Ćwiczenie H

HYDROLIZA ENZYMATYCZNA BIAŁKA

Cele ćwiczenia

Poznawczy - Obserwacja i porównanie postępu reakcji hydrolizy białka katalizowanej przez neutralny zestaw trzustkowych enzymów proteolitycznych w obecności i nieobecności białkowego inhibitora z soi.

Metodyczny - Zapoznanie się z jedną z najpopularniejszych metod oznaczania stężenia białka i peptydów - Metodą Lowry'ego.

Tabela - wartość absorbancji próbek

Nr próbki		Czas reakcji [min]	A750nm
E	E+I			E	E+I
1	8	0	odnośnik	odnośnik
2	9	7	0,392	0,079
3	10	14	0,509	0,142
4	11	21	0,535	0,189
5	12	28	0,539	0,215
6	13	35	0,546	0,246
7	14	42	0,541	0,280

Analiza wykresu, wnioski

Wartości absorbancji próbek „E” (enzym bez inhibitora) oraz „E+I” (enzym z inhibitorem) rosną wraz ze wzrostem czasu inkubacji. Próbki inkubowane były w różnych czasach od 0 do 42 minut (odstęp 7 minut). Absorbancja zależna jest od stężenia, zatem im większa, tym stężenie produktu w próbce wyższe. Po takim samym czasie inkubacji próbki z inhibitorem (E+I) mają znacznie mniejsze wartości absorbancji, niż próbki bez inhibitora (E). Inhibitor sojowy zmniejsza szybkości reakcji hydrolizy enzymatycznej.

Inhibitor z soi hamuje enzymy proteolityczne, wchodzące w skład pankreatyny, w tym trypsynę i chymotrypsynę, natomiast nie ma wpływu na elastazę oraz karboksypeptydazę. W ten sposób umożliwia on tym enzymom aktywność w obecności inhibitora. Aktywność ta jest jednak znacznie obniżona (inhibitor sojowy hamuje trypsynę, która jest z kolei aktywatorem wszystkich proteaz trzustkowych). Aktywacja pozostałych proenzymów zostaje częściowo wstrzymana, co powoduje obniżenie stężenia aktywnych enzymów, a co za tym idzie, obniża sprawność pankreatyny. Zjawisko niecałkowitego zahamowania aktywności pankreatyny przez inhibitor sojowy spowodowane jest występowaniem w tym przypadku inhibicji kompetycyjnej oraz mieszaniny enzymów.

Wyniki są zgodne z oczekiwaniami. Cel ćwiczenia został zrealizowany, została zaobserwowana wyraźna różnica absorbancji w próbkach z enzymem w obecności i nieobecności inhibitora sojowego.

---