Wynik oznaczenia podać jako jtk/1 cm³

Zadanie 5. Oznaczanie NPL i miana bakterii z grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową (FP)

Określenia:

• bakterie grupy coli - Gram - ujemne pałeczki nie wytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach wzglądnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 37^oC. Należą one do rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enetrobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae;

• najbardziej prawdopodobna liczba bakterii grupy coli (NPL) - liczba bakterii grupy coli w 100 cm³ badanej próbki wody lub ścieków określona (z tablic) na podstawie rachunku prawdopodobieństwa;

• miano coli - najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków, wyrażona w cm³, w której stwierdza się jeszcze obecność bakterii grupy coli;

• wynik dodatni fałszywy - wytworzenie kwasu i gazu w pożywce płynnej z laktozą na drodze fermentacji laktozy, wywołanej przez bakterie nie należące do grupy coli (ani do Enterobacteriaceae), mianowicie przez Gram - dodatnie, wytwarzające prztrwalniki laseczki z rodzaju Bacillus lub przez Gram - ujemne, niewytwarzające przetrwalników pałeczki rodzaju Aeromonas, lub w rezultacie synergizmu bakteryjnego.

Wykrywanie bakterii grupy coli matodą fermentacyjno - probówkową (FP) oparte jest na zdolności tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz widocznego gazu.

Metoda obejmuje badanie wtępne, w którym na podstawie wytworzonego w podłożu kwasu i gazu w ciagu 24 h lub 48 h inkubacji w temperaturze 37^oC, wnioskuje się o obecności bakterii z grupy coli (dodatni wynik badania wstępnego) oraz badania potwierdzające, mające na celu wykluczenie fałszywych dodatnich wyników badania wstępnego przez stwierdzenie, że bakterie fermentujące laktozę w badaniu wstępnym rzeczywiście należą do grupy coli. Po wykonaniu badania określa się ostateczny wynik w postaci najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) bakterii grupy coli w 100 cm³ próbki lub miana coli korzystając ze specjalnych tablic statystycznych.

Etap I - Badanie wstępne.

Polega ono na posiewie na podłoże płynne z laktozą i purpurą bromokrezolową (podłoże LPB, podłoże Eijkamana) i inkubacji w temperaturze 37^oC przez 48 h. Przed posiewem należy sprawdzić probówki (butelki) z pożywką i odrzucić te, w których stwierdza się obecność pęcherzyka powietrza w probówce Durhama. Wszystkie naczynia z pożywką należy odpowiednio oznakować, podając nr. probówki, datę i ewentualną posiewaną objętość próbki.

Objętość posiewanej próbki uzależniona jest od jej rodzaju, celu badania i wymagań sanitarnych.

Tabela 6. System posiewu próbek wody

Dopuszczalna liczba bakterii grupy coli w 100 cm^3 próbki (NPL)	Objętość posiewanej wody
1 2 10	1 x 50 cm^3i 5 x 10 cm^3 5 x 10 cm^3, 1 x 1 cm^3, 1 x 0,1 cm^3 2 x 10 cm^3, 2 x 1 cm^3, 2 x 0,1 cm^3

W przypadku spodziewanego większego zanieczyszczenia wody, należy dodatkowo posiać odpowiednio mniejsze jej objętości, niż w podanym zestawieniu.

Z uwagi na powyższe zależności, należy zastosować następujący sysytem posiewów (tab.7):

Tabela 7. System posiewu próbek wody

Rodzaj próbki	System posiewów
woda z wodociągów sieciowych dezynfekowana	1 x 50 cm^3, 5 x 10 cm^3
woda z wodociągów sieciowych nie dezynfekowana, woda z basenu kąpielowego	5 x 10 cm^3, 1 x 1 cm^3, 1 x 0,1 cm^3 (rozc. 10^-1)
woda z urządzeń na potrzeby własne	2 x 10 cm^3, 2 x 1 cm^3, 2 x 0,1 cm^3
woda powierzchniowa i ścieki po biologicznym oczyszczaniu	2 x 0,1 cm^3 - 0,0001 cm^3 (rozc. 10^-1 - 10^-4)

• posiewy 10 i 50 cm³ nie rozcieńczonej próbki wody należy wykonać na podłoże LPB o stężeniu podwójnym, wszystkie inne objętości, tj. 1 cm³ oraz po 1 cm³ z rozcieńczeń od 10^-1 do 10^-4 - na podłoże o stężeniu normalnym;

• posiane próbki inkubować w temp. 37^oC w ciągu 24-48 h;

• za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama lub występowanie pęcherzyków gazu w podłożu, przy lekkim wstrząsaniu, oraz zmętnienie i zmianę barwy z fioletowej na żółtą. Zmiany te wskazują na wzrost bakterii i fermentację laktozy z wytworzniem kwasu i gazu. Jeśli po 18 - 24 h hodowli nie występują zmiany dodatnie próbki, inkubować dalej i wyniki odczytać ponownie po 48 h. Brak gazu i zakwaszenia po 48 h inkubacji przyjmuje się jako wynik ujemny. Obećność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub jego braku, uznaje się za wątpliwy, wymagający dalszego potwierdzenia.

Etap II - Badanie potwierdzające

Badanie to wykonuje się w celu potwierdzenia obecności bakterii grupy coli, w zasadzie z wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego, uzyskanych po 24 lub 48 h. Badania potwierdzające mają także na celu wykluczenie tzw. wyników dodatnich fałszywych.

Badania potwierdzające obecność bakterii grupy coli wykonuje się na pożywce Endo.

1. Posiać metodą powierzchniową za pomocą ezy niewielką ilość zawiesiny z 24- lub 48-

godzinnej hodowli bakterii na podłożu (LPB) na podsuszone podłoże Endo;

2. Inkubować hodowlę w temp. 37^oC w ciągu 24 h;

Za wynik dodatni przyjmuje się wzrost koloni gładkich, ciemnoczerwonych z charakterystycznym metalicznym połyskiem (fuksynowym). W podłożu Endo, w obecności siarczynu sodu, laktoza i fuksyna tworzą leukozwiązek. W wyniku wzrostu bakterii wykorzystujących laktozę następuje uwalnianie fuksyny do podłoża, która barwi charakterystycznie bakterie wystepujące w kolonii. W przypadku obecności choćby jednej takiej kolonii, wynik badania potwierdzającego należy uznać za dodatni. Niektóre szczepy bakterii grupy coli rosną na podłożu Endo w postaci gładkich, jasno- lub ciemnoróżowych koloni bez charakterystycznego połysku. Są to kolonie nietypowe. Obecność na płytce wyłącznie kolonii nietypowych uznaje się za wynik wątpliwy, wymagający uzupełniającego badania potwierdzającego. Wzrost innych kolonii uznaje się za wynik ujemny.

Etap III - Badanie uzupełnijące

Jest to dalszy etap badania potwierdzającego i stosuje się je w przypadku, gdy na pożywce Endo wyrosną nietypowe bakterie, podejrzane o przynależność do grupy coli. Badania obejmują:

• określenie zdolności wyizolowanego szczepu do fermentacji laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu (tzw. wtórna fermentacja laktozy);

• wykonanie barwienia metodą Grama;

• obserwacje mikroskopowe;

• wykonanie testu na obecność oksydazy cytochromowej.

W celu wykonania badań uzupełniających należy:

1. Wybrać z hodowli na podłożu Endo kilka kolonii nietypowych i każdą posiać na podłoże

laktozowe ze wskaźnikiem Andrade i na powierzchnię skosu z podłoża agarowego (MPA).

2. Hodowle inkubować w temp. 37^oC w ciągu 24-48 h;

Za wynik dodatni fermentacji laktozy przyjmuje się zakwaszenie podłoża obrazowane zabarwieniem różowym i obecność gazu w rurkach Durhama. Brak tych zmian jest wynikiem ujemnym badań uzupełniających;

• barwienie metodą Grama wykonać zgodnie z metodyką, z 24-godzinnych hodowli bakterii na skosie agarowym. Za wynik dodatni przyjąć obecność w preparacie pałeczek Gram (-);

• test na obecność oksydazy cytochromowej wykonać z zastosowaniem 24-godzinnej hodowli bakterii na skosie agarowym, według metodyki. Za wynik dodatni testu przyjąć brak oksydazy cytochromowej.

Oliczanie NPL wg. tablicy statystycznej (będzie dostępna na ćwiczeniach, są też zamieszczone np. w Ćwiczeniach laboratoryjnych z mikrobiologii ogólnej A. Grabińskiej-Łoniewskiej).

W przypadku posiewania mniejszych objętości próbki niż podano w tej tablicy, z posianych objętości wybiera się trzy objętości stanowiące podstawę dla obliczenia NPL (przy zastosowaniu dwuprobówkowego systemu posiewów). Przy obliczaniu wartości NPL stosuje się następujące zasady:

• jeśli zamiast 10, 1 i 0,1 cm³ posiewa się 1, 0,1 i 0,01 cm³, otrzymany wynik z tabeli należy zwiekszyć dziesięciokrotnie;

• jeśli zamiast 10 i 0,1 cm³ posiewa się 0,1, 0,01 i 0,001 cm³, wynik należy zwiększyć

stukrotnie, itd.;

• jeżeli posiewa się więcej niż trzy różne objętości próbki w rozcieńczeniach dziesięciokrotnych (np. wody powierzchniowe, ścieki), tylko wyniki z trzech wybranych objętości stanowią podstawę do obliczenia NPL.

• wybór odpowiednich objętości opiera się na zasadzie : jako pierwszą najwiekszą objętość, należy wybrać taką, w której występują tylko wyniki dodatnie przeprowadzonego badania i powyżej której również występuja wyniki dodatnie, pozostałe dwie objętości, to dwa następne, kolejne rozcieńczenia próbki;

• do określenia miana coli w przypadku posiewania wiecej niż trzech objętości próbki lub mniejszych objętości niż podano w tabeli, należy posługiwać się również tą samą tablicą w sposób analogiczny jak przy określaniu NPL z tym, że wyniki miana otrzymane z tabeli należy zmniejszyć, np. jeśli zamiast 10, 1 i 0,1 cm³, posiewa się 1, 0,1 i 0,001 cm³, odczytaną wartość miana należy dziesięciokrotnie zmniejszyć.

Zadanie 6. Oznaczenie NPL i miana Escherichia coli (bakterii grupy coli typu kałowego)

metodą fermentacyjno probówkową (FP)

Metodę fermentacyjno probówkową oznaczenia bakterii grupy coli typu kałowego (fekalnego) stosuje się do badania każdego rodzaju wody i ścieków w przypadku, gdy zachodzi potrzeba stwierdzenia świeżego kałowego (ściekowego) zanieczyszczenia. Metoda ma szczególne zastosowanie do badań wód mętnych o małej liczbie poszukiwanych bakterii oraz chlorowanych ścieków.

Bakterie grupy coli typu kałowego (fekalnego) są to bakterie z grupy coli, które poza wszystkimi właściwościami tej grupy (pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, nie wytwarzające przetrwalników, względnie beztlenowe, fermentujące laktozę w zasadzie z wytworzeniem kwasu i gazu w temp.37^oC w ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na pożywce Endo), mają ponadto zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów biochemicznych, a wszczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu również w temperaturze 44^oC.

Większość tych bakterii w wodach i ściekach to Escherichia coli (E. coli) występująca praktycznie zawsze w kale ludzkim przekraczając znacznie liczbę innych bakterii grupy coli. Dzięki temu E.coli uważana jest za typowo kałowy gatunek baketrii grupy coli.

E. coli poza właściwościami bakterii grupy coli typu kałowego ma ponadto zdolność do: wytwarzania indolu w wodzie peptonowej z tryptofanem (I), daje pozytywną reakcję z czerwienią metylową na podłożu wg Clarka (M.), nie wytwarza acetylometylokarbinolu z glukozy na podłożu wg Clarka (V) oraz nie ma zdolności wzrostu na podłożu wg Simmonsa, zawierającym cytrynian sodowy jako jedyne organiczne źródło węgla (C). Wymienione cztery cechy określa się testami biochemicznymi, znanymi jako tzw. szereg IMVC, służącymi do identyfikacji E.coli.

Zasada metody:

Wykrywanie bakterii grupy coli typu kałowego metodą fermentacyjno-probówkową (FP) oparte jest na zdolności tych bakterii fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w temp. 44^oC. Metoda ta obejmuje badanie wstępne, w którym na podstawie wytworzonego w pożywce namnażającej kwasu i gazu w temp. 37^oC w ciągu 24-48 h wnioskuje się o obecności bakterii grupy coli oraz badanie potwierdzające, które ma na celu stwierdzenie, czy bakterie fermentujące laktozę w badaniu wstępnym należą do grupy coli typu kałowego.

W przypadku konieczności zidentyfikowania tych bakterii jako E.coli, należy wykonać dodatkowo badania wg szeregu IMViC lub zastosować szybki test w temp. 44^oC.

Etap I - Badania wstępne - Badania przeprowadza się, jak w przypadku bakterii grupy coli

Etap II - Badania potwierdzające - Badaniu potwierdzającemu poddaje się materiał pochodzący ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli z badania wstępnego, przy oznaczaniu bakterii z grupy coli metodą FP. W tym celu należy:

• zawiesinę bakterii z hodowli na podłożu LPB przenieść ezą na podłoże laktozowe z zielenią brylantową i inkubować w temp. 44^oC w ciągu 18-24 h;

• za wynik dodatni przyjmuje się zmętnienie podłoża oraz obecność gazu w rurkach Durhama lub w całej objętości podłoża przy lekkim wstrząśnięciu. Równolegle z badaniami potwierdzającymi na pożywce z zielenią brylantową w temp. 44^oC, wskazane jest przeprowadzenie badania potwierdzającego na podłożu Endo, jak podano w metodyce oznaczania bakterii grupy coli metodą FP.

Etap III - Badania identyfikujące Escherichia coli. Identyfikację Escherichia coli przeprowadzać można dwiema metodami: metodą szeregu IMViC oraz tzw. testu szybkiego.

Metoda szeregu IMViC. Materiał z próbek dodatnich uzyskanych po hodowli bakterii na podłożu z laktozą i z zielenią brylantową przenieść na podłoże Endo. Wyrosłe na podłożu Endo pojedyncze typowe kolonie poddaje się identyfiakcji wg szeregu IMViC, w którym oznacza się zdolność do:

• wytwarzania indolu z tryptofanu na podłożu z wodą peptonową z tryptofanem (I);

• rozkładu glukozy do kwasu (reakcja z czerwienią metylową) na podłożu wg Clarka (M);

• wytwarzania acetylometylokarbinolu z glukozy (reakcja Voges-Proskauera) na podłożu wg Clarka (VP);

• wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla na podłożu Simmonsa (C);

Wytwarzanie indolu - sprawdza się po 24 h inkubacji, dodając do hodowli, po ściance probówki, kilka kropli odczynnika Ehrlicha lub odczynnika Kovacsa. Pojawienie się po chwili czerwonego zabarwienia na granicy płynów świadczy o obecności indolu, co określa się jako wynik dodatni (+);

Reakcja z czerwienią metylową - wykonuje się dodając do 3-4-dniowej hodowli na podłożu Clarka, 2 krople czerwieni metylowej. Wystąpienie wyraźnie czerwonej barwy wskazuje na zakwaszenie pożywki i świadczy o dodatnim wyniku tej reakcji (+). Kolor żółty określa się jako wynik ujemny (-), kolor pomarańczowy lub bardzo jasnoczerwony - jako wynik wątpliwy (?);

Reakcja Voges-Proskauera stwierdzająca obecność acetylometylokarbinolu (V) - wykonuje się po 24 h hodowania, dodając do hodowli 0,6 cm³ r-ru α-naftolu i po dokładnym wymieszaniu 0,4 cm³ r-ru wodorotlenku potasowego. Zawartość probówki miesza się ponownie i wstawia do termostatu o temp. 37^oC na 30-45 min. Wystąpienie po tym czasie intensywnego różowego lub czerwonego zabarwienia w górnej części płynu oznacza wynik dodatni (+), tzn. że w pożywce obecny jest acetylometylokarbinol. W przypadku wyniku ujemnego (-), pożywka nie zmienia barwy lub daje lekko różowe zabarwienie;

Zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla (C ) na podłożu Simmonsa przy hodowli w temp. 44^oC w ciągu 72 h, brak zabarwienia określa się jako wynik ujemny (-), charakterystyczny dla E. coli. Wzrost innych pałeczek z grupy coli powoduje alkalizacje podłoża i zmianę jej zabarwienia z zielonej na niebieską, co określa się jako wynik dodatni (+).

Typowe szczepy E.coli charakteryzują się następującymi wynikami szeregu IMViC: ++--;

wyjątkjowo zdarzają się indoloujemne szczepy E.coli i wtedy wynik szeregu IMViC przedstawia się następująco: -+--. Według szeregu IMViC identyfikuje się w sposób pewny tylko te bakterie z grupy coli, które fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w 44^oC.

Metoda tzw. testu szybkiego

• materiał z każdej dodatniej i wątpliwej hodowli na podłożu LPB posiać na podłoże z zielenią brylantową i na wodę peptonową z tryptofanem;

• próbki inkubować w temp. 44^oC przez 24 h. Wyniki dodatnie obu reakcji, z dużym prawdopodobieństwem, świadczą o obecności E.coli, ponieważ są one w zasadzie jedynymi bakteriami z rodziny Enterobacteriaceae, które fermentują laktozę z wytworzeniem gazu i wytwarzają indol w temp. 44^oC.

Wynik oznaczenia bakterii z grupy coli podać jako NPL w 100 cm³ i miano bakterii grupy coli i bakterii coli typu kałowego (Escherichia coli). Wyniki należy podawać w natępujący sposób:

NPL bakterii gupy coli w 100 cm³.

Ćwiczenie 7. Oznaczanie beztlenowych bakterii przetrwalnikujących redukujących siarczyny

(Clostridium) metodą hodowli na pożywce płynnej

Metodę stosuje się do wykrywania bakterii beztlenowych przetrwalnikujących, redukujących siarczyny (Clostridium) w wodzie i ściekach. Bakterie przetrwalnikujące, redukujące siarczyny należą do rodziny Bacillaceae, rodzaju Clostridium. Rozwijają się w warunkach beztlenowych i są Gram-dodatnie. Na ogół bakterie z tej grupy powszechnie występują w glebie, wodzie, ściekach, kale ludzkim i niektórych zwierząt. Dzięki zdolności wytwarzania przetrwalników są oporne na działanie chloru i innych związków dezynfekcyjnych.

Metoda polega na posianiu odpowiedniej objętości próbki wody lub ścieków na pożywkę płynną (np. 1x 50 cm³ i 5x10 cm³). W wyniku wytrącającego się siarczku żelaza pod wpływem rozwijających się bakterii pożywka barwi się na kolor od szarego do smolistoczarnego.

Wykonanie:

1. Przed przystąpieniem do oznaczenia należy zniszczyć obecne w probówce formy wegetatywne bakterii. W tym celu należy próbki z pożywką należy ogrzać do temperatury 80^oC w łaźni wodnej i przetrzymać w tej temperaturze ok.20 min., licząc czas od osiągnięcia tej temperatury w próbce.

2. Po tym czasie próbkę należy ochłodzić i dodać w sposób jałowy odpowiednią ilość cyrynianu żelazowego i roztworu siarczynu sodu. W celu odcięcia dostępu powietrza do pożywki dodać odpowiednią objętość jałowej płynnej parafiny, aby tworzyła nad pożywką ok. 1,5 - centymetrową warstwę;

3. Posiane próbki inkubować w cieplarce, w temperaturze 37^oC przez 24-48 h;

Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące, redukujące siarczyny, rozwijające się pożywce zmieniają jej barwę od szarej do czarnej. Wszystkie próbki o zmienionej barwie pożywki od szarej do czarnej należy uznać za dodatnie.

Wyniki należy podać w postaci NPL beztlenowych przetrwalnikujących bakterii redukujących siarczyny (Clostridium).

Dopuszcza się pojedyncze bakterie wykrywane sporadycznie

Należy badać w wodzie pochodzącej z ujęć powierzchniowych i mieszanych, a w przypadku przekroczenia dopuszczalnych wartości, należy zbadać czy nie ma zagrożenia zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności innych mikroorganizmów chorobotwórczych, np. Cryptosporidium.

Należy badać w ciepłej wodzie w budynkach zamieszkania zbiorowego i zakładach opieki zdrowotnej zamkniętej

---