Biotechnologia:

• Bardzo szybki rozwój, programy rządowe: USA, Japonia, Europa.

• Przemysł biotechnologiczny należy do wiodących

• Duże nakłady - szybki rozwój

Biotechnologia jest to zintegrowane zastosowanie biochemii, mikrobiologii (nauk biologicznych) i nauk inżynieryjnych w celu technologicznego (przemysłowego) wykorzystania zdolności organizmów (drobnoustrojów), komórek (kultur komórkowych) oraz molekularnych analogów (części z nich).

Biotechnologia jest to integracja nauk przyrodniczych i technicznych z celu osiągnięcia zastosowania organizmów, komórek, ich części i molekularnych analogów do otrzymywania produktów i wykonywania usług.

Europejska Federacja Biotechnologii (EFB) stawia sobie następujące cele:

• Rozwój biotechnologii dla powszechnego pożytku

• Podnoszenia na wyższy poziom świadomości komunikacji i współpracy na wszystkich polach biotechnologii

• Dostarczanie ciałom rządowym, ponadnarodowym informacji i kompetentnych opinii odnośnie biotechnologii

• Podnoszenia na wyższy poziom powszechnego zastosowania biotechnologii

Rozwój biotechnologii:

Era przedpasterowska (do 1863): napoje alkoholowe (piwo, wino), produkty mleczne (sery, jogurt), inna fermentowana żywność (drożdże, ocet).

Era pasterowska (1863 - 1940): etanol, butanol, aceton, glicerol, kwasy organiczne (kwas cytrynowy), tlenowe oczyszczanie ścieków.

Era antybiotyków (1940 - 1960): penicylina i technologia fermentacji wgłębnej, inne antybiotyki, technologia kultur komórek zwierzęcych: szczepionki wirusowe, mikrobiologiczna transformacja steroidów.

Era post - antybiotykowa (1960 - 1973): aminokwasy, białko jednokomórkowców, enzymy (m.in. do detergentów), immobilizowane enzymy i komórki (izomeraza), beztlenowa utylizacja odpadów (biogaz), polisacharydy bakteryjne.

Era nowych biotechnologii (1973 -): monoklonowalne przeciwciała (1973), monoklonowalne testy diagnostyczne (1986), inżynieria genetyczna (1982).

Główne grupy produktów otrzymywanych w wyniku hodowli drobnoustrojów:

• Biomasa (np. drożdże piekarskie, szczepionki)

• Produkty przemian katabolicznych (np. etanol, kwas mlekowy)

• Podstawowe produkty syntez komórkowych - związki niskocząsteczkowe (np. aminokwasy, nukleotydy)

• Produkty specyficzne - tzw. metabolity wtórne (np. antybiotyki, alkaloidy)

• Produkty biotransformacji (np. steroidy, sorboza)

• Enzymy i inne wielocząsteczkowe produkty komórkowe

Drobnoustroje stosowane w biotechnologii i ich główne produkty:

• Bakterie właściwe (Eubacteriales) - aminokwasy, enzymy, antybiotyki, nukleotydy, kwasy organiczne.

• Promieniowce (Actinomycetales) - antybiotyki, enzymy i inne.

• Grzyby - enzymy, antybiotyki, witaminy, etanol, kwasy organiczne i inne.

Etapy prac badawczych, wdrożeniowych w biotechnologii:

• „screening” drobnoustrojów (izolacja, ocena przydatności, warunki przechowywania itp.)

• Określenie wstępnych warunków hodowli (skład podłoża, pH, temperatura, czas i sposób hodowli). Wstępne prace izolowania produktu.

• Ulepszanie szczepu (przez mutacje lub genetycznie) - np. w celu polepszenia wydajności.

• Optymalizacja warunków procesu („technologia laboratoryjna”) - ostatni etap laboratoryjny z uwzględnieniem ekonomii.

• Powiększenie skali - m.in. przez próby w tzw. skali pilotowej (skala pilotowa to skala pośrednia między skalą laboratoryjną a przemysłową, jej wielkość to głównie objętość bioreaktorów).

• Uruchomienie produkcji przemysłowej (główne problemy: natlenienie środowiska, utrzymanie czystości materiału biologicznego, zmienność szczepu) - wdrożenie.

Główne etapy procesu:

• Etap przygotowawczy (przygotowanie aparatury i podłoża)

• Namnażanie materiału posiewowego (inokulum)

• Proces hodowli produkcyjnej i biosyntezy („etap centralny)

• Wydzielanie produktu

• Produkcja, konfekcjonowanie gotowych produktów (do formy handlowej)

1.Przygotowanie inokulum.

Szczepy są przechowywane w stanie zliofilizowanym i zamrożonym, wysuszonym. Inokulum - materiał posiewowy. Najczęściej przechowywane szczepy na skosie w lodówce.

2. Przygotowanie podłoża i aparatury.

Nie dobieramy podłoża - ono jest już dostosowane do określonego drobnoustroju. Sterylizacja podłoży hodowlanych - przy braku sterylności procesu:

1. Spadek produktywności (konkurencja w zużywaniu podłoża)

2. Opanowanie hodowli przez mikroorganizm zakażający (szczególnie w procesach ciągłych)

3. Możliwość powstania „zakażenia” w końcowym produkcie

4. Występowanie dodatkowych utrudnień przy ekstrakcji właściwego produktu

5. Zakażenie może degradować produkt

6. Zakażenie fagami powoduje lizę komórek

Dla uniknięcia zakażeń należy:

• Stosować czyste inokulum

• Sterylizować fermentor i urządzenia wykorzystywanie w procesach biosyntezy

• Sterylizować powietrze i wszystkie materiały dodawane do fermentora

• Zachować jałowość wszelkich operacji podczas fermentacji

Metody sterylizacji:

• Mechaniczne (filtracja)

• Środki chemiczne (formalina, tlenek etylenu, β - propiolakton)

• Radiacyjne (promieniowanie)

• Ultradźwięki

• Termiczna (para 121°C)

Sterylizacja termiczna - obniżenie jakości podłoża przez:

• Oddziaływanie między składnikami podłoża (reakcja typu Maillarda - grupy karboksylowe głównie cukrów z grupami aminowymi aminokwasów i białek, polimiryzacja niektórych składników)

• Przez degradację labilnych składników podłoża (witaminy, aminokwasy, denaturacja białek, destrukcja czynników wzrostu)

Ograniczenie wyżej wymienionych efektów - przez stosowanie odpowiedniej temperatury, czasu i wyboru metody.
Metody sterylizacji parą:

• Metoda okresowa

• Metoda ciągła

Metoda okresowa	Metoda ciągła
- niska cena urządzeń - mniejsze ryzyko zakażenia - łatwe sterowanie ręczne - odpowiedniejsze dla podłoży zawierających substancje stałe	- lepsza jakość podłoża - mniejsze zużycie fermentora - łatwość zmiany skali - łatwiejsza kontrola automatyczna - redukcja czasu sterylizacji - wzrost wydajności linii produkcyjnej

Sterylizacja ciągła:

• Sterylizacja ciągła przeponowa (sterylizator płytowy)

• Sterylizacja przez iniekcję parą.

Parametry sterylizacji ciągłej:

Parametr	Iniekcja parą	Sterylizator płytowy
Czas sterylizacji właściwej	0,5 - 5 minut	0,5 - 10 minut
Temperatura	140°C	Około 140°C
Czas podgrzewania/studzenia	pomijalny	Około 1%

Sterylizacja ciągła zalety techniczno - ekonomiczne (w stosunku do okresowej):

• Mniejsze zapotrzebowanie na wodę i parę (o 60 - 70%)

• Równomierne zapotrzebowanie na parę i wodę (+ odzysk ciepła)

• Skrócenie czasu przygotowania bioreaktora

• Łagodniejsza „obróbka” podłoża

• Stałość jakości podłoża

• Możliwość oddzielnego sterylizowania składników

• Łatwiejsze rozwiązanie konstrukcji fermentora (bez „kompromisu” dla sterylizacji i fermentacji)

• Najlepsza metoda dla procesów hodowli ciągłej

Sterylizacja powietrza - bakterie, drożdże, wirusy, pleśnie - od kilku nanometrów do mikrometra.

Zabiegi wstępne: odwodnienie i odolejenie.

Metody:

1. ciepło (temperatura 218°C przez 24 sekundy - zabicie przetrwalników)

2. promieniowanie UV i inne fale elektromagnetyczne - drogie, brak pewności

3. rozpylanie środków chemicznych bakteriobójczych - trudne do usunięcia

4. filtracja - filtry bawełniane, włókna szklane, węgiel aktywny, wióry stalowe, alkohol poliwinylowy, stopy i spieki.

5. zatrzymywanie - mechaniczne i siły elektrostatyczne.

Metody hodowli drobnoustrojów:

1. Hodowle powierzchniowe:

• Na ciekłych podłożach

• Na stałych podłożach (cienka warstwa podłoża)

• Hodowle wgłębne:

• Okresowe

• Ciągłe

• Kombinowane (półciągłe)

3. SSF - Solid State Fermentation - hodowla w stałym wilgotnym podłożu tzw. Gruba warstwa.

Ad.1.

Szczepy rosną na powierzchni złoża, bez mieszania. Złoże znajduje się na tacach w komorach o odpowiedniej temperaturze z nawiewem powietrza. Nie ma mieszania i jednorodności środowiska.

Ad.2.

Podłoże jest zawsze ciekłe, występuje dowolny rodzaj mieszania. Jest jednorodność środowiska - w każdym punkcie środowiska hodowli jest identyczna temperatura, pH, stężenie tlenu i dwutlenku węgla itp.

Zalety hodowli wgłębnej:

- łatwiejsze utrzymanie czystości mikrobiologicznej (jałowości)

- lepszy kontakt drobnoustrojów z pożywką

- lepsze natlenienie

- łatwiejsze wydzielanie produktów

- jednorodność warunków w całej objętości podłoża

- większa możliwość automatyzacji i komputeryzacji

- większa wydajność

Wady:

- duży koszt aparatury

- energochłonność

Hodowla ciągła polega na likwidacji przyczyn zwalniania wzrostu drobnoustrojów przez usuwanie produktów, toksyn i dostarczanie świeżych składników pożywki. To powoduje, że drobnoustroje mogą być utrzymywane w stałej fazie wzrostu i stałości fizjologicznej.

Wyznaczanie właściwej szybkości wzrostu drobnoustrojów:


1.

x - stężenie drobnoustrojów w czasie t.

Równanie (bilans) stężenia drobnoustrojów w fermentorze 1 - stopniowym przepływowym:


2.

F - ilość cieczy

v - objętość robocza reaktora


3.


4.

D - szybkość rozcieńczania

Wtedy równanie 2:


5.

Gdy x₀ = 0

To:


6.

Podstawiając równanie 1 do równania 6:


7.

Z równania 7:

1. D > μ - wypłukiwanie drobnoustrojów

2. D < μ - nagromadzanie drobnoustrojów

3. D = μ - stan normalny

Sposoby prowadzenia hodowli ciągłych:

ZASADA:

-chemostatu (stałe D)

-turbidystatu (stałe stężenie biomasy)

-pH-statu

-oxy-statu

Wady i zalety hodowli ciągłych:

ZALETY

• hodowle w ustalonych warunkach (wybór dowolnej fazy)

• stałość fizjologiczna drobnoustrojów

• populacja i produkty bardzo jednorodne

• możliwość wprowadzenia automatyki i komputeryzacji (b. efektywna)

• zwiększenie efektywności procesu (hodowle w najlepszym stanie fizjologicznym)

• zmniejszenie nakładu pracy i czasu na mycie, sterylizację aparatury

• równomierne obciążenie całej linii produkcyjnej

• stosowanie sterylizacji ciągłej (b. efektywne)

WADY (w skali przemysłowej)

• zapewnienie jednorodnych warunków w zbiorniku (m.in. jednorodność pożywki)

• utrzymanie sterylności przez długi okres (!)

• utrzymanie stabilności:

• szczepu- mutacje (rewersja)

• operacji mechanicznych

• urządzenie doprowadzające pożywkę (w laboratorium)

• sam bioreaktor

Hodowle wgłębne- okresowe

SSF (solid state fermentation) hodowle w stałym, wilgotnym złożu, wykorzystują pozytywne cechy h. Powierzchniowych i wgłębnych

Z powierzchniowych typ wzrostu

Z wgłębnych wzrost w całej masie pożywki, mieszanie

• niższe koszty aparatury

• niższe koszty zużycia energii

• często wykorzystujemy odpadowe składniki złoża

• mniejsze zużycie wody

• mniejsze obciążenie ścieków

Podstawowe parametry klasycznych bioprocesów (hodowli i biosyntezy)

1. Charakterystyka materiału mikrobiologicznego

1. ilość biomasy

2. morfologia komórek

3. wiek komórek

4. aktywność metaboliczna

5. stan fizjologiczny komórek

• szybkość wzrostu

• szybkość przyswajania substratu

• szybkość tworzenia produktu

• szybkość oddychania

1. parametry molekularne

• DNA, RNA, białko ogółem

• Poziom enzymów

• NAD⁺ / NADH + H⁺

• Pula prekursorów

2. Charakterystyka podłoża (mech. i fiz.- chem.)

-źródła C,- źródła energii, -źródła N, -źródła P, -inne związki, -prekursory, -produkty, -pH, -stężenie O₂, -stężenie CO

3. Warunki operacyjne (fizyczne)

Temperatura, ciśnienie, lepkość, poziom piany, pobór mocy, objętość cieczy, szybkość mieszania, szybkość napowietrzania, szybkość dozowania roztworów

Modele procesów biosyntezy (xero)

Parametry:

-uwodnienie- aktywność wody, stosunek prężności pary wodnej nad roztworem (pożywka), do prężności pary wodnej nad czystą wodą- dotyczy to aktywności wody w złożu

a= P / P

0,95- 0,98- wymagana aktywność przez drobnoustroje

0,6- granica dla bardzo wytrwałych

pH- podstawowy parametr fizyko- chemiczny, zależy od:

• składu pożywki

• metabolizmu drobnoustrojów

• ma znaczenie buforowanie środowiska

Wpływ pH na rozwój drobnoustrojów:

~bezpośrednie oddziaływanie jonów H⁺ i OH^- w regulacji procesów metabolicznych

~pośrednie oddziaływanie przez dysocjację słabych kwasów i zasad

• formy niezdysocjowane łatwiej wnikają do komórek i przez to mogą być bardzo toksyczne

• wpływ na zakażenie

temperatura- najczęściej wykorzystywało się drobnoustroje temperatur mezofilnych (20-35°C), ale termofile są co raz bardziej znaczące, bo wytwarzają produkty bardzo odporne na temperaturę

-termofile rosną szybciej

-niestety zapotrzebowanie na pokarm, tlen (w jednostce czasu) zwiększa się

Bilans cieplny drobnoustrojów:

-drobnoustroje wydzielają ciepło

podczas mierzenia wzrasta ciepło

odparowanie

możliwość grzania lub chłodzenia

temperatura może mieć aspekt przy jałowości procesu

Skład pożywki:

-odporne surowce można stosować, bo jest to ekonomiczne (trudne do prowadzenia)

-zapewnia wszystko, co jest potrzebne do życia

-łatwo dostępna

O₂

-stanowi 30% suchej masy komórek

-pochodzi z substancji organicznych, CO₂, H₂ O i wiązanie bezpośrednio przy udziale oksygenaz

od O₂ zależy:

-wzrost lub zahamowanie, fizjologia -->rodzaj, wydajność i szybkość produkcji metabolitów

O₂ - może działać też toksycznie

-działanie bezpośrednie- utlenienie labilnej grupy -SH w białkach- inaktywacja enzymu

-działanie pośrednie- powstawanie H₂ O₂, wolnych rodników nadtlenkowych •O₂, hydroksylano •OH

(organizmy tlenowe maja mechanizmy obronne)

-napowietrzanie (vvm)

~natlenianie- dostarczanie O

~przewietrzanie (wentylacja)

~wspomaganie mieszania (mechaniczne)

-mieszanie (rpm) (obr/min)

Oba parametry pianotwórcze! - efektem natleniania jest natlenienie

Poziom piany:

Wpływ: - składu podłoża

• napowietrzania

• mieszania

• pH-->lepkość-->napowietrzanie powierzchni

• sposób sterylizacji (im większa temp. tym więcej piany)

• „gazotwórczość” szczepu

Problemy z pianą:

1) wzrost heterogeniczności środowiska (m.in. wynoszenie części stałych, komórek- na ścianki)

2) utrudniona kontrola objętości

3) „wypienienie” i zakażenia

4) zmniejszenie o 30-50% V

5) konieczność gaszenia-->koszty!

Oraz:

-negatywny wpływ na produkt

-obniżenie wnikania tlenu

-niekorzystny wpływ na drobnoustroje

Ograniczenie pienienia:

-dobór podłoża

-dobór pH

-selekcja szczepów

-konstrukcja bioreaktora
Gaszenie piany:

„chemiczne”(obniża wnikanie O):

1) tłuszcze roślinne, zwierzęce

-działają krótko

-zużycie duże (2-3% obj.)

2) tw. zw. Silikonowe (krzemoorg. Zmodyf.)

-oleje, emulsje, pasty

-duża wydajność
„mechaniczne”: ·-wirówki odpieniające

-nie obniża kla (wsół. wnikania O₂)
„kombinowane” (mech.-chem.)

Wyodrębnianie produktów ze środowiska po hodowli.

Operacje po hodowli dobierane są indywidualnie do potrzeb konkretnej technologii.

Podstawowe formy bioproduktów:

1. Odwodnione koncentraty (zawierają biomasę i pozostałe składniki zawiesiny).

2. Biomasa pozbawiona pozostałych składników podłoża.

3. Czyste chemicznie produkty (do stosowania w przemyśle spożywczym, chemicznym, lecznictwie itp.).

Czynniki doboru procesów i operacji wyodrębniania produktów:

1. Lokalizacja produktu(w komórkach czy w cieczy).

2. właściwości fizyko - chemiczne produktu (masa cząsteczkowa, ładunek elektryczny, polarność, hydrofobowość lub hydrofilowość).

3. Stopień stabilności produktu (w różnych warunkach).

4. Wydajność i selektywność metody izolacji.

5. Przeznaczenie gotowego produktu.

Zabiegi wstępne przed filtracją:

1. Koagulacja cieplna białek grzybni (60 - 100ºC) gdy produkt jest termostabilny.

2. Zmiana ładunku na powierzchni komórek (punkt izoelektryczny cząstek zawiesiny otrzymany przez zakwaszenie).

3. Dodatek ziemi okrzemkowej (2 - 4%) lub innych materiałów pomocniczych.

4. Dodatek detergentów lub rozpuszczalników organicznych.

Czynniki stosowane dla zwiększenia flokulacji:

- obniżenie pH do 3 - 4.

- wzrost temperatury do 50 - 60ºC

- dodatek flokulantów: NaCl, CaCl₂, AlCl₃, Al₂(SO4)₃ do 0,1 - 0,5%, detergentów kationowych do 0,01 - 1,0% lub rozpuszczalników organicznych.

Metody uwalniania składników wewnątrzkomórkowych (odział):

1. mechaniczne - bezpośrednie rozrywanie komórek (np. rzez mielenie, ucieranie, homogenizację).

2. działanie czynnikami fizycznymi (jak: szok osmotyczny, gwałtowna dekompresja, zamrażanie i rozmrażanie powodujące pękanie ściany i błony komórkowej).

3. działanie czynnikami chemicznymi (np. rozpuszczalniki organiczne, detergenty, kwasy które uszkadzają błonę komórkową).

4. rozkład ściany komórkowej na drodze lizy enzymatycznej.

Najczęściej stosowane metody uwalniania składu wewnątrzkomórkowego (w praktyce):

- ultradźwięki - dobrze rozrywają bakterie gram - ujemne, ścinanie pod wpływem drgań ma gorsze efekty w przypadku grzybni i komórek ziarniaków gram - dodatnich.

- mielenie w specjalnych młynach (z dodatkiem materiałów ściernych); mielenie kulowe, wstrząsanie z kulkami np. szklanymi.

- działanie wysokich ciśnień w stanie zamrożenia tzw. X - pasty typu Hughese (przetłaczanie „pasty” pod ciśnieniem 1000 - 6000 atm. i gwałtowna dekompresja, pękanie ścian).

- enzymatyczna liza ściany komórkowej - dość kosztowna; stary sposób: wykorzystywane enzymy lityczne ze ślimaka winniczka, liozyna z białka jaja kurzego, lepszy na bakterie

gram - dodatnie; nowy sposób: wykorzystywane preparaty enzymatyczne: lityczne.

- traktowanie wysuszonych lub zliofilizowanych komórek acetonem (lub innymi rozpuszczalnikami organicznymi).

Technologia produkcji enzymów pochodzenia mikrobiologicznego.

Biokatalizatory przewyższają katalizatory chemiczne: wysoka wydajność, wysoka selektywność katalityczna, przeprowadzanie reakcji niewykonalnych na innej drodze, łagodniejsze warunki (pH, temperatura, ciśnienie).

Główne parametry technologiczne enzymów:

- temperatura działania

- pH działania

- termostabilność

- aktywatory i inhibitory

- stężenie substratu

W przemyśle wyróżniamy trzy typy biokatalizatorów:

1. enzymy rozpuszczalne (niskie koszty, duże ilości)

2. enzymy rozpuszczalne wysoko oczyszczone (np. do celów analitycznych)

3. enzymy immobilizowane - do wielokrotnego użytku - zawierają komórki

Preparat enzymatyczny to substancja różna od naturalnej substancji pokarmowej lub

żywego organizmu, zawierająca enzym w takiej ilości aby mógł on spełniać technologiczną funkcję w przetwórstwie żywności lub innym procesie. Tradycyjnie otrzymywane były enzymy w hodowli powierzchniowej. Teraz enzymy otrzymuje się w hodowli wgłębnej i okresowej:

- szczepienie - 3 - 8% (v/v)

Podłoże - z zastosowaniem surowców odpadowych, często podłoża dolewowe

- duża wrażliwość procesów na zakażenia (podłoża są dość bogate)

- czas hodowli - najczęściej 30 - 150 godzin

- tradycyjna hodowla okresowa

- model kinetyczny - nie jest jednakowy dla wszystkich enzymów

Przykładowy proces otrzymywania enzymu: α - amylaza.

Bakterie wykorzystywane koprodukcji α - amylazy:

• Bacillus subtilis

• Bacillus licheniformis

• Bacillus amyloliquefaciens

• Bacillus tearothermophilus

• Bacillus coagulans

• Bacillus macerans

• Bacillus caldolyticus

• Bacillus polimyxa

Źródła węgla stosowane do produkcji α - amylazy bakteryjnej:

Skrobia, Mąką kukurydziana, Ziarna soi (odtłuszczone), Ziarno ryżu (odtłuszczone), Ziarno jęczmienia, Ziarno pszenicy, Tapioka, Melasa buraczana, Hydrolizaty skrobiowe, Serwatka

Źródła azotu stosowane do produkcji α - amylazy: (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, NaNO₃, KNO₃.

• Ekstrakt drożdżowy

• Namok kukurydziany

• Soja

• Preparaty mięsne

• Wywary gorzelnicze

Sole stosowane w podłożach do produkcji α - amylazy.

• CaCl₂, CaCO₃

• NaCl, Na₂CO₃, NaHCO₃

• KCl

• MgCl₂, MgSO₄

• FeCl₂, FeSO₄

• MnSO₄

Poziom węglowodorów i związków azotowych w podłożach do produkcji α - amylazy:

	C [%]	N [%]	C/N
I	0,5 - 1,0	0,6 - 1,0	1:1
II	3 - 4,5	1 - 1,5	3:1
III	8 - 10	1,5	5:1

Krótka charakterystyka α - amylazy:

- rozkłada wiązania α - 1,4 skrobi i pokrewnych

- działa wewnątrz łańcucha, niewybiórczo

- zmienia lepkość i gęstość - enzym upłynniający

- enzym prosty - składa się tylko z grupy białkowej

- czasami występuje w postaci dimerów

- aby mogła zadziałać muszą występować co najmniej trzy wiązania α - 1,4 - zależy od budowy centrum aktywnego

Zastosowanie:

- przemysł spożywczy (gorzelniczy, piwowarski, glukozowy, piekarski)

- przemysł bawełniany (do odklejania tkanin surowych)

- przemysł farmaceutyczny (produkcja innych preparatów n antybiotyków, stosowana jako składnik preparatów enzymatycznych)

- przemysł wiertniczy

- oczyszczanie ścieków

Przemysł chemiczny (składnik proszków)

5

---