1. Wyjasnij na czym polega fermentacja beztlenowa i tlenowa.

1.fermentacja beztlenowa (własciwa); glikoliza+redukcj proces biologiczny rozkładu substancji organicznych przeprowadzany przez drobnoustroje w warunkach beztlenowych . glikoliza+redukcja

• Fermentacja alkoholowa:

Sacharomyces cervisiae

Glukoza → C2H5OH+2CO2+21kcal (2ATP)

• Fermentacja mlekowa:

Streptococcus,Lactobacillus

Glukoza → 2CH3CHOH-COOH +22kcal (2ATP)

2.Fermentacja tlenowa (niepełne utlenianie)

• Fermentacja octowa:

Clostridium eceticum,Acetobacter

C2H5OH+02 → CH3COOH +H2O+ 118kcal

2. Opisz biotechnologiczne otrzymywanie dekstranu

• Etap 1 Otrzymywanie surowego dekstranu

Metoda I - fermentacja

- 1etap - hodowla Leconostoc mesenteroides w podłożu 10-20% sacharozy,

ekstraktów z drożdży, zarodki zbożowe temp.23-25 °C, pH 5-6, 1-2 doby, namnażanie komórek, synteza enzymu - dekstranosacharozy

- 2 etap - wydzielony roztwór stosuje się w roztworze sacharozy

wytrącanie metanolem, etanolem lub acetonem

• Etap 2 Otrzymywanie dekstranu o pożądanej wielkości cząsteczek

- hydroliza kwasowa: roztwór wodny surowego dekstranu 5-8%, temperatura

80-100 °C, pH 2, czas odpowiednio dobrany

- hydroliza enzymatyczna: roztwór surowego dekstranu temp. 45-50 °C, pH 5-6,

enzym dekstranaza(wytwarzana przez Penicilinum funiculosum, Penicilinum

liliacinim, Aspergillus verti), czas 2 godziny

3. Wyjasnij pojecia - trofofaza i idiofaza na wybranym przykładzie.

TROFOFAZA= I FAZA= faza intensywnego wzrostu biomasy

IDIOFAZA=II FAZA= faza produkcji (tworzenia idiodlitu) zależnosć miedzy wzrostem masy z tworzeniem produktu:

4. Opisz otrzymywanie biokatalizatorow immobilizowanych.

1.adsorpcja na nosniku

2.związanie z nośnikiem wiązaniami kowalencyjnymi

3.zamnkniecie enzymu na nośniku żelowym

4.mikrokapsułkowanie

5.sieciowanie cząsteczek enzymu

5. Podaj przykłady zastosowania biokatalizatorów immobilizowanych.

1.enzymy immobilizowane:

• acylaza-do produkcji penicylin i cefalosporyn półsyntetycznych

• L-aminocylaza-produkcja L-aminokwasów

• Galaktozydaza-usuwanie laktozy z mleka

• Izomeraza glukozowa-produkcja fruktozy

2. komórki immobilizowane:

• Gluconobacter-produkcja wit.C

• E.coli-produkcja kw. Asparaginowego

• Acetobacter -produkcja kw. Octowego

6. Opisz otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych metodą hybrydoma.

Pobranie od myszy antygenu

↓

limfocyty śledziony myszy + kom.szpiczakowe (rakowe)-dobra

produkują p/ciała - słaba zdolność namnażania zdolnosc

namnażania

↓

fuzja limfocytów z kom szpiczakowymi

↓

hybrydy

↓

hybrydy rozwijają się jako indywidualne kolonie

↓

selekcja hybryd produkujących swoiste przeciwciała (klonowanie)

↓

wyselekcjonowane hybrydy namnażane w kulturze na duzą skale

7. Opisz różnice między przeciwciałami zwierzęcymi (mysimi), chimerycznymi i humanizowanymi

• P/mysie= 100% mysie, stosowane do celów diagnostycznych i do oczyszczania leków: t o,5=30-40h w osoczu

• P/chimeryczne=mysi region zmienny (Fr), ludzki region stały (Fc) , 25% mysie ; t0,5=200-250h w osoczu

• P/humanizowane=ludzkie z wyjątkiem mysich regionów hiperzmiennych (CDR) , które decydują o specyficzności antygenowej , to,5=14-21 dni

8. Opisz sposoby otrzymywania protoplastów bakteryjnych , grzybowych i roślinnych

PROTOPLAST-kom. pozbawiona ściany komórkowej , otoczona błoną plazmatyczną

1.rozpuszczenie ściany komórkowej:

• bakterie (G+) = lizozym

(G-) = lizozym , EDTA , warunki jonowe

• grzyby = sok żołądkowy ślimaka

• rośliny = enzymy celulolityczne i pektynolityczne

2.oddzielenie przez wirowaniw i sączenie

9. Wymień systemy ekspresyjne stosowane do produkcji biofarmaceutyków

• Bakterie: E. coli K12* Lactococcus lactis, Bacillus subtilis

• Eucariota:

- drożdże (Saccharomyces cerevisiae*, Pichia pastoris, Hansensula polyriorpha)

- grzyby (Aspergillus)

- zwierzęta

- owady: kultury komórkowe lub całe organizmynp. Bombyx mori* (jedwabnik), Spodoptera frugiporda*

- ssaki: kultury komórkowe np. CHO* - chinise hamster ovary, BHK* - baby hamster kidney; zwierzęta transgeniczne: owce, kozy, krowy, króliki

- rośliny: Nicotiana babacum, Zea mays (*), Brassica napus

* - stosowane komercyjnie do produkcji biotransfarmaceutyków

10. Opisz otrzymywanie somatostatyny techniką inżynierii genetycznej.

11. Opisz otrzymywanie insuliny techniką inżynierii genetycznej w drodze „pojedynczej fermentacji”

12. OPISZ OTRZYMYWANIE INSULINY TECHNIKĄ INŻYNIERII GENETYCZNEJ W DRODZE ` PODWÓJNEJ FERMENTACJI `

13. WYMIEŃ RODZAJE ANALIZ WYKONYWANYCH CELEM OKREŚLENIA JAKOŚĆI INSULINY LUDZKIEJ OTRZYMANĄ METODA rDNA

Oznaczanie zawartości:

• Insuliny ludzkiej - HPLC z detekcją UV

• Białek pokrewnych - HPLC

• Zanieczyszczeń o m.cz. większej od rekombinowanej insuliny ludzkiej-HPLC

• Pozostałości białek E.coli i białek nieenzymatycznych- immunosorpcyjna ELISA za pomocą specyficznych p-ciał poliklonalnych

• Pozostałości DNA - nieizotopowa hybrydyzacja i ilościowe PCR (dopuszczalny limit 10 pg/mg)

14) Opisz analogi insuliny o przyśpieszonym działaniu otrzymywane metodami rDNA

• - Humalog: zamiana w pozycji B28 i B29 (prolina-lizyna na lizyna-prolina)

• - Noworapid: zamiana w pozycji B28 proliny na kwas asparaginowy

15) Opisz analogi insuliny o wydłużonym działaniu otrzymywane metodami rDNA

• Lantus: zamiana w pozycji A21 kwasu asparaginowego na glicynę

• Lavemir: usunięto z pozycji B30 treoninę, a do lizyny w pozycji B29 dołączono

kwas tłuszczowy

16. OPISZ OTRZYMYWANIE SZCZEPIONEK METODAMI INŻYNIERII GENETYCZNEJ

Szczepionki :

1. klasyczne - odzjadliwione wirusy lub bakterie posiadające właściwości antygenowe; powstawanie p-ciał

2. antygenowe produkowane metodą rDNA:

1. izolacja/ chemiczna synteza DNA kodującego syntezę antygenowych peptydów otoczki wirusa lub bakterii

2. łączenie DNA z plazmidami

3. wprowadzanie plazmidów do E.coli

4. wytwarzanie cząstek antygenów przez transformowanie komórki

5. przygotowanie formy farmaceutycznej wytworzonych antygenów, np. szczepionka na WZW B

3. hybrydowe

gen antygenu wirusa chorobotwórczego + DNA wirusa bezpiecznego ► wirus bezpieczny z genem wirusa chorobotwórczego ; np. szczepionka na wściekliznę

4. szczepionka DNA - nagi DNA kodujący białka wirusa/bakterii może pobudzić układ odpornościowy do produkcji p-ciał ; stosowany w chorobach zakaźnych, nowotworach, alergiach, ch. Autoimmunologicznych, malarii, HIV - próby kliniczne

17. OPISZ BIOTECHNOLOGICZNE OTRZYMYWANIE INTERFERONÓW

Interferony- grupa białek hamująca replikację wirusów i biorąca udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej

Otrzymywanie:

1. INTERFERON α

1. Z leukocytów wyodrębnia się mRNA, na którym syntetyzuje się cDNA

2. Połączenie cDNA z plazmidem

3. Transformacja komórek E.coli

4. Produkcja interferonu w komórkach bakterii; produkt skłąda się z 165 aminokwasów

5. Oczyszczanie metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie z p-ciałem monoklonalnym specyficznym dla określonego interferonu

2. INTERFERON β

1. Izolacja mRNA z ludzkich fibroblastów

2. Synteza za pomocą odwrotnej transkrypcji

3. Dalej j. w.

3. INTERFERON γ

1. Izolacja mRNA z limfocytów

2. j.w.

18. WYMIEŃ FORMY P-CIAŁ KTÓRE MOŻNA OTRZYMAĆ METODAMI rDNA (nazwa i symbol)

1. rAb - pełne p-ciało

2. Fab - fragment wiążący antygen pojedynczy

3. F(ab)2 - fragment wiążący antygen podwójny

4. fragment zmienny:

1. scFv dimer - łącznik peptydowy

2. scFv + białko sygnałowe

3. scFv + białko sygnałowe + sekwencja sygnałowa

4. scAbs

5. bispecyficzna scFv

19. OMÓW PROBLEM GLIKOZYLACJI W PRODUKCJI BIOFARMACEUTYKÓW W POSZCZEGÓLNYCH SYSTEMACH EKSPRESYJNYCH

1. bakterie - białka nie są glikozylowane

2. grzyby - białka mogą być nadmiernie glikozylowane

3. rośliny - glikozylacja cukrami niewystępującymi u ssaków (fruktoza, ksyloza); immunogenne przy podaniu pozajelitowym, brak reakcji odpornosciowej po podaniu p.o.

4. w ?? brak glikozylacji

5. owady - glikozylacja niekompletna lub znacznie odmienna niż u człowieka

6. ssaki - produkt często ale nie zawsze identyczny z naturalnym

20) opisz cechy erytropoetyn otrzymywanych metodami rDNA

• Erytropoetyna (EPO) - czynnik hemopoetyczny.

• Działanie: stymuluje i reguluje erytropoezę. Zastosowanie: leczenie anemii.

• Gen EPO: 4 introny, 5 egzonów, w 7 chromosomie. Struktura: glikoproteina, 166

aminokwasów, masa cząsteczkowa 36kDa, 40% glikany: 3N-glikany i 1O-glikany.

• Produkcja biotecznologiczna → gen EPO → komórki CHO → rhEPO

• N-glikan max 4 reszty kwasu sialowego

• O-gilkan max 2 reszty kwasu sialowego

• EPO (glikoproteina EPO) - posiada 3N-glikany i 1O-glikan

• EPO II generacji (Arnasep, Darboprotein α) posiada dodatkowo 2N-glikany (raz w tygodniu

zamiast trzy razy) - terapia anemii u leczonych chemioterapią.

21) Porównaj cechy rekombinowanych kwasów nukleinowych Macugen i Vitravene

a) Macugen- syntetyczny oligonukleotyd wiążący się z naczyniowym czynnikiem wzrostu śródbłonka

b) Vitravene- syntetyczny antysensowny oligonukleotyd RNA, sekwencja komplementarna do mRNA wirusa

22. OPISZ RODZAJE MODYFIKACJI BIAŁEK TERAPEUTYCZNYCH MAJĄCYCH NA CELU PRZEDŁUŻENIE ICH OKRESU PÓŁTRWANIA IN-VIVO:

1. PEG-ylcja: kowalencyjne przyłączenie glikoli polietylenowych.

-) PEGylowana L-asparaginaza - terapia ostrej białaczki limfoblastycznej

-) PEG-Intron - terapia chronicznego WZW typu C

2. Fuzja białek: połączenie białka terapeutycznego z albuminą lub p/ciałami.

-) INF-α-albumina : terapia ostrej białaczki

3. N-glikozylacja: dołączenie do białka terapeutycznego N-glikanu z kwasem sjalowym

nadającym ładunek „-„

np. Erytropoetyna

1. OMÓW BIOSYNTEZĘ SZIKONINY W KULTURZE IN VITRO:

*) Szikonina: czerwony barwnik, działa p/zapalnie i p/bakteryjnie, w kosmetyce - szminki.

*) Produkcja: kultura komórek Lithospermum erythrorhizon

proces 2-etapowy: I- prod. biomasy (białe komórki)

II- prod. barwnika ( czerwone komórki)

zawartość produktów wtórnych w: -) roślinie 1,5% sm

-) hodowli kom. 14% sm = 1,5 g/l

2. OPISZ BIOTECHNOL. OTRZYMYWANIE β-METYLODIGOKSYNY:

β-metylodigitoksyna β-metylodigoksyna

zawiesina komórek D. lanata

korzenie transformowane

kom. immobilizowane

mikrosomy immobilizowane

enzymy im mobilizowane

25. OPISZ OTRZYMYWANIE BIOFARMACEUTYKÓW W TRANSGENICZNYCH OWADACH:

*) Otrzymywanie szczepionki weterynaryjnej przeciwko gorączce świńskiej:

Kultura kom. owadów Spodoptera frugiperda w bioreaktorze 500 - 1000 l.

Dodawanie rekombinowanego wirusa - bakulowirus

Oddzielenie kom. od płynu pozakomórkowego zawierającego produkt

Dodanie środka inaktywującego wirusa - β-propiolakton

Dodatek środków pomocniczych

Produkt handlowy

*) Interferon w „Vibragen Omega”:

Hodowla owadów - jedwabnik - w gablotkach na pożywce przez 2 dni

Inokulacja owadów rekombinowanym wirusem

Hodowla inokulowanych owadów przez 5 dni

Rozdrobnienie owadów

Ekstrakcja produktu i jego oczyszczanie, chromatografia powinowactwa

Produkt handlowy

26. OPISZ OTRZYMYWANIE BIOFARMACEUTYKÓW Z TRANSGENICZNYCH SSAKACH:

Otrzymywanie: a) gen kodujący dany lek wprowadza się do plazmidów i klonuje się go w bakterii

2. namnożony gen wycina się z plazmidu i metodą mikroinjekcji wprowadza do zygoty

pobranej od samicy

3. zygotę inplantuje się w macicy samicy, a w wyniku porodu otrzymuje się

transgeniczne potomstwo

4. w wyniku ekspresji powstaje białko o charakterze leku, które będzie miało

określoną strukturę.

27. OPISZ OTRZYMYWANIE BIOFARMACEUTYKÓW W TRANSGENICZNYCH ZWIERZĘTACH GOSPODARCZYCH

28) OMÓW METODY EKSPRESJI OBCYCH BIAŁEK (BIOFARMACEUTYKÓW) W ROŚLINACH

• Ukierunkowana ekspresja obcych genów w roślinach:

• komórki: cytosol, reticulum endoplazmatyczne, błona komórkowa, chloroplast, apoplast

• organy: cała roślina, bulwy, liście, liście - gutacja, korzenie, korzenie - ryzosekrecja

29) OMÓW OTRZYMYWANIE P/CIAŁ W TRANSGENICZNYCH ROŚLINACH

• Produkcja biofarmaceutyków: 100 razy taniej rośliny transgeniczne niż zwierzęta.

• Rośliny używane do produkcji biofarmaceutyków: przenica, ryż, kukurydza.

• Próba stworzenia jadalnych szczepionek np.: transgeniczna sałata (Polska)

• Problem glikozylacji białek:

1 etap taki sam, 2 etap inny (brak kwasu sialowego, obecność węglowodorów)

• Chloroplastowy system transgeniczny: można wstawić wiele plazmidów np.: tytoń - gen

somatotropiny, albuminy.

• Odzysk białek rekombinowanych:

1. Ekspresja białek w określonych tkankach

2. Pominięcie chromatografii w oczyszczeniu białek

3. Pominięcie wyodrębniania - rośliny jadalne

• Na rynku: trypsyna, apoproteiny.

30. OPISZ OTRZYMYWANIE HIRUDYNY W RÓŻNYCH SYSTEMACH EKSPRESYJNYCH:

• System rekombinowania hirudyny:

- Bakterie: E. coli, Streptomyces lividans

- Drożdże: Saccharomyces cerevisiae - zastosowanie lecznicze, Hansenula polymorpha i

picchia pastoris - duża wydajność

- Grzyby: Acremonium, Chrysogenum

- Komórki owadów i ssaków

- Rośliny: Brassica napus - rzepak, tytoń

• Otrzymywanie hirudyny w transgenicznym rzepaku

1. Konstrukcja chimerycznego genu deozyny

2. Transformacja rzepaku

3. Wzrost roślin i zbiór nasion

4. Ekstrakcja nasion wodą

5. Wydzielanie ciał olejowych

6. Rozszczepienie enzymem proteolitycznym

7. Wirowanie

8. Wydzielanie hirudyny

8

---