Laboratorium biotechnologii

Poniedziałek 8 ¹⁵ - 12 ⁰⁰

Ćwiczenie 2

Biosynteza α-amylazy bakteryjnej w hodowli wstrząsanej

1. Wstęp teoretyczny

Hodowla wgłębna - prowadzimy ją zawsze w płynnym podłożu, wzrost drobnoustrojów odbywa się w całej masie podłoża. Zapewniaja jednakowy dostęp każdej komórki do tlenu, składników pożywki, jednakową temperaturę oraz pH w każdym punkcie. Pozwala na optymalne warunki wzrostu i wytworzenia produktu, co daje większą wydajność niż w metodzie powierzchniowej.

Zalety hodowli wgłębnych:

• Łatwiejsze utrzymywanie czystości mikrobiologicznej

• Lepszy kontakt drobnoustrojów

• Lepsze natlenienie

• Łatwiejsze wydzielenie produktu

• Jednorodność warunków w całym podłożu

• Większa możliwość automatyzacji

• Większa wydajność

Wady:

• Duży koszt aparatury

• Większa energochłonność

Hodowla wstrząsana - typ hodowli wgłębnej, polega ona na ciągłym wstrząsaniu hodowli w czasie inkubacji. Wykorzystywana jest przede wszystkim jako hodowla kontrolna, do badania i powielania prób. Stanowi także etap namnażania materiału posiewowego, rzadko zaś jest hodowlą produkcyjną. Wyjściowym warunkiem w opracowaniu procesu produkcji enzymu jest znalezienie wysokowydajnego szczepu mikroorganizmów, co w praktyce technologicznej oznacza właściwe przygotowanie inokulum. Odbywa się to w kilku etapach:

Szczep na skosie -> kolba wstrząsana -> fermentor propagacyjny -> fermentor produkcyjny

Podstawowymi parametrami takiego procesu są:

• pH środowiska

• temperatura

• stopień napowietrzenia

• szybkość mieszania

Ze względu na szerokie spektrum zastosowania amylaz w przemyśle, enzymy te produkuje się na skalę przemysłową. W tym celu wykorzystuje się produkcję amylaz w różnorodnych kulturach bakteryjnych oraz grzybiczych. Bakteryjne amylazy są bardziej odporne na zmiany temperatury niż grzybicze.

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie podstawowych operacji przygotowania i prowadzenia procesu biosyntezy enzymu w hodowli wgłębnej (wstrząsanej) drobnoustrojów oraz ocena wpływu wybranych parametrów (skład podłoża) na wydajność procesu.

3. Tabela

1. Tabela przedstawiająca grupowe wyniki doświadczenia

Numer grupy	Stężenie laktozy w podłożu
		0,5%		1,0%		2,0%		3,0%
		Aktywność	Biomasa	Aktywność	Biomasa	Aktywność	Biomasa	Aktywność	Biomasa
1	176	0,380	317	0,579	608	0,804	642	1,102
2	198	0,296	379	0,536	737	0,736	710	0,999
3	117	0,27	179	0,44	494	0,61	338	0,83
4	163	0,33	263	0,56	465	0,80	433	1,07
5	164	0,30	292	0,48	448	0,7	402	0,94
6	170	0,35	314	0,57	538	0,81	466	1,06
7	203	0,3	403	0,47	707	0,73	766	0,954

4. Metodyka

1. Oznaczenie aktywności α-amylazy

Wykorzystano ciecz po hodowli Bacillus licheniformis. Szczep uprzednio aktywowano i inkubowano przez 24 h w temperaturze 39°C.

Otrzymano 4 ciecze z następującą początkową zawartością laktozy w pożywce:

0,5%, 1%, 2%, 3%.

Dokonano następujących rozcieńczeń:

• roztwór 0,5% rozcieńczono 100 razy

• roztwór 1% rozcieńczono 200 razy

• roztwór 2% rozcieńczono 400 razy

• roztwór 3% rozcieńczono 400 razy

Do 5 probówek dodaliśmy po 0,5 ml 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej. Następnie do 4 probówek dodaliśmy po 0,5 ml cieczy rozcieńczonych (z enzymem), a do ostatniej dodaliśmy 0,5 ml wody destylowanej (próba kontrolna). Próby inkubowaliśmy 3 minuty w temperaturze pokojowej, po czym dodaliśmy do każdej po 1 ml kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS). Następnie próby inkubowaliśmy przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po inkubacji objętość probówek uzupełniliśmy do objętości 10 ml (dodano po 8 ml wody destylowanej). Zmierzyliśmy absorbancję tak przygotowanych roztworów (dł. fali 540 nm), a następnie za pomocą krzywej wzorcowej obliczyliśmy aktywność enzymu.

Aktywność enzymu ma być podana w µmolach grup redukujących (w przeliczeniu na maltozę) uwolnionych z substratu (1% roztworu skrobi) w ciągu 1 minuty przez 1 ml preparatu enzymatycznego [µmol/min*ml], czyli U/ml.

Tabela 2. Zbliżone wartości absorbancji aktywności enzymu

Zawartość laktozy w pożywce [%]	0,5	1	2	3
Absorbancja A540
gr. I	0,44	0,396	0,38	0,401
gr. II	0,495	0,473	0,461	0,444
gr. III	0,293	0,223	0,309	0,211
gr. IV	0,408	0,329	0,291	0,271
gr. V	0,41	0,365	0,28	0,251
gr. VI	0,425	0,3925	0,336	0,291
gr. VII	0,508	0,504	0,442	0,478

Następnie zgodnie z definicją podaną wyżej obliczono aktywność wg wzoru:

A= A₅₄₀ * 2 * R /( t * a)

A₅₄₀ - absorbancja mierzona wobec próby kontrolnej przy 540 nm

2 - przeliczenie na 1ml enzymu

R - rozcieńczenie płynu pohodowlanego

t - czas reakcji enzymatycznej - 3 minuty

a - współczynnik kierunkowy krzywej wzorcowej (0,1689ml/µmol)

Przykład obliczeniowy dla gr.7, 0,5% laktozy:

A _0,5% = 0,508*2*100/(3*0,1689) = 115,45 = 115 (µmol/min*ml)

Wyniki zebrano w tabeli 3 oraz obliczono średnie aktywności dla poszczególnych zawartości laktozy w pożywce:

Tabela 3. Obliczone aktywności enzymu

Zawartość laktozy w pożywce [%]	0,5	1	2	3
Aktywność [µmol/min*ml]
gr. I	174	313	600	634
gr. II	195	374	727	701
gr. III	115	177	487	334
gr. IV	161	260	459	427
gr. V	162	288	442	397
gr. VI	168	310	531	460
gr. VII	200	398	698	756
Średnia*	166	309	504	697

1. Oznaczenie wzrostu biomasy.

Wzrost szczepu można określić za pomocą metody pośredniej (uproszczonej). Wykonaliśmy to przez pomiar zmętnienia zawiesiny hodowlanej (cieczy pohodowlanej) po rozcieńczeniu pobranej próbki w stosunku 1:20. Pomiar wykonaliśmy się na spektrofotometrze przy długości fali λ=535 nm, stosując jako próbę kontrolną wodę.

Tabela 4. Wyniki pomiaru wzrostu biomasy

Zawartość laktozy w pożywce [%]	0,5	1	2	3
Ekstynkcja E535
gr. I	0,380	0,579	0,800	1,102
gr. II	0,296	0,536	0,736	0,999
gr. III	0,270	0,440	0,610	0,850
gr. IV	0,330	0,560	0,800	1,070
gr. V	0,300	0,480	0,700	0,948
gr. VI	0,350	0,570	0,810	1,060
gr. VII	0,300	0,470	0,730	0,954
Średnia*	0,299	0,512	0,775	0,998

	Biomasa
0,5 % laktozy	5,98
1 % laktozy	10,24
2 % laktozy	15,5
3 % laktozy	19,96

Zmierzone wartości pomnożono przez 20 (współczynnik wynikający z rozcieńczenia prób)

Tabela 5. Wartość ilości biomasy

5. Wykres zależności stężenia laktozy na produkcję biomasy i aktywności α-amylazy

6. Wnioski:

Otrzymane prawidłowe wyniki pokazują że zwiększanie stężenia laktozy powoduje do pewnego momentu wzrost aktywności enzymu. Najwyższą wartość aktywności α-amylazy wykazano przy 2% zawartości laktozy po jej przekroczeniu zaobserwowano spadek aktywności enzymu. Optymalnym stężeniem laktozy dla działania α-amylazy jest wiec ta wartość, lecz nie możemy bardziej dokładniej wyznaczyć tą daną z uwagi na spektrum dobranych stężeń. Zależność tę obrazują tylko wyniki grupy 8, w reszcie grup wyniki są nieprawidłowe. Wyniki otrzymano zawyżone, jednak są one najbardziej zbliżone do idealnej zależności. Badanie wzrostu biomasy wykazuję że ze zwiększeniem stężenia laktozy wzrasta także zmętnienie cieczy pohodowlanej.