Wykład 12

Analiza toksykologiczna materiału biologicznego i próbek środowiskowych

Cele i zadania analizy toksykologicznej

• Wykrywanie , identyfikacja i oznaczanie ilościowe naturalnych i syntetycznych związków chemicznych wykazujących szkodliwy wpływ lub działanie toksyczne na organizm żywy

• Cel ogólny

• udział w ochronie zdrowia człowieka i czystości środowiska

• realizowany przez wczesne wykrywanie występowania szkodliwości chemicznych, niebezpieczeństwa powstawania zatruć oraz wykrywania zatruć już zaistniałych

Rodzaje badań w analizie toksykologicznej

• badanie jakościowe - wykrywanie i identyfikacja (informują o rodzaju szkodliwości, narażenia lub zatrucia)

• badania ilościowe (pozwalają na określenie stopnia skażenia, narażenia lub ciężkości zatrucia)

• badanie ukierunkowane na określoną substancje lub substancję z określonej grupy

• badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji

Dane, których dostarcza analiza toksykologiczna pozwalają na:

- ustalenie przyczyny zatrucia (przyżyciowe i po śmierci)

- ocenę narażenia zawodowego na substancje toksyczne (przemysł, rolnictwo)

- ocenę rodzaju i intensywności zanieczyszczenia i/lub potencjalnego zagrożenia środowiska przez związki chemiczne

- ocenę szkodliwości związków chemicznych i produktów je zawierających -----są wykorzystywane do celów medycznych, administracyjnych i prawnych

- opracowanie metodyk, często indywidualnie dla konkretnego przypadku skażenia, narażenia lub zatrucia

Kierunki analizy toksykologicznej

• Analiza toksykologiczna sądowa

• Analiza kliniczno-toksykologiczna

• badanie materiału biologicznego do celów diagnostyki zatruć

• monitorowanie stężenia trucizn w płynach ustrojowych w przebiegu leczenia zatruć

• Analiza toksykologiczna środowiskowa

• kontrola zanieczyszczenia środowiska ogólnego (powietrze, woda, gleba, opady, ścieki, flora, fauna, żywność)

• oznaczanie w materiałach środowiskowych stężenia zanieczyszczających je związków chemicznych oraz produktów ich degradacji lub biotransformacji środowiskowej

• kontrola chemizacji w rolnictwie:

• oznaczanie pozostałości pestycydów w środowisku i płodach rolnych

• określenie dynamiki zanikania pestycydów w płodach rolnych

• Analiza toksykologiczna przemysłowa

• ocena narażenia zawodowego na substancje toksyczne

• kontrola zatruć w przemyśle

• monitoring środowiska pracy (NDS, NDSCh, NDSP)

oznaczanie stężeń substancji w powietrzu na stanowiskach pracy

• monitoring biologiczny celem określenia biologicznych skutków narażenia

Oznaczanie:

• stężenia substancji toksycznych i/lub metabolitów

• produktów patologicznych powstałych w ustroju w wyniku działania substancji toksycznych (np. HbCO przy zatruciu CO, MetHb przy związkach methemoglobinotwórczych)

• poziomów niektórych związków endogennych lub aktywności enzymów (np. AchE przy insektycydach fosforoorganicznych i karbaminianowych, stężenie ALA w moczu przy Pb)

• Analiza substancji toksycznych (wykrywanie, identyfikacja, oznaczanie) prowadzone:

• dla celów badawczo - naukowych, wypracowywania nowych metodyk stanowiących zabezpieczenie metodyczne toksykologii doświadczalnej

• jako badanie dowodów rzeczowych

• leki

• chemikalia użytkowane w przemyśle, rolnictwie, gospodarstwie domowym

• żywność i napoje

• przedmioty różne (opakowania po chemikaliach, odzież, strzykawki, igły)

• Wykrywanie i kontrola

• toksykomanii - w tym narkomanii

• dopingu w sporcie

• kontrola u kierowców leków ograniczających sprawność psychofizyczną

Specyfika analizy toksykologicznej

• Różnorodność prób do badań

• zróżnicowany materiał

• materiał biologiczny - roślinny, zwierzęcy oraz ludzki

• próbki środowiskowe - woda, powietrze, gleba, opady, rośliny

• przedmioty użytkowe - żywność, leki, opakowania

• różny stan skupienia prób (gazowe, ciekłe, stałe)

• różna budowa chemiczna substancji (zw. org. i nieorganiczne, naturalne i syntetyczne)

• substancje o różnych właściwościach toksykodynamicznych

• związki czyste oraz ich różne formy użytkowe (leki, pestycydy, chemikalia gospodarstwa domowego, przemysłowe i rolnicze)

• Konieczność wykrywania, identyfikacji i oznaczania niewielkiej ilości substancji chemicznej w dużej masie badanych prób

• Obecność w analizowanej próbie jednej lub kilku substancji toksycznych z tej samej lub różnych grup chemicznych

• Występowanie w analizowanej próbie obok substancji toksycznej produktów jej biotransformacji lub produktów rozkładu materiału biologicznego oraz produktów degradacji środowiskowej - substancje te mogą interferować w analizie. Leki oraz substancje czynne z używek (kofeina, nikotyna) mogą utrudniać analizę

• Ilość materiału jest często ograniczona (brak możliwości powtórzenia oznaczeń)

• Czas na wykonanie może być bardzo krótki (np. diagnostyka zatruć ostrych)

• Konieczność odpowiedniego zabezpieczenia prób do badań na czas transportu (przed rozmyślnym zniszczeniem lub zafałszowaniem oraz niezamierzoną pomyłką) i odpowiednio przechowywane

• Konieczność stosowania szkła i odczynników o wysokiej czystości (np. spektralnie czyste kwasy i wzorce metali do AAS, rozpuszczalniki do HPLC)

Rodzaje materiału do badań

Zatrucia ostre przyżyciowe

• Mocz

• Krew - krew pełna, osocze, erytrocyty

• Zawartość żołądka - odessana treść pokarmowa, popłuczyny, wymiociny

Zatrucie ostre śmiertelne

• Mocz z pęcherza

• Krew

• Tkanki i narządy wewnętrzne pobrane na sekcji zwłok

• żołądek z zawartością, jelito cienkie z zawartością, okrężnica z zawartością

• wątroba i woreczek żółciowy - płuca

• nerki - serce

• śledziona - kości

• mózg - macica, pochwa

• odbytnica, pęcherz - wycinki skóry

Zatrucie przewlekłe oraz do celów monitoringu uzależnienia, narażenia zawodowego i środowiskowego

• mocz

• krew

• włosy, paznokcie (np. As)

• slina (np. kotynina, kokaina, heroina, metadon, amfetamina)

materiały dodatkowe

• resztki żywności

• leki

• opakowania

• części garderoby

• różne przedmioty użytkowe

• powietrze w miejscu zatrucia (przy zatruciach inhalacyjnych)

Zasady doboru materiału do badań

Rodzaj materiału do badań zalezy od rodzeju rozwiązywanego problemu (rodzaj narażenia, kierunku prowadzonych badań), stosowanych metod analitycznych

• badanie ukierunkowane - materiał, w którym substancja toksyczna występuje w najwyższym stężeniu w stanie niezmienionym oraz materiał, w którym można wykryć metabolity substancji (potwierdzenie rozpoznania)

• badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji - różnorodny materiał pozwalający wykryć substancje z różnych grup analitycznych

• do celu toksykologii przemysłowej - wg. obowiązujących norm i przepisów prawnych

• do celów toksykologii sądowej - wg. obowiązujących zaleceń odnośnie podziału materiału i dla badania analitycznego, sposobu i czasu jego przechowywania do kontrekspertyzy

• właściwości fizykochemiczne substancji toksycznej, skażenia

• losy substancji toksycznej w organizmie lub zanieczyszczenia w środowisku

• materiał biologiczny (ludzie zwierzęta)

• kinetyka wchłaniania

• zdolność kumulacji

• kierunki i szybkość biotransformacji

• próby środowiskowe

• trwałość i zdolność substancji do przemieszczania się w środowisku

• degradacja środowiskowa pod wpływem warunków atmosferycznych

• biotransformacja środowiskowa z udziałem bakterii, drożdży i grzybów

Podział materiału do badań

Zasady podziału

• badania ukierunkowane - zabezpieczenie prób do:

• wykrycia objętej poszukiwaniem substancji lub grupy substancji

• wykonanie oznaczenia ilościowego

• powtórzenia prób

• badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji (pełna analiza toksykologiczna) - zabezpieczenie materiału do:

• poszukiwania substancji ze wszystkich grup analitycznych

• wykonania oznaczenia ilościowego z oddzielnej porcji materiału

• powtórzenia prób

• kontrekspertyzy

Tok postępowania w analizie toksykologicznej

• pobranie i przygotowanie próby do badania

• wykonanie prób wstępnych i testów skryningowych bezpośrednio w materiale biologicznym

• izolowanie wstępne (dla nielotnych trucizn organicznych)

• oczyszczanie, zagęszczanie

• podział na podgrupy

• wykrywanie - grupowe (jest - nie ma) i szczegółowa identyfikacja

• oznaczanie ilościowe (najczęściej z oddzielnej porcji materiału)

• ocena i interpretacja wyników

Podział analityczny trucizn na grupy

• trucizny lotne i gazowe

• nielotne trucizny organiczne (tzw. Trucizny ekstrakcyjne)

• trucizny metaliczne

• trucizny dializujące

• różne o indywidualnych metodach izolowania

Metody analityczne w analizie toksykologicznej

Chemiczne

• badania wstępne

• organoleptyczne

• makroskopowe i mikroskopowe

• spławianie

• w rurce do prażenia

• na węglu

• na perle boroksowej

• w płomieniu

• pienienia

• identyfikacyjne reakcje barwne

• z odczynnikiem specyficznym

• z odczynnikami grupowymi

• metody scriningowe

• chemiczne i fizykochemiczne

• biologiczne

• botaniczne

Aparaturowe

• metody spektralne

• emisyjne

• absorpcyjne (UV -VIS, IR,AAS)

• metody chromatograficzne

• TLC, HPLC, GC/MS

• Elektroforeza

• Fluorymetria

• NMR

• Neuronowa analiza aktywacyjna

• Polarografia

• Metody izotopowe

• Elektrochemiczne (elektrody jonoselektywne)

• Immunologiczne

• EMIT (immunoenzymatyczne)

• RIA (radioimmunologiczne)

• FIA (właściwości fluorescencyjne)

• HI (oparta na aglutynacji)

• FRAT (oparta na wolnych rodnikach)

Analiza trucizn lotnych i gazowych

• Związki organiczne

• alkohole

• aldehydy

• ketony

• estry

• węglowodory alifatyczne, aromatyczne, aminowe i nitrowe pochodne węglowodorów

• kwasy organiczne (np. salicylowy, mrówkowy, octowy, benzoesowy )

• fenole i wielofenole

• disiarczek węgla

• związki nieorganiczne

• tlenek węgla

• fosfor

• cyjanki, żelazo - i żelazicyjanki

• lotne sole niektórych metali oraz fungicydy metaloorganiczne (np. Sn- organiczne, Hg -organiczne)

Analiza trucizn lotnych i gazowych

Metody izolacji

• destylacja z parą wodną (np. fenol z moczu)

• metody oparte na zjawisku dyfuzji

• odparowanie (izolacja etanol w metodzie Widmarka - roztwór K2Cr2O7 w H2SO4)

• mikrodyfuzja (cyjanki - roztwór NaOH, chloroform - toluen)

• technika „head - space”

• Aeracja (wymywanie strumieniem gazu obojetnego np. izolacja CS2 z krwi)

Metody identyfikacji i oznaczania

• Chromatografia gazowa (+ izolacja techniką „head - space” ; detekcja - spekrometria masowa)

• metoda uniwersalna w badaniach skryningowych przy poszukiwaniu nieznanej substancji toksycznej oraz w badaniach ukierunkowanych

• metody spektralne

• metody miareczkowe (np. metoda widmarka)

• grupowe i specyficzne testy i reakcje chemiczne - do celów jakościowych

Nielotne trucizny organiczne

nielotne związki organiczne izolowane przez ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi („trucizny ekstrakcyjne”)

ok. 90% wszystkich potencjalnie szkodliwych związków chemicznych

• leki

• pestycydy

• chemikalia przemysłowe i stosowane w gospodarstwie domowym, kosmetyki, substancje dodawane do żywności

• związki naturalne i syntetyczne

• związki zasadowe, kwaśne, obojętne i amfoteryczne

Analiza nielotnych trucizn organicznych

Metody izolacji i oznaczania

etap	Materiał	Czynność	Efekt
I. Izolowanie wstępne	-sekcyjny -ekshumacyjny -żywność (tłusta) -treść żołądka (tłusta) -krew pełna -mocz patologiczny niektóre formy leków	-macerowanie kwaśnym płynem wodno-alkoholowym -oczyszczanie wyciagu	Kwaśny, wodny oczyszczony roztwór
II. Izolowanie właściwe	-z zatruć przyżyciowych -kwaśny wodny roztwór po izolacji wstępnej -niektóre formy leków	- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi	Wyizolowanie substancji toksycznej i podział na podgrupy

Metody ekstrakcji

• ciecz - ciecz

• ekstrakcja eterem dietylowym ze środowiska kwaśnego (dla substancji kwaśnych i obojetnych)

• ekstrakcja chloroformem ze środowiska amoniakalnego (dla substancji zasadowych i amfoterycznych)

• ciecz - ciało stałe (SPE)

Metody oznaczania

• metody chromatograficzne

• chromatografia cienkowarstwowa TLC

• chromatografia cieczowa HPLC/MS

• chromatografia gazowa GC/MS

• metody instrumentalne

• spektrofotometria UV i VIS

• spektrofluorymetria

• immunologiczne

• metody chemiczne

• metody fizyczne

• metody biologiczne

Analiza trucizn metalicznych

• metale

• metaloidy

• pary metali

• związki metaloorganiczne (fungicydy SN- Hg- organiczne, tri- i tetraetylek Pb)

metody izolacji

• mineralizacja

• na sucho

• na mokro

• solubilizacja

• trawienie Soluenem - VI -rzędowa sól amoniowa zmydla materiał biologiczny w środowisku alkalicznym

• maceracja w 1M buforze TRIS - trawienie enzymatyczne przy użyciu alkalicznej proteazy

metody oznaczania

• spekrometria atomowo - absorpcyjna AAS

• spektrofotometria płomieniowo - emisyjna

• spektrografia

• polarografia (Pb, Zn, Cd)

• metody elektrochemiczne - elektrody jonoselektywne

• neuronowa analiza aktywacyjna

• reakcje charakterystyczne dla poszczególnych metali (z odczynnikiem kompleksującym np. ditizon, ditiokarbaminian sodu)

Trucizny dializujące

• substancje rozpuszczalne w wodzie

• kationy, aniony

• kwasy i zasady (kwas siarkowy, azotowy, solny)

• sole (szczawiany, chlorany, bromki, jodki)

metody izolacji

• przechodzenie do wyciągów wodnych

• dializa

• elektrodializa

metody identyfikacji i oznaczania

• reakcje barwne i z odczynnikami osadowymi

• metody spektrofotometryczne

• metody elektrochemiczne

Interpretacja wyników badań

Właściwa interpretacja wyników

• konieczność uwzględnienia

• poziomów fizjologicznych (np. fenolu w moczu)

• stężeń normalnych metali toksycznych (np. Pb, Cd)

• dopuszczalnych stężeń biologicznych

• stężeń terapeutycznych (leki)

• stężeń toksycznych

• stężeń śmiertelnych

Kontrola jakości oznaczeń

• zasady dobrej praktyki laboratoryjnej (DPL)

• walidacja metod analitycznych (wykazanie prawidłowości wyboru metody do celu, któremu służy)

---