LABORATORIUM Z BIOCHEMII

ćwiczenie nr 1

Temat: KWASY NUKLEINOWE

Wtorek 8¹⁵-12⁰⁰

Opiekun grupy :

Dr inż. A. Bujacz Marta Wujek

Aleksandra Kosiorek

Przemysław Woiński

Wstęp

Kwasy nukleinowe to wielocząsteczkowe polimery nukleotydów.

Wyróżniamy dwa kwasy: rybonukleinowe (RNA) oraz deoksyrybonukleinowe (DNA).

DNA ma postać podwójnej helisy. Zbudowany jest z dwóch łańcuchów nukleotydów, które biegną w przeciwnych kierunkach. Nukleotydy w DNA zawierają cukier deoksyrybozę i jedną z czterech zasad: adeninę(A), tyminę (T), cytozynę(C) oraz guaninę (G). Łańcuchy polinukleotydowe połączone są ze sobą wiązaniami wodorowymi między parami komplementarnych zasad (ilościowo: A = T i C ≡ G) i skręcone spiralnie.

RNA zbudowany jest zwykle z jednego łańcucha nukleotydów, ale w jego obrębie mogą występować odcinki podwójnej helisy, powstałe także dzięki wiązaniom wodorowym między parami komplementarnych zasad, z tym że zamiast tyminy występuje w RNA uracyl (U). Istnieje kilka rodzajów RNA, z których najważniejsze to: mRNA (informacyjny), tRNA (transportujący), rRNA(rybosomalny).

Kwasy nukleinowe odpowiadają za przechowywanie i przekazywanie informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów.

Nukleotyd jest podstawową jednostką strukturalną kwasów nukleinowych. Zbudowany jest z trzech podstawowych składników:

> pentozy (cukier zbudowany z 5 atomów C) - D-ryboza lub 2-deoksy-D-ryboza

> zasady azotowej - purynowej lub pirymidynowej

> reszty kwasu fosforowego.

1.Cukier występujący w kwasach nukleinowych jest pentozą należącą do aldoz. Wśród aldo-pentoz istnieje szereg izomerów przestrzennych. Pentoza występująca w kwasach nukleinowych jest rybozą.

W RNA ryboza występuje w formie niezmienionej, natomiast w DNA składnikiem cukrowym jest ryboza pozbawiona atomu tlenu przy węglu drugim cząsteczki, czyli deoksyryboza. Przykłady przedstawiam poniżej:

2.Zasada azotowa to związek organiczny posiadający skomplikowaną budowę cykliczną, zawierający w swoim składzie atomy azotu. Wymienia się 5 rodzajów zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych.

Dzieli się je na 2 grupy:

• zasady purynowe (pochodne heterocyklicznego związku puryny)

• zasady pirymidynowe (pochodne heterocyklicznego związku pirymidyny)

Przeprowadzone doświadczenia

1.Rozpuszczalnosć kwasów nukleinowych.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było badanie rozpuszczalności kwasów nukleinowych.

Opis wykonywanych czynności:

a)Do probówki zawierającej 0,5 ml 0,1% roztworu DNA dodawaliśmy kroplami 1M kwasu solnego, aż do momentu wytrącenia się osadu. Następnie dodawaliśmy również kroplami roztwór NaOH, który rozpuścił wcześniej wytrącony osad. Próbę wykonaliśmy także dla 0,1% roztwory RNA.

b)Do probówki zawierającej 1ml 0,1% roztworu DNA dodaliśmy 2ml 96% etanolu. Próbę wykonaliśmy również dla 0,1% roztworu RNA.

Obserwacje:

a)Podczas doświadczenia w probówce wytworzył się biały osad, który rozpuścił się po zalkalizowaniu.

b)Podczas doświadczenia w probówce z DNA i RNA wytrącił się biały osad.

Wnioski:

a) DNA i RNA jako kwasy nukleinowe nie rozpuszczają się w kwasach o czym świadczy powstanie osadu po dodaniu do probówek kwasu solnego, natomiast rozpuszczają się w środowisku alkalicznym - o czym świadczy rozpuszczenie się osadu po dodaniu NaOH.

b) W próbie z etanolem powstanie białego osadu dowodzi, iż kwasy nukleinowe dobrze wytrącają się w obecności alkoholi.

2.Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było uzyskanie hydrolizatów DNA i RNA, które służyły nam do dalszych doświadczeń.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki wlaliśmy 2,5 ml 1% roztworu DNA oraz 2,5 ml 10% H₂SO₄, a następnie ogrzewaliśmy mieszaninę we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę. Doświadczenie wykonaliśmy także dla 1% roztworu RNA.

Po godzinie ogrzewania mogliśmy wykonywać następujące doświadczenia.

2.1. Reakcja orcynolowa.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było wykrycie pentoz w hydrolizatach kwasowych.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 1ml hydrolizatu RNA dodaliśmy 1ml odczynnika orcynolowego (zawierającego orcynę, stężony HCl oraz FeCl₃), a następnie ogrzewaliśmy przez 15 minut. Po upływie danego czasu ostudziliśmy mieszaninę.

Reakcje przeprowadziliśmy również dla hydrolizatu DNA, 0,1% roztworu DNA, 01,% roztworu RNA, 1% roztworu rybozy oraz 1% roztwory deoksyrybozy.

Obserwacje:

Po wykonaniu doświadczenia we wszystkich próbach powstały kompleksy o różnym odcieniu barwy zielonej.

Wnioski: Pentozy wolne (ryboza i deoksyryboza) oraz związane w nukleozydach (RNA i DNA) pod wpływem ogrzewania ze stężonym HCl przechodzą w furfural, który wraz z orcyną, katalizowany jonami Fe3+, tworzy trwały kompleks o zielonym zabarwieniu.

2.2.Reakcja Dischego.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było odróżnienie DNA od RNA.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 1 ml hydrolizatu RNA dodaliśmy 2 ml odczynnika difenyloaminowego , a następnie ogrzewaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Reakcje przeprowadziliśmy również dla hydrolizatu DNA, 0,1% roztworu DNA, 01,% roztworu RNA, 1% roztworu rybozy oraz 1% roztwory deoksyrybozy.

Obserwacje:

W probówce z roztworem DNA i roztworem deoksyrybozy pojawiła się niebieski osad. W przypadku roztworu RNA i rybozy zabarwienia nie było.

Wnioski: Deoksyryboza i DNA w którym jest ona związana uległo barwnej reakcji z difenyloaminą dając niebieskie zabarwienie co odróżnia ją od rybozy. Ta barwna reakcja jest konsekwencją powstania aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem działania kwasu siarkowego i octowego (zawartych obok difenyloaminy w odczynniku difenyloaminowym).

2.3.Wykrywanie kwasu fosforowego.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było wykrycie kwasu fosforowego obecnego w kwasach nukleinowych.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 0,5 ml hydrolizatu DNA dodaliśmy 3 krople stężonego amoniaku w celu zobojętnienia. Następnie dodaliśmy 0,5 ml stężonego HNO₃ i 2 ml molibdenianu amonowego. Mieszaninę ogrzewaliśmy do wrzenia. Próbę wykonaliśmy dodatkowo dla hydrolizatu RNA.

Obserwacje:

Po wykonaniu doświadczenia w probówkach z roztworem RNA i DNA wytrącił się żółty osad.

Wnioski: Wytrącił się żółty osad fosfomolibdenianu amonowego co świadczy o obecności fosforanów w badanej próbie.

3.Wykrywanie zasad purynowych.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było wykrycie zasad purynowych obecnych w kwasach nukleinowych, tworzących sole z metalami ciężkimi takimi jak Ag⁺, lub Cu⁺.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 1 ml hydrolizatu DNA dodaliśmy 6 kropli stężonego amoniaku i 3 ml azotanu srebra. Po wytraceniu osadu dodaliśmy amoniaku w celu rozpuszczenia osadu. Nie wiem czy to robiliśmy. niestety też tego nie pamiętam ale trza założyć że wszystko zrobiliśmy jak należy ;p.

Obserwacje:

Po wykonaniu doświadczenia powstał biały osad, który się nie rozpuszczał w amoniaku.

Wnioski: Zasady azotowe reagują z jonami Ag⁺ tworząc nierozpuszczalne w amoniaku sole srebrowe puryn.

4.Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było oznaczenie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną, w kostkach bulionowych(?).

Opis wykonywanych czynności:

Do kolby odważyliśmy 5 g kostki bulionowej i dodaliśmy 75 ml wody. Mieszaninę gotowaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Po przestudzeniu roztwór przesączyliśmy przez gazę młyńską do 100 mililitrowej kolby i dopełniliśmy wodą destylowaną do kreski. Po dokładnym wymieszaniu mieszaninę ponownie sączyliśmy , ale przez sączek bibułowy. Przed wykonaniem pomiaru badany roztwór rozcieńczyliśmy 20-krotnie 0,1M kwasem solnym. Następnie za pomocą spektrometru wykonaliśmy pomiar absorbancji dla adeniny przy 262 nm i 290 nm, a dla guaniny przy 249 nm i 290 nm.

Obserwacje:

Wnioski:

5'

---