OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PSII.
Wstęp:
PSII-inaczej fotosystem II.Jest to jeden z dwóch kompleksów barwnikowo-białkowych aparatu fotosyntetycznego. PSII działa z maksymalną wydajnością przy długości fali 680 nm. Fotoukład PSII występuje głównie w tylakoidach gran. Charakterystyczne dla fotoukładu II są układy antenowego określane nazwą - LHC II, w których stosunek chlorofilu a do chlorofilu b wynosi: a:b = 1:1. PSII katalizuje indukowane światłem przeniesienie elektronów z utlenionej cząsteczki wody (donora) na pulę plastochinonu rozpuszczalnego w dwuwarstwie lipidowej chinonu. Aktywnośc PSII można zdefiniowac jako ilośc elektronów przeniesionych z wody na plastochinon w jednostce czasu , przeliczoną na jednostkę masy chlorofilu w próbce.
Wykonanie:
Przed przystąpieniem do oznaczania aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę, wykonano izolację błon tylakoidów z liści sałaty zgodnie z instrukcją zawartą w rozdziale 9.1 (,,Praktikum z biochemii” pod zbiorową redakcją Amalii Guzdek i Pawła Maka).
Po wyizolowaniu błon tylakoidów przystąpiono do oznaczenia zawartości chlorofilu w zawiesinie:
Po dokładnym wymieszaniu zawiesiny tylakoidów uzyskanej wcześniej, odpipetowano po 400 mikrolitrów tej zawiesiny do przygotowanych wcześniej 2 probówek typu Eppendorf.
Do każdej dodano po 1600 mikrolitrów acetonu
Odwirowano je przez 5 minut(10000 obr./min.), a następnie zmierzono absorbancję wzgledem 80% acetonu przy 3 długościach fali: 645, 663, 710 ( poziom tła).
Wyniki zestawiono W tabeli numer 1.
Tabela nr.1
Długośc fali |
Wynik pomiaru absorbancji |
645 |
0,462 |
663 |
1,114 |
710 |
-0,013 |
Następnie obliczono stężenie chlorofilu a i b.
Stężenie chlorofilu a i b:
CChl (a+b) = 20,2 (A645-A710) + 8,02(A663-A710)
CChl (a+b) = 20,2 * (0,462+0,013) + 8,02 *(1,114+0,013)=18,63354 μg/ml masy
Przystąpiono do oznaczania aktywności PSII.
Przygotowaną wcześniej zawiesinę błon tylakoidów, rozcieńczono buforem 10 mM Tricyna-NaOH pH 7,7 z dodatkiem 1mM MgCl.2
Próbkę przygotowano i przechowywano w lodzie, bez wystawiania na działanie światla.
18,63 µg ---1ml
x --- 3ml x=59,76 µg - to jest ilośc chlorofilu a i b, znajdującgo się w 500 µl roztworu-uzyskaliśmy go po pobraniu połowy roztworu powstałego po połączeniu 200µl zawiesiny i 800 µl acetonu stąd wynika,że w 500 µl roztworu jest 100µl zawiesiny chloroplastów.
Więc ostateczne stężenie:
59,76 µg---100 µl
x --- 1000 µl x= 597,6 µg- stężenie= 597,6 µg/ ml
Zgodnie z założeniem, że stężenie chlorofilu w próbce ma się zawierac w granicy 20-40 µg/ml, obliczono:
40 µg---1ml
x ---10ml x=400 µg
597,6 µg ---1ml
400 µg ---x x=0,669-tyle pobrano roztworu i uzupełniono 9,33 ml buforu
Ponieważ po pobraniu 1,9 roztworu, stęzenie było zbyt duże więc do 8,1 dodano 3 ml buforu:
40 µg---1ml
x ---8,1 ml x=324-masa chlorofilu
- następnie pobrano 1,5 ml roztworu i wymieszano z 1,5 ml buforu:
324---11,1
x---1,5 x=43,78-w 3ml roztworu w 1ml roztworu-14,5 µg
- z tego pobrano 1,92 ml 14,5—1ml, więc w 1,92 mamy 27,84 µg chlorofilu w ml uzyskanego roztworu.
Do kuwety spektrofotometrycznej odmierzono 0,5 ml zawiesiny i 1,5 ml buforu E i 100 mikrolitrów DCIP.
Próbkę umieszczono w spektrofotometrze i dokonano pomiaru absorbancji przy długości fali=590 nm.
Po pierwszym pomiarze próbkę wyciągnięto ze spektrofotometru , oświetlono ją wysycającym światłem białym przez czas=30 sekund, ponownie dokonano pomiaru absorbancji.
Wykonano 3 pomiar absorbancji przy wcześniejszym podaniu do kuwety DCIP. Zmierzono absorbancję bezpośrednio po wymieszaniu składników, oraz po naświetleniu próbki przez 30 sekund - próba III- hamowanie aktywności PSII przez DCMU
Wszystkie wyniki zestawiono w tabeli numer 2.
Tabela nr.2
|
A |
B |
C |
D |
T [s] |
λ=590nm |
Zawiesina z DCMU |
λ =590nm + DCIP 1900ul zawiesiny + 100ul DCIP |
+DCMU 1850ul zawiesiny + 50ul DCMU + 100ul DCIP |
0 |
0,473 |
0,431 |
0,441 |
0,456 |
30 |
0,266 |
0,423 |
0,237 |
0,448 |
60 |
0,082 |
------ |
0,052 |
------ |
Na podstawie wyników tabeli sporządzono wykresy zależności A(absorbancji) od T (czasu).
Wykres numer 1-zależnośc absorbancji od czasu dla próby A.
Wykres numer 2- zależnośc absorbancji od czasu dla próby B.
Wykres numer 3-zależnośc absorbancji od czasu dla próby 3.
Wykres numer 4-zależnośc absorbancji od czasu dla próby D.
Obliczono aktywnośc PSII:
Do obliczenia aktywności PSII, wyciągnięto średnią z pomiarów absorbancji. Wyniki zestawiono w tabeli numer 3.
Tabela nr.3
Czas oświetlania |
Średnia absorbancja(bez DCMU) |
0 |
1,619 |
20 |
1,494 |
40 |
1,401 |
60 |
1,381 |
80 |
1,389 |
Wyniki z 2 pomiarów przedstawiono na wykresie numer 4.
A = ε c l c= A/ k*l
l = 1 cm ε = 16000 M-1cm-1
więc:
Cm=1,619/16000*1=0,000101mol/ dm3=101µmol
Cm=1,494/16000*1=0,0000933 mol/ dm3= 93,3 µmol
Del.Cm=5.5µmol/dm3
5,5µmol-1000ml
x - 2ml
x=11 nmol
Masy molowe chlorofili:
a = 893,5 g/mol
b = 907,5 g/mol
(
-masa molowa chlorofilu
897000000 µg -1000000 µmol
27,84 µg -x
x=0,0310 µmol=31nmol-chlorofil w próbce
ponieważ wiemy,ze do redukcji 1mol DCIP potrzeba 2 mole elektronów, więc 11 nmol*2=22nmol, a ilośc cząsteczek chlorofilu w próbce, to 1,87 * 10 do 16, więc:
1,87 * 10 do 16 cząsteczek chlorofilu --- 22nmoli przeniesiony elektronów w ciągu 20 sekund
1 cząsteczka chlorofilu -------- x
0,9 elektronów/20=0,04 elektronów/sekunde
Na podstawie danych w tabeli numer 2, dotyczących próby III, obliczono hamowanie aktywności PSII przez DCMU:
(1,607 - 1,606) : 1,607 * 100% = 0,60%
100% - 0,60% = 99,4%
Wnioski:
a) DCMU hamuje działanie PSII(staje się inhibitorem reakcji).
b) do pomiaru I i II-w miarę naświetlania probówki spada wartośc absorbancji DCIP, światło wysyca PSII
c) Na podstawie Tabeli 2, w próbie bez DCIP oraz z DCIP chloroplasty są aktywne - można to zaobserwować dzięki spadkowi absorbancji.
W próbkach do których dodano DCMU można zaobserwować zahamowanie przebiegu reakcji - DCMU działa jak inhibitor dla chlorofilu.