OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PSII.

Wstęp:

PSII-inaczej fotosystem II.Jest to jeden z dwóch kompleksów barwnikowo-białkowych aparatu fotosyntetycznego. PSII działa z maksymalną wydajnością przy długości fali 680 nm. Fotoukład PSII występuje głównie w tylakoidach gran. Charakterystyczne dla fotoukładu II są układy antenowego określane nazwą - LHC II, w których stosunek chlorofilu a do chlorofilu b wynosi: a:b = 1:1. PSII katalizuje indukowane światłem przeniesienie elektronów z utlenionej cząsteczki wody (donora) na pulę plastochinonu rozpuszczalnego w dwuwarstwie lipidowej chinonu. Aktywnośc PSII można zdefiniowac jako ilośc elektronów przeniesionych z wody na plastochinon w jednostce czasu , przeliczoną na jednostkę masy chlorofilu w próbce.

Wykonanie:

• Przed przystąpieniem do oznaczania aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę, wykonano izolację błon tylakoidów z liści sałaty zgodnie z instrukcją zawartą w rozdziale 9.1 (,,Praktikum z biochemii” pod zbiorową redakcją Amalii Guzdek i Pawła Maka).

• Po wyizolowaniu błon tylakoidów przystąpiono do oznaczenia zawartości chlorofilu w zawiesinie:

• Po dokładnym wymieszaniu zawiesiny tylakoidów uzyskanej wcześniej, odpipetowano po 400 mikrolitrów tej zawiesiny do przygotowanych wcześniej 2 probówek typu Eppendorf.

• Do każdej dodano po 1600 mikrolitrów acetonu

• Odwirowano je przez 5 minut(10000 obr./min.), a następnie zmierzono absorbancję wzgledem 80% acetonu przy 3 długościach fali: 645, 663, 710 ( poziom tła).

• Wyniki zestawiono W tabeli numer 1.

Tabela nr.1

Długośc fali	Wynik pomiaru absorbancji
645	0,462
663	1,114
710	-0,013

Następnie obliczono stężenie chlorofilu a i b.

Stężenie chlorofilu a i b:

C_{Chl (a+b)} = 20,2 (A645-A710) + 8,02(A663-A710)

CChl (a+b) = 20,2 * (0,462+0,013) + 8,02 *(1,114+0,013)=18,63354 μg/ml masy

Przystąpiono do oznaczania aktywności PSII.

• Przygotowaną wcześniej zawiesinę błon tylakoidów, rozcieńczono buforem 10 mM Tricyna-NaOH pH 7,7 z dodatkiem 1mM MgCl.2

• Próbkę przygotowano i przechowywano w lodzie, bez wystawiania na działanie światla.

18,63 µg ---1ml

x --- 3ml x=59,76 µg - to jest ilośc chlorofilu a i b, znajdującgo się w 500 µl roztworu-uzyskaliśmy go po pobraniu połowy roztworu powstałego po połączeniu 200µl zawiesiny i 800 µl acetonu stąd wynika,że w 500 µl roztworu jest 100µl zawiesiny chloroplastów.

Więc ostateczne stężenie:

59,76 µg---100 µl

x --- 1000 µl x= 597,6 µg- stężenie= 597,6 µg/ ml

Zgodnie z założeniem, że stężenie chlorofilu w próbce ma się zawierac w granicy 20-40 µg/ml, obliczono:

40 µg---1ml

x ---10ml x=400 µg

597,6 µg ---1ml

400 µg ---x x=0,669-tyle pobrano roztworu i uzupełniono 9,33 ml buforu

Ponieważ po pobraniu 1,9 roztworu, stęzenie było zbyt duże więc do 8,1 dodano 3 ml buforu:

40 µg---1ml

x ---8,1 ml x=324-masa chlorofilu

- następnie pobrano 1,5 ml roztworu i wymieszano z 1,5 ml buforu:

324---11,1

x---1,5 x=43,78-w 3ml roztworu w 1ml roztworu-14,5 µg

- z tego pobrano 1,92 ml 14,5—1ml, więc w 1,92 mamy 27,84 µg chlorofilu w ml uzyskanego roztworu.

• Do kuwety spektrofotometrycznej odmierzono 0,5 ml zawiesiny i 1,5 ml buforu E i 100 mikrolitrów DCIP.

• Próbkę umieszczono w spektrofotometrze i dokonano pomiaru absorbancji przy długości fali=590 nm.

• Po pierwszym pomiarze próbkę wyciągnięto ze spektrofotometru , oświetlono ją wysycającym światłem białym przez czas=30 sekund, ponownie dokonano pomiaru absorbancji.

• Wykonano 3 pomiar absorbancji przy wcześniejszym podaniu do kuwety DCIP. Zmierzono absorbancję bezpośrednio po wymieszaniu składników, oraz po naświetleniu próbki przez 30 sekund - próba III- hamowanie aktywności PSII przez DCMU

• Wszystkie wyniki zestawiono w tabeli numer 2.

Tabela nr.2

	A	B	C	D
T [s]	λ=590nm	Zawiesina z DCMU	λ =590nm + DCIP 1900ul zawiesiny + 100ul DCIP	+DCMU 1850ul zawiesiny + 50ul DCMU + 100ul DCIP
0	0,473	0,431	0,441	0,456
30	0,266	0,423	0,237	0,448
60	0,082	------	0,052	------

Na podstawie wyników tabeli sporządzono wykresy zależności A(absorbancji) od T (czasu).

Wykres numer 1-zależnośc absorbancji od czasu dla próby A.

Wykres numer 2- zależnośc absorbancji od czasu dla próby B.

Wykres numer 3-zależnośc absorbancji od czasu dla próby 3.

Wykres numer 4-zależnośc absorbancji od czasu dla próby D.

Obliczono aktywnośc PSII:

Do obliczenia aktywności PSII, wyciągnięto średnią z pomiarów absorbancji. Wyniki zestawiono w tabeli numer 3.

Tabela nr.3

Czas oświetlania	Średnia absorbancja(bez DCMU)
0	1,619
20	1,494
40	1,401
60	1,381
80	1,389

Wyniki z 2 pomiarów przedstawiono na wykresie numer 4.

A = ε c l c= A/ k*l

l = 1 cm ε = 16000 M^-1cm^-1

więc:

Cm=1,619/16000*1=0,000101mol/ dm3=101µmol

Cm=1,494/16000*1=0,0000933 mol/ dm3= 93,3 µmol

Del.Cm=5.5µmol/dm3

5,5µmol-1000ml

x - 2ml

x=11 nmol

Masy molowe chlorofili:

a = 893,5 g/mol

b = 907,5 g/mol

(
-masa molowa chlorofilu

897000000 µg -1000000 µmol

27,84 µg -x

x=0,0310 µmol=31nmol-chlorofil w próbce

ponieważ wiemy,ze do redukcji 1mol DCIP potrzeba 2 mole elektronów, więc 11 nmol*2=22nmol, a ilośc cząsteczek chlorofilu w próbce, to 1,87 * 10 do 16, więc:

1,87 * 10 do 16 cząsteczek chlorofilu --- 22nmoli przeniesiony elektronów w ciągu 20 sekund

1 cząsteczka chlorofilu -------- x

0,9 elektronów/20=0,04 elektronów/sekunde

Na podstawie danych w tabeli numer 2, dotyczących próby III, obliczono hamowanie aktywności PSII przez DCMU:

(1,607 - 1,606) : 1,607 * 100% = 0,60%

100% - 0,60% = 99,4%

Wnioski:

a) DCMU hamuje działanie PSII(staje się inhibitorem reakcji).

b) do pomiaru I i II-w miarę naświetlania probówki spada wartośc absorbancji DCIP, światło wysyca PSII

c) Na podstawie Tabeli 2, w próbie bez DCIP oraz z DCIP chloroplasty są aktywne - można to zaobserwować dzięki spadkowi absorbancji.

W próbkach do których dodano DCMU można zaobserwować zahamowanie przebiegu reakcji - DCMU działa jak inhibitor dla chlorofilu.

---