1 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia


Podstawowe wiadomości z techniki mikrobiologicznej.

0x01 graphic

Przedmiotem badań mikrobiologii rolniczej są mikroorganizmy zasiedlające glebę, powierzchnie roślin, komposty, obornik i inne nawozy organiczne. Badania te mają na celu charakterystykę ilościową i jakościową mikroorganizmów oraz określenie ich roli i aktywności w środowisku.

  1. Podłoża hodowlane (typy i przykłady); substancje zestalajśce (agar - agar, żelatyna).

Hodowle drobnoustrojów prowadzi się na pożywkach lub podłożach hodowlanych. Pożywką nazywamy zestaw składników pokarmowych odpowiednio dobranych pod względem ilościowym i jakościowym niezbędnych do hodowli drobnoustrojów.

Skład pożywki musi być tak dobrany, by gwarantował optymalne warunki wzrostu i rozwoju badanych mikroorganizmów. 

W związku z tym, podłoże musi posiadać:

Istnieje wiele kryteriów podziału pożywek. Najczęściej podstawś podziału jest:

Ze względu na charakter chemiczny składników wyróżnia się pożywki:

W zależności od wymagań pokarmowych drobnoustrojów pożywki dzieli się na:

Zależnie od celu, jakiemu mają służyć, pożywki dzieli się na:

Pod względem konsystencji pożywki dzieli się na:

Krótka charakterystyka poszczególnych typów pożywek

 

 

  1. Podłoże wg Martina do hodowli grzybów. Wybiórczość podłoża powodowana jast przez róż bengalski, streptomycynę i niskie pH.

  2. Podłoże wg Bunta i Roviry z dodatkiem wyciągu glebowego stosowana jest do izolacji i liczenia mikroorganizmów glebowych.

Podłoża:

Substancje zestalające - są to substancje, które pozwalają na zestalenie pożywek. Do najczęściej używanych substancji zestalających należy agar i żelatyna.

Agar - jest wysuszoną, hydrofilną, koloidalną substancją wyekstrahowaną z glonów znanych jako agarofity. Składa się on z dwóch polisacharydów - agarozy i agaropektyny w zmiennych proporcjach zależnych od strefy pochodzenia glonów.  Temperatura upłynnienia podłoża z agarem wynosi około 100ºC, a temperatura zestalania około 45ºC. Poniżej tej temperatury podłoże z agarem zastyga tworząc trwałą galaretę. Nie stanowi substancji odżywczej tylko czynnik zestalający podłoże. W handlu dostępny jest w postaci włókien lub proszku.

0x01 graphic

Agar odżywczy sporządza się z bulionu z dodatkiem 1,5 - 2% agaru.

Żelatyna - jest substancją białkową. Otrzymuje się ją w wyniku hydrolizy kolagenu czyli białka występującego w tkance łącznej zwierząt. Temperatura upłynnienia podłoża z żelatyną wynosi około 25ºC, a temperatura zestalania około 20ºC. Wykorzystywana jest przez drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych.

Żelatynę odżywczą sporządza się z bulionu dodając około 15% żelatyny.

  1. Naczynia i urządzenia do hodowli drobnoustrojów: płytki Petriego, probówki bakteriologiczne, kolby, pipety, cieplarki, suszarki.

  2. 0x01 graphic

    Płytki Petriego - są to dwie szklane szalki; górna ma nieco większą ąrednicę i niższy brzeg niż dolna, wskutek czego szalki zachodzą na siebie i można je swobodnie zamykać i otwierać. Służą do zakładania hodowli, liczenia, badań diagnostycznych i morfologicznych drobnoustrojów. Mają zastosowanie wyłącznie przy użyciu podłoży stałych.

    Po zestaleniu pożywek agarowych wydziela się z nich woda kondensacyjna, która może rozmyć kolonie wyrosłe na płytkach Petriego, dlatego należy płytki z pożywkami zestalonymi agarem inkubować zawsze odwrócone dnem do góry. 

    Probówki bakteriologiczne - bez kołnierzyka o różnych wymiarach. Stosowane do hodowli i przechowywania drobnoustrojów oraz do wykonywania rozcieńczeń np. gleby, mleka. Mają zastosowanie przy użyciu podłoży płynnych i stałych (słupki i skosy). Zamyka się je korkami z waty, tworzywa sztucznego lub gumowego.

    0x01 graphic

    a). skos, b). słupek

    0x01 graphic

    a). probówka chemiczna,

    b). probówka mikrobiologiczna

    0x01 graphic

    Probówki

    Probówki chemiczne - stosowane do analiz chemicznych i biochemicznych w mikrobiologii. Posiadają kołnierzyk ułatwiający przelewanie. 

    W mikrobiologii wykorzystywane są kolby różnego typu i wielkości. Najczęściej są stosowane kolby stożkowe, kuliste lub płaskodenne. Służą do sporządzania pożywek, roztworów oraz do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych. Zamyka się je korkami z waty, lub tworzywa gumowego.

    0x01 graphic

    Kolby -stożkowa i kulista płaskodenna

    0x01 graphic

    Pipety (kalibrowane i automatyczne) - służą do posiewów hodowli płynnej oraz do przygotowywania rozcieńczeń .

    Pipety pasterowskie - do nanoszenia materiału na szkiełka lub do posiewów wgłębnych w probówkach. 

    Przed wyjałowieniem część ustnikową pipety zatyka się zacikiem, co zabezpiecza materiał pobierany pipetą przed zakażeniem z zewnątrz a szczególnie przed przedostaniem się drobnoustrojów do ust.

    0x01 graphic

    Pipety automatyczne

    Szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe - służą do przygotowywania preparatów mikroskopowych. Szkiełka Lindnera z wgłębieniem przeznaczone są do obserwacji preparatów przyżyciowych w wiszącej kropli.

    0x01 graphic

    Szkiełka mikroskopowe

    a). przedmiotowe

    b). nakrywkowe

    Cieplarki - są to mniejsze lub większe szafy z półkami, zaopatrzone w urządzenia ogrzewające i termostatowe odpowiednio izolowane termicznie. Stałość temperatury zapewnia termostat. Służą do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych i stałych. Różne gatunki drobnoustrojów wymagają różnych temperatur do prawidłowego wzrostu i rozwoju.

    Suszarka - szafka wyposażona w izolację cieplną oraz grzałki elektryczne i termoregulator, służąca do sterylizacji szkła laboratoryjnego (kolb, probówek, pipet, płytek Petriego) w temp. około 180OC przez około 3 godziny. Czyste, suche szkło laboratoryjne przygotowuje się do jałowienia owijając je w papier, folię aluminiową lub umieszcza się w specjalnych pojemnikach metalowych (tubusach). W metalowych tubusach muszą być pootwierane otwory aby był zapewniony swobodny obieg powietrza.

    0x01 graphic

    Cieplarka

    Uwagi na temat jałowienia w suszarkach

    1. Podstawowe zabiegi stosowane w mikrobiologii:

    a). sterylizacja pożywek (metoda termiczna, filtracja).

    Sterylizacja (wyjaławianie) - zabieg prowadzący do zabicia lub usunięcia drobnoustrojów.

    Sterylizacja termiczna polega na zastosowaniu odpowiedniej temperatury.

    Wyróżniamy sterylizację termiczną:

    Pożywki najczęściej jałowi się na mokro, w gorącej parze wodnej, w aparatach zwanych autoklawami.

    Autoklaw - jest to kocioł o podwójnych ścianach i podwójnym dnie, zaopatrzony w manometry, termometr oraz zawór bezpieczeństwa i zawór odpowietrzający. W górnej części znajduje się pokrywa mocowana specjalnymi śrubami. Czynnikiem jałowiącym jest przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. Sterylizacja odbywa się przy ciśnieniu (1 atmosfery) w temp. 121OC - w ciśgu 20 - 30 minut. Autoklaw jest najczęściej stosowanym aparatem do jałowienia, oprócz pożywek można w nim jałowić sprzęt, który w suszarce przy znacznie wyższej temperaturze może ulec zniszczeniu.

    0x01 graphic

    Autoklaw

    Nie wszystkie jednak pożywki można jałowić pod zwiększonym ciśnieniem w autoklawach. Pożywki zwierające cukry, żelatynę, a także roztwory witamin i inne substancje ulegające rozkładowi pod wpływem wysokiej temperatury wyjaławia się w bieżącej parze wodnej w temp. do 100OC. Proces ten nazywa się pasteryzacją.

    Aparat Koch - jest to kocioł metalowy, znacznie lżejszy od autoklawu, o uproszczonej budowie, przykryty luźną pokrywą. Czynnikiem jałowiącym jest bieżąca para wodna o temp. do 100OC. Czas sterylizacji nie przekracza zwykle 30 minut.

    W bieżącej parze wodnej o temp. do 100OC giną wegetatywne formy drobnoustrojów, natomiast nie zostają zniszczone formy przetrwalne drobnoustrojów odporne na wysoką temperaturę. Dla uzyskania pełnej jałowości materiału stosujemy metodę trzykrotnego ogrzewania w temp.100OC w ciągu 30 minut co 24 godziny. W między czasie materiał przenosi się do inkubacji w cieplarce w celu umożliwienia wykiełkowania przetrwalników. Zabieg ten nosi nazwę tyndalizacji.

    Wyjaławianie przez filtrację - metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne bądĽ chemiczne (surowica, roztwory mocznika i niektórych cukrów). Metoda filtracji polega głównie na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od średnicy drobnoustrojów. Istnieje wiele rodzajów takich filtrów, różniścych się materiałem z którego są wykonane oraz konstrukcją np.:

    Filtry są przed użyciem sterylizowane wraz z zestawem naczyń, używanych w procesie sączenia. Proces sączenia odbywa się w ten sposób, że filtr łączy się z naczyniem, z którego usuwa się powietrze za pomocą pompy wodnej. Ciśnienie atmosfery przeciska płyn przez ścianki filtrów, a drobnousrtoje większe od porów zostają zatrzymane.

    b). Sterylizacja szkła bakteriologicznego (metoda termiczna)

    c). Dezynfekcja

    Metoda chemiczna - polega na stosowaniu związków chemicznych do zabijania drobnoustrojów (dezynfekcja).

    Do dezynfekcji stosuje się zasady (węglan sodu), kwasy (kwas siarkowy), środki utleniające (chloramina, chlor), sole metali ciężkich (sublimat - chlorek rtęci), alkohole (etylowy), formalinę, krezol, i amonowe zasady czwartorzędowe itd.

    d). Posiew materiału mikrobiologicznego ezą i pipetą (jałowienie ez i igieł)

    Posiew - wprowadzenie badanego materiału (np. zawiesiny drobnoustrojów, zawiesiny wodnej gleby, cząsteczek gleby) na podłoże hodowlane lub do pożywki.

    Przesiew - przeniesienie drobnoustrojów z podłoża na podłoże.

    Pobieranie materiału wykonuje się za pomocą ezy, pipety itp.

    Eza - oczko wykonane ze specjalnego rodzaju drutu i osadzone w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów, przesiewów i sporządzania preparatów mikroskopowych.

    Igła - prosty drucik w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów wgłębnych i sporządzania preparatów mykologicznych (grzybowych).

    0x01 graphic

    a) igła, b) eza

    W zależności od konsystencji materiału posiewnego i podłoża, które należy zaszczepić, dobiera się odpowiedni sposób przeszczepiania wg. poniższego schematu 

    *Metoda powierzchniowa - niewielką ilość rozcieńczonego materiału nanosi się pipetą na zestaloną pożywkę i rozprowadza szklaną głaszczką po całej powierzchni. 

    **Metoda wgłębna - rozcieńczony materiał badany wprowadza się do płytki Petriego, a następnie zalewa płynnym, wystudzonym (ok. 50oC) podłożem. Całość miesza się ruchami kolistymi i pozostawia do zastygnięcia.

    Wyżarzanie - to sterylizacja przez rozgrzanie do czerwoności w płomieniu palnika, a następnie 3 krotne przesunięcie w płomieniu palnika oprawki wyżarzanego narzędzia - ezy lub igły.

    Opalanie - polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia np. z brzegami naczyń zawierających pożywki, wlotami probówek. Głaszczkę opala się zanurzając w alkoholu i zapalając w płomieniu palnika.

    Przeszczepianie etapy

    Celem posiewu może być:

    Posiewy diagnostyczne służą do badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych.

    Po wykonaniu posiewu, płytki umieszcza się w cieplarkach i inkubuje w optymalnej temperaturze (np. 28oC) przez określony czas dostosowany do wymagań drobnoustrojów.

    0x01 graphic

    Część praktyczna

    Ćwiczenie wysiewu ezą i pipetą płynów doświadczalnych (woda z barwnikiem i bez barwnika).

    Posiew redukcyjny - demonstracja.

    0x01 graphic

    Posiew redukcyjny - zmniejsza liczbę drobnoustrojów wysiewanych na jednostkę powierzchni podłoża zestalonego i ma na celu uzyskanie kolonii z jednej komórki macierzystej (czysta kultura).

    Kolonią - nazywamy zespół komórek widoczny gołym okiem powstały z jednej komórki macierzystej.

    Spośród kolonii rosnących na płytce wybieramy jedną do posiewu redukcyjnego. Pobierany jałowo materiał rozprowadzamy ezą na powierzchni płytki z podłożem agarowym gęstymi zygzakowatymi ruchami, rozcieramy materiał na 1/2 powierzchni płytki, obracamy płytką o 90o i znów ruchami zygzakowatymi, zahaczając o posianą poprzednio powierzchnię rozcieramy na 1/2 powierzchni płytki, czynność jeszcze raz powtarzamy.

    0x01 graphic

    Część praktyczna

    Należy obejrzeć płytkę z wykonanym posiewem redukcyjnym bakterii - wykonać i opisać rysunek.

    0x01 graphic

    10



    Wyszukiwarka

    Podobne podstrony:
    3 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    10 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    13 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    12 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    11 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    ĆWICZENIE X, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    cw12, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    3kolos, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    mikrobiologia-1kolos, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    ĆWICZENIE III, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    ĆWICZENIE VIII, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
    ĆWICZENIE VII, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia

    więcej podobnych podstron