Podstawowe wiadomości z techniki mikrobiologicznej.

Przedmiotem badań mikrobiologii rolniczej są mikroorganizmy zasiedlające glebę, powierzchnie roślin, komposty, obornik i inne nawozy organiczne. Badania te mają na celu charakterystykę ilościową i jakościową mikroorganizmów oraz określenie ich roli i aktywności w środowisku.

1. Podłoża hodowlane (typy i przykłady); substancje zestalajśce (agar - agar, żelatyna).

Hodowle drobnoustrojów prowadzi się na pożywkach lub podłożach hodowlanych. Pożywką nazywamy zestaw składników pokarmowych odpowiednio dobranych pod względem ilościowym i jakościowym niezbędnych do hodowli drobnoustrojów.

Skład pożywki musi być tak dobrany, by gwarantował optymalne warunki wzrostu i rozwoju badanych mikroorganizmów. 

W związku z tym, podłoże musi posiadać:

• odpowiedni zestaw związków chemicznych

• optymalny odczyn

• ciśnienie osmotyczne

• musi być jałowe

Istnieje wiele kryteriów podziału pożywek. Najczęściej podstawś podziału jest:

• skład chemiczny pożywek

• wymagania pokarmowe drobnoustrojów

• cel stosowania

• konsystencja pożywek

Ze względu na charakter chemiczny składników wyróżnia się pożywki:

• naturalne

• syntetyczne

• półsyntetyczne

W zależności od wymagań pokarmowych drobnoustrojów pożywki dzieli się na:

• proste

• złożone

Zależnie od celu, jakiemu mają służyć, pożywki dzieli się na:

• ogólne 

• selektywne (wybiórcze)

Pod względem konsystencji pożywki dzieli się na:

• płynne

• półpłynne 

• stałe

Krótka charakterystyka poszczególnych typów pożywek

• Naturalne - przygotowywane są z produktów pochodzenia naturalnego np. mleka, bulionu, wyciągów roślinnych lub glebowych.

• Syntetyczne - mają ściśle zdefiniowany skład chemiczny zarówno pod względem ilościowym, jak i jakościowym. Stosowane są między innymi w badaniach diagnostycznych.

• Półsyntetyczne - wykonywane są ze składników naturalnych i syntetycznych związków chemicznych.

 

• Proste - stosowane dla prototrofów, czyli drobnoustrojów, którym wystarcza w podłożu prosty związek organiczny, wykorzystywany do budowy wszystkich niezbędnych składników komórki.

• Złożone - służą do hodowli auksotrofów tj. drobnoustrojów, które nie są w stanie syntetyzować niektórych składników komórki np. pewnych aminokwasów czy witamin i związki te należy im dostarczać w pożywce.

 

• Ogólne - na których rosną różne grupy fizjologiczne drobnoustrojów np. bulion mięsny. Jest to podłoże płynne. Przygotowuje się je z wyciągu z mięsa do którego dodaje się 1-2% peptonu i 0,5% NaCl.

• Wybiórcze - w celu wyizolowania jednej grupy fizjologicznej mikroorganizmów, oznaczającej się określonymi wymaganiami pokarmowymi np.

1. Podłoże wg Martina do hodowli grzybów. Wybiórczość podłoża powodowana jast przez róż bengalski, streptomycynę i niskie pH.

2. Podłoże wg Bunta i Roviry z dodatkiem wyciągu glebowego stosowana jest do izolacji i liczenia mikroorganizmów glebowych.

Podłoża:

• płynne - powinny być klarowne, a wszystkie składniki muszą być całkowicie rozpuszczone (do 0,5 % agaru).

• półpłynne - zestalone małą ilością substancji żelującej (0,5-1,5 % agaru).

• stałe - zestalone większą ilością substancji żelującej(1,5-2 % agaru, ok 15% żelatyny). Można w próbówkach po sterylizacji zestalić w postaci tzw. słupka lub przez ułożenie przed zastygnięciem w położeniu pochyłym w postaci tzw. skosu agarowego.

Substancje zestalające - są to substancje, które pozwalają na zestalenie pożywek. Do najczęściej używanych substancji zestalających należy agar i żelatyna.

Agar - jest wysuszoną, hydrofilną, koloidalną substancją wyekstrahowaną z glonów znanych jako agarofity. Składa się on z dwóch polisacharydów - agarozy i agaropektyny w zmiennych proporcjach zależnych od strefy pochodzenia glonów.  Temperatura upłynnienia podłoża z agarem wynosi około 100ºC, a temperatura zestalania około 45ºC. Poniżej tej temperatury podłoże z agarem zastyga tworząc trwałą galaretę. Nie stanowi substancji odżywczej tylko czynnik zestalający podłoże. W handlu dostępny jest w postaci włókien lub proszku.

Agar odżywczy sporządza się z bulionu z dodatkiem 1,5 - 2% agaru.

Żelatyna - jest substancją białkową. Otrzymuje się ją w wyniku hydrolizy kolagenu czyli białka występującego w tkance łącznej zwierząt. Temperatura upłynnienia podłoża z żelatyną wynosi około 25ºC, a temperatura zestalania około 20ºC. Wykorzystywana jest przez drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych.

Żelatynę odżywczą sporządza się z bulionu dodając około 15% żelatyny.

2. Naczynia i urządzenia do hodowli drobnoustrojów: płytki Petriego, probówki bakteriologiczne, kolby, pipety, cieplarki, suszarki.

Płytki Petriego - są to dwie szklane szalki; górna ma nieco większą ąrednicę i niższy brzeg niż dolna, wskutek czego szalki zachodzą na siebie i można je swobodnie zamykać i otwierać. Służą do zakładania hodowli, liczenia, badań diagnostycznych i morfologicznych drobnoustrojów. Mają zastosowanie wyłącznie przy użyciu podłoży stałych. Po zestaleniu pożywek agarowych wydziela się z nich woda kondensacyjna, która może rozmyć kolonie wyrosłe na płytkach Petriego, dlatego należy płytki z pożywkami zestalonymi agarem inkubować zawsze odwrócone dnem do góry.

Probówki bakteriologiczne - bez kołnierzyka o różnych wymiarach. Stosowane do hodowli i przechowywania drobnoustrojów oraz do wykonywania rozcieńczeń np. gleby, mleka. Mają zastosowanie przy użyciu podłoży płynnych i stałych (słupki i skosy). Zamyka się je korkami z waty, tworzywa sztucznego lub gumowego.	a). skos, b). słupek		a). probówka chemiczna, b). probówka mikrobiologiczna
				Probówki

Probówki chemiczne - stosowane do analiz chemicznych i biochemicznych w mikrobiologii. Posiadają kołnierzyk ułatwiający przelewanie. 

W mikrobiologii wykorzystywane są kolby różnego typu i wielkości. Najczęściej są stosowane kolby stożkowe, kuliste lub płaskodenne. Służą do sporządzania pożywek, roztworów oraz do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych. Zamyka się je korkami z waty, lub tworzywa gumowego.

Kolby -stożkowa i kulista płaskodenna

Pipety (kalibrowane i automatyczne) - służą do posiewów hodowli płynnej oraz do przygotowywania rozcieńczeń . Pipety pasterowskie - do nanoszenia materiału na szkiełka lub do posiewów wgłębnych w probówkach.  Przed wyjałowieniem część ustnikową pipety zatyka się zacikiem, co zabezpiecza materiał pobierany pipetą przed zakażeniem z zewnątrz a szczególnie przed przedostaniem się drobnoustrojów do ust.
		Pipety automatyczne

Szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe - służą do przygotowywania preparatów mikroskopowych. Szkiełka Lindnera z wgłębieniem przeznaczone są do obserwacji preparatów przyżyciowych w wiszącej kropli.

Szkiełka mikroskopowe a). przedmiotowe b). nakrywkowe

Cieplarki - są to mniejsze lub większe szafy z półkami, zaopatrzone w urządzenia ogrzewające i termostatowe odpowiednio izolowane termicznie. Stałość temperatury zapewnia termostat. Służą do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych i stałych. Różne gatunki drobnoustrojów wymagają różnych temperatur do prawidłowego wzrostu i rozwoju. Suszarka - szafka wyposażona w izolację cieplną oraz grzałki elektryczne i termoregulator, służąca do sterylizacji szkła laboratoryjnego (kolb, probówek, pipet, płytek Petriego) w temp. około 180^OC przez około 3 godziny. Czyste, suche szkło laboratoryjne przygotowuje się do jałowienia owijając je w papier, folię aluminiową lub umieszcza się w specjalnych pojemnikach metalowych (tubusach). W metalowych tubusach muszą być pootwierane otwory aby był zapewniony swobodny obieg powietrza.

Cieplarka

Uwagi na temat jałowienia w suszarkach

• Szkło wstawiamy do zimnej suszarki.

• Po skończeniu sterylizacji nie wyjmujemy szkła od razu.

• Szkło musi być odpowiednio zapakowane.

• Nie sterylizujemy podłoży biologicznych.

3. Podstawowe zabiegi stosowane w mikrobiologii:

a). sterylizacja pożywek (metoda termiczna, filtracja).

Sterylizacja (wyjaławianie) - zabieg prowadzący do zabicia lub usunięcia drobnoustrojów.

Sterylizacja termiczna polega na zastosowaniu odpowiedniej temperatury.

Wyróżniamy sterylizację termiczną:

• na sucho (nie stosuje się do jałowienia podłoży) - wyżarzanie, opalanie i wyjaławianie w suszarkach. 

• na mokro - autoklawowanie, pasteryzacja i tyndalizacja 

Pożywki najczęściej jałowi się na mokro, w gorącej parze wodnej, w aparatach zwanych autoklawami.

Autoklaw - jest to kocioł o podwójnych ścianach i podwójnym dnie, zaopatrzony w manometry, termometr oraz zawór bezpieczeństwa i zawór odpowietrzający. W górnej części znajduje się pokrywa mocowana specjalnymi śrubami. Czynnikiem jałowiącym jest przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. Sterylizacja odbywa się przy ciśnieniu (1 atmosfery) w temp. 121^OC - w ciśgu 20 - 30 minut. Autoklaw jest najczęściej stosowanym aparatem do jałowienia, oprócz pożywek można w nim jałowić sprzęt, który w suszarce przy znacznie wyższej temperaturze może ulec zniszczeniu.

Autoklaw

Nie wszystkie jednak pożywki można jałowić pod zwiększonym ciśnieniem w autoklawach. Pożywki zwierające cukry, żelatynę, a także roztwory witamin i inne substancje ulegające rozkładowi pod wpływem wysokiej temperatury wyjaławia się w bieżącej parze wodnej w temp. do 100^OC. Proces ten nazywa się pasteryzacją.

Aparat Koch - jest to kocioł metalowy, znacznie lżejszy od autoklawu, o uproszczonej budowie, przykryty luźną pokrywą. Czynnikiem jałowiącym jest bieżąca para wodna o temp. do 100^OC. Czas sterylizacji nie przekracza zwykle 30 minut.

W bieżącej parze wodnej o temp. do 100^OC giną wegetatywne formy drobnoustrojów, natomiast nie zostają zniszczone formy przetrwalne drobnoustrojów odporne na wysoką temperaturę. Dla uzyskania pełnej jałowości materiału stosujemy metodę trzykrotnego ogrzewania w temp.100^OC w ciągu 30 minut co 24 godziny. W między czasie materiał przenosi się do inkubacji w cieplarce w celu umożliwienia wykiełkowania przetrwalników. Zabieg ten nosi nazwę tyndalizacji.

Wyjaławianie przez filtrację - metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne bądĽ chemiczne (surowica, roztwory mocznika i niektórych cukrów). Metoda filtracji polega głównie na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od średnicy drobnoustrojów. Istnieje wiele rodzajów takich filtrów, różniścych się materiałem z którego są wykonane oraz konstrukcją np.:

• Berkefelda - wykonany z ziemi okrzemkowej.

• Chamberlanda - z nieglazurowanej porcelany.

• Seitsa - azbestowe.

• Schotta - ze spiekanego szkła 

• membranowe (molekularne) - przygotowywane z żelatyny, pergaminu, poliwęglanów, błon zwierzęcych itp.

Filtry są przed użyciem sterylizowane wraz z zestawem naczyń, używanych w procesie sączenia. Proces sączenia odbywa się w ten sposób, że filtr łączy się z naczyniem, z którego usuwa się powietrze za pomocą pompy wodnej. Ciśnienie atmosfery przeciska płyn przez ścianki filtrów, a drobnousrtoje większe od porów zostają zatrzymane.

b). Sterylizacja szkła bakteriologicznego (metoda termiczna)

• na sucho - wyjaławianie w suszarkach.

• na mokro - autoklawowanie

c). Dezynfekcja

Metoda chemiczna - polega na stosowaniu związków chemicznych do zabijania drobnoustrojów (dezynfekcja).

Do dezynfekcji stosuje się zasady (węglan sodu), kwasy (kwas siarkowy), środki utleniające (chloramina, chlor), sole metali ciężkich (sublimat - chlorek rtęci), alkohole (etylowy), formalinę, krezol, i amonowe zasady czwartorzędowe itd.

d). Posiew materiału mikrobiologicznego ezą i pipetą (jałowienie ez i igieł)

Posiew - wprowadzenie badanego materiału (np. zawiesiny drobnoustrojów, zawiesiny wodnej gleby, cząsteczek gleby) na podłoże hodowlane lub do pożywki.

Przesiew - przeniesienie drobnoustrojów z podłoża na podłoże.

Pobieranie materiału wykonuje się za pomocą ezy, pipety itp.

Eza - oczko wykonane ze specjalnego rodzaju drutu i osadzone w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów, przesiewów i sporządzania preparatów mikroskopowych. Igła - prosty drucik w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów wgłębnych i sporządzania preparatów mykologicznych (grzybowych).

a) igła, b) eza

W zależności od konsystencji materiału posiewnego i podłoża, które należy zaszczepić, dobiera się odpowiedni sposób przeszczepiania wg. poniższego schematu 

• Z pożywki płynnej - na pożywkę płynną (pipetą, ezą)

• Z pożywki płynnej - na skos (pipetą, ezą)

• Z pożywki płynnej - na płytkę (*metoda powierzchniowa - pipetą, ezą, **metoda wgłębna - pipetą)

• Z pożywki stałej  - na pożywkę płynną (ezą)

• Z pożywki stałej  - na skos (ezą)

• Z pożywki stałej  - na płytkę (ezą)

*Metoda powierzchniowa - niewielką ilość rozcieńczonego materiału nanosi się pipetą na zestaloną pożywkę i rozprowadza szklaną głaszczką po całej powierzchni. 

**Metoda wgłębna - rozcieńczony materiał badany wprowadza się do płytki Petriego, a następnie zalewa płynnym, wystudzonym (ok. 50^oC) podłożem. Całość miesza się ruchami kolistymi i pozostawia do zastygnięcia.

Wyżarzanie - to sterylizacja przez rozgrzanie do czerwoności w płomieniu palnika, a następnie 3 krotne przesunięcie w płomieniu palnika oprawki wyżarzanego narzędzia - ezy lub igły.

Opalanie - polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia np. z brzegami naczyń zawierających pożywki, wlotami probówek. Głaszczkę opala się zanurzając w alkoholu i zapalając w płomieniu palnika.

Przeszczepianie etapy

• w przypadku hodowli płynnej dokładnie mieszamy materiał

• wyżarzamy ezę lub opalamy pipetę trzymając ją w jednej ręce

• probówkę z badanym materiałem bierzemy w drugą rękę

• otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymającej ezę (pipetę)

• opalamy wlot probówki (probówki  podczas przeszczepiania trzymamy możliwie jak najbardziej przechyloną, co zapobiega zakażeniu hodowli z powietrza) 

• studzimy ezę o wewnętrzną ściankę probówki a następnie pobieramy materiał

• opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu

• bierzemy probówkę z pożywką które będziemy szczepili

• otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymajścej ezę (pipetę)

• opalamy wlot probówki

• wprowadzamy ezę (pipetę) do probówki 

• szczepimy opłukujśc ezę pożywce (w przypadku skosu rysujemy wężyk na powierzchni podłoża zaczynajśc od dołu ku górze), natomiast z pipety pozwalamy swobodnie wypłynść materiałowi (nie wydmuchujemy !)

• opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu

• wyżarzamy ezę i odstawiamy do statywu; pipetę odkładamy do pojemnika ze środkiem dezynfekyjącym

Celem posiewu może być:

• Odświeżenie hodowli drobnoustrojów w celu utrzymania ich żywotności i aktywności.

• Izolacja czystych kultur z badanego materiału.

• Diagnostyka wyizolowanych szczepów w celu określenia ich przynależności do gatunku, rodzaju lub określonej grupy drobnoustrojów.

Posiewy diagnostyczne służą do badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych.

Po wykonaniu posiewu, płytki umieszcza się w cieplarkach i inkubuje w optymalnej temperaturze (np. 28^oC) przez określony czas dostosowany do wymagań drobnoustrojów.




Część praktyczna

Ćwiczenie wysiewu ezą i pipetą płynów doświadczalnych (woda z barwnikiem i bez barwnika).

Posiew redukcyjny - demonstracja.




Posiew redukcyjny - zmniejsza liczbę drobnoustrojów wysiewanych na jednostkę powierzchni podłoża zestalonego i ma na celu uzyskanie kolonii z jednej komórki macierzystej (czysta kultura).

Kolonią - nazywamy zespół komórek widoczny gołym okiem powstały z jednej komórki macierzystej.

Spośród kolonii rosnących na płytce wybieramy jedną do posiewu redukcyjnego. Pobierany jałowo materiał rozprowadzamy ezą na powierzchni płytki z podłożem agarowym gęstymi zygzakowatymi ruchami, rozcieramy materiał na 1/2 powierzchni płytki, obracamy płytką o 90^o i znów ruchami zygzakowatymi, zahaczając o posianą poprzednio powierzchnię rozcieramy na 1/2 powierzchni płytki, czynność jeszcze raz powtarzamy.




Część praktyczna

Należy obejrzeć płytkę z wykonanym posiewem redukcyjnym bakterii - wykonać i opisać rysunek.




10

---