ONKOLOGIA

Obszary zastosowań technik molekularnych w onkologii

1. Badanie predyspozycji

2. Diagnozowanie

3. Prognozowanie przebiegu choroby

4. Terapia celowana

5. Monitorowanie choroby resztkowej

1. Badanie predyspozycji - geny podatności

• Kom. nowotworowe - liczne zmiany genetyczne (genowe, chromosomowe)

• Jeśli takie zmiany genowe wykrywane we wszystkich komórkach organizmu - dziedziczna skłonność do nowotworu

• Mutacje w genach podatności

• geny supresorowe

• geny naprawy DNA

• protoonkogeny

• Geny podatności - przykłady

• APC SUPRESOR

- rodzinna polipowatość gruczolakowata (FAP) → rak jelita grubego

• MSH-2, MLH-1 GENY NAPRAWY

- wrodzony niepolipowaty rak jelita grubego, prawdopodobieństwo zachorowania

• BRCA1, BRCA2 GENY SUPRESOROWE

- rak sutka, rak jajnika, rak prostaty i sutka u M

• Znaczenie wykrywania

• Osoby obciążone genetycznie wymagają dokładnej diagnostyki i szczególnej profilaktyki (częstsze niż u osób nieobciążonych badania profilaktyczne, wykonywane w młodszym wieku)

• Możliwość wykrycia innych nosicieli w rodzinie (profilaktyka)

2. Diagnozowanie & Prognozowanie przebiegu choroby

Markery molekularne - cechy odróżniające kom. nowotworową od komórki prawidłowej

1. Markery biochemiczne

• substancja odróżniająca kom. prawidłową od nowotworowej (białko, aktywność enzymatyczna), odzwierciedla procesy:

• proliferacji,

• różnicowania,

• obumierania kom. nowotworowych.

• zmieniona postać i/lub ilość białka markerowego w nowotworach (w / na kom. nowotworowych, w płynach ustrojowych)

• Wykrywanie: met. immunologiczne, testy akt. enzymatycznej

• Przykłady: CA125 - jajnik; CEA - przewód pokarmowy, płuca; kalcytonina - tarczyca

• ZWYKLE NISKA SWOISTOŚĆ

2. Markery genetyczne

• Zmieniona struktura, sekwencja, ekspresja mat. genetycznego

• Zastosowanie: diagnozowanie, prognozowanie przebiegu choroby, (wybór terapii)

• Zaleta - znaczna czułość

- możliwe wykrycie zmian nowotworowych nawet w pojedynczej komórce (powyżej czułości histochemii) - możliwe wykrycie na wczesnym etapie choroby

- Możliwość wykrycia mikronacieków z komórek nowotworowych w tkankach wokół usuwanego guza lub mikroprzerzutów w węzłach chłonnych.

- Możliwość wykrycia pojedynczych komórek oddzielonych od guza nowotworowego w płynach ustrojowych (małoinwazyjność, czułość)

• Rodzaje markerów genetycznych

• genowe

• prognostyczne

• klonalności

• tkankowo specyficznej ekspresji

Markery genowe

- zmiany genetyczne w torach mutacyjnych prowadzących do powstania nowotworu (charakterystyczne dla danego typu nowotworu)

- zwykle wiele różnych zmian w jednej komórce nowotworowej

- pojedyncza zmiana mutacyjna nie musi wskazywać zawsze na charakter nowotworowy zmiany (dysplazja?)

- rzadko pojedyncza zmiana charakterystyczna dla takiego typu nowotworu

- przykłady:

• mutacja Ki - RAS (kodon12) PROTOONKOGEN → gruczolakoraki trzustki (ok. 90% przypadków) (brak w tkance prawidłowej i zmianach nienowotworowych)

• mutacje genu RET PROTOONKOGEN → rak rdzeniasty tarczycy (także gen podatności)

• rearanżacje genów dla immunoglobulin / receptorów limfocytów T → AML, ALL, chłoniaki (różnicowanie)

Markery klonalności

- wskazują na klonalny charakter rozrostu.

- w nowotworach zwykle rozrost kilku klonów komórek stransformowanych. Wyjątek - nowotwory z układu hematopoetycznego (mono-, biklonalne)

- przykłady:

• geny immunoglobulin

• geny receptorów limf. T

• sekwencje mikrosatelitarne

• swoiste translokacje chromosomowe

Markery prognostyczne

- Konkretne zmiany w genomie wiążą się z różnym przebiegiem choroby nowotworowej

• czas wolny do choroby,

• całkowity czas przeżycia.

- przykłady:

• Nadekspresja genu ERB-B2 → nadprodukcja białka receptorowego HER2 (przekazuje sygnał

o podziału kom.) → niekontrolowane podziały → agresywny przebieg → złe rokowanie

• Zwielokrotnienie genu ERB-B2 - rak sutka i jajnika

Markery tkankowo specyficzne

- stosowane w poszukiwaniu przerzutów

- poszukiwanie pojedynczych komórek krążących we krwi

- przykłady:

• Poszukiwanie komórek czerniaka we krwi po zabiegu chirurgicznym

• Badanie ekspresji genu tyrozynazy (charakterystyczne dla komórek czerniaka)

• RT-PCR

3. Terapia celowana - p53

• p53 - rozpoznaje uszkodzenia DNA → naprawa DNA lub apoptoza (duże uszkodzenia DNA)

• cytostatyki uszkadzające DNA → eliminacja kom. nowotworowych przez apoptozę

• Mutacja w genie p53/ delecja genu (1/2 nowotworów) → konieczność zastosowania leku o innym mech. działania (np. hamowanie transkrypcji)

• Herceptyna

• HER2 - jeden z receptorów dla EGFR, przekazuje sygnał do podziałów

• nadekspresja HER2 → nadmiar białka receptorowego → dimeryzacja → samoaktywacja → stały sygnał do proliferacji

• nadekspresja HER2 → agresywne nowotwory o złym rokowaniu

• Trastuzumab (Herceptyna) - przeciwciało monoklonalne przeciw HER2 blokuje monomery receptora → nie możliwa dimeryzacja → zahamowanie proliferacji

4. Monitorowanie choroby resztkowej

• Pomimo osiągnięcia całkowitej remisji (CR) w organizmie chorego może pozostawać do ok. 1010 komórek białaczkowych. Stanowią one tzw. chorobę resztkową (minimal residual disease, MRD) i mogą być źródłem wznowy.

• Choroba resztkowa - choroba nie wykrywalna konwencjonalnymi metodami cytomorfologicznym

• polega na detekcji specyficznych markerów komórek białaczkowych (np. monitorowanie kinetyki zmian poziomu MDR w czasie)

• poziomy oznaczanych markerów są wyznacznikiem ilości komórek białaczkowych w organizmie pacjenta

• Rodzaje markerów:

- Genetyczne

• geny fuzyjne

• rearanżacje genów dla TcR (d, g), Ig (H, k)

• inne - nested PCR, real-time PCR

- Immunofenotypowe

• zmieniona ekspresja antygenów komórek białaczkowych - cytometria przepływowa

Geny fuzyjne - powstają za skutek translokacji chromosomowych, swoistych dla białaczek

• bezpośredni związek z leukemogenezą - stała obecność podczas trwania choroby

• brak specyficzności dla pacjenta (możliwość wyników fałszywie dodatnich)

• różna częstość występowania danych translokacji w różnych grupach pacjentów

Rearanżacje genów dla TcR (d, g) i Ig (H, k) - powstają na skutek rearanżacji segmentów V, C, J tych genów

• specyficzność dla klonu białaczkowego - swoistość dla pacjenta

• brak stabilności podczas trwania choroby (oligoklonalność, ewolucja klonalna) - możliwość wyników fałszywie ujemnych konieczne badanie jednocześnie kilku markerów

Znaczenie monitorowania MRD

1) Wczesna ocena efektywności leczenia

• Ocena szybkość i stopnia odpowiedzi na leczenie

• MRD - wskaźnik chemiowrażliwości komórek białaczkowych

2) Podstawa do ustalenia dalszej terapii

• Wysoki poziom MRD - wskazanie do zmiany chemioterapeutyku / intensyfikacji chemioterapii.

• Niski poziom MRD - odstąpienie od dalszej chemioterapii, uniknięcie groźnych dla życia powikłań leczenia cytostatykami.

3) Czynnik prognostyczny

• Poziom MRD ściśle koreluje z przeżywalnością.

• Pozwala na podział pacjentów na grupy o różnym ryzyku nawrotu i różnym prawdopodobieństwie długotrwałej remisji.

4) Możliwość przewidzenia nawrotu (do 6 miesięcy)

Przykładowa krzywa monitorowania AML za pomocą MLL-PTD w trzech pacjentów po zastosowaniu standardowej chemioterapii.

---