Podstawy biologiczne przeszczepiania narządów

Rodzaje przeszczepów

Przeszczepianie ma na celu zastąpienie nieodwracalnie uszkodzonej tkanki lub narządu, prawidłowo funkcjonującymi odpowiednikami. Przeszczepy można podzielić na: autologiczne, syngeniczne, allogeniczne i ksenogeniczne.

Przeszczep w obrębie tego samego organizmu nazywamy autologicznym. Takim przykładem może być przeszczepienie skóry pobranej ze zdrowej części ciała w miejsce skóry uszkodzonej.

Przeszczep syngeniczny odbywa się między genetycznie identycznymi osobnikami. W transplantacji klinicznej zdarza się rzadko i dotyczy bliźniąt jednojajowych, natomiast w transplantacji doświadczalnej odbywa się w obrębie szczepów wsobnych zwierząt.

Przeszczep ksenogeniczny odbywa się między osobnikami różnych gatunków np. przeszczepienie szympansowi serca lub nerki pobranej od świni. Prowadzone badania mają na celu takie genetyczne modyfikacje narządów pochodzących od świni oraz pokonanie barier nie tylko immunologicznych, aby w przyszłości ten gatunek mógł być źródłem transplantacji dla ludzi.

Przeszczep między osobnikami różnymi genetycznie, ale w obrębie tego samego gatunku nazywa się przeszczepem allogenicznym. Z tym przeszczepem spotykamy się w transplantacji klinicznej, niezależnie czy dawca jest osobą spokrewnioną (rodzice, rodzeństwo), czy też obcą, zmarłą. Za różnice genetyczne między osobami odpowiadają geny głównego kompleksu zgodności tkankowej (major histocompatibility complex - MHC). U ludzi MHC nazwano genami antygenów leukocytarnych, HLA (human leukocyte antigen), ponieważ po raz pierwszy wykryto je u ludzi na leukocytach. Antygeny HLA zostaną szerzej omówione w podrozdziale „Dobór immunologiczny biorcy i dawcy przeszczepu”. Produkty genów MHC znajdują się na powierzchni wszystkich komórek i są odmienne u każdego osobnika. Ta odmienność sprawia, że alloprzeszczep jest traktowany przez układ immunologiczny biorcy jak tkanka obca, którą organizm stara się zniszczyć, na podobnej zasadzie jak eliminuje bakterie.

Odpowiedź immunologiczna na alloprzeszczep

Wyróżniamy 3 fazy odpowiedzi immunologicznej przeciw alloprzeszczepowi:

1. rozpoznanie obcych antygenów

2. aktywacja klonów antygenowoswoistych limfocytów

3. uszkodzenie alloprzeszczepu czyli faza efektorowa

Komórki układu immunologicznego

We wszystkich fazach odpowiedzi na alloprzeszczep biorą udział komórki układu immunologicznego do których należą: limfocyty T, B, monocyty/makrofagi, komórki NK (natural killers), eozynofile a także bazofile i neutrofile.

Limfocyty CD4 i CD8

Najważniejszymi komórkami odpowiedzi immunologicznej są limfocyty T. Na ich powierzchni znajduje się białko CD4 lub CD8. Limfocyty T z obecnością cząsteczki CD4 należą do limfocytów pomocniczych - Th (T helper). Wiążą się z cząsteczkami MHC klasy II i pośredniczą we wstępnym rozpoznawaniu przeszczepu, regulują nasilenie i koordynują odpowiedź immunologiczną. Limfocyty z obecnością cząsteczki CD8 zaliczono do limfocytów cytotoksycznych - Tc (cytotoxic cells). Wiążą się z cząsteczkami MHC klasy I. Limfocyty CD8 razem z CD4, NK i innymi komórkami odpowiadają za fazę efektorową procesu odrzucania.

Receptor antygenowy komórek T (TCR)

Cząsteczką odpowiedzialną za rozpoznanie kompleksu MHC/peptyd jest receptor antygenowy komórek T (T-cell receptor, TCR). Jego stymulacja aktywuje czynność limfocytu. TCR stanowi podstawowy element komunikacji z innymi komórkami układu immunologicznego. Zbudowany jest z 2 łańcuchów polipeptydowych alfa i beta. TCR na powierzchni komórki T jest związany z kompleksem CD3, który gra ważną rolę w ekspresji tego receptora oraz w przekazywaniu sygnałów do komórki T.

Limfocyty Th1 i Th2

Aktywacja antygenowa limfocytów Th, stymuluje wytwarzanie przez limfocyty cytokin, które regulują odpowiedź immunologiczną. Ustalono, że pewne grupy komórek Th wydzielają stale te same cytokiny, co stało się kryterium ich podziału na 2 grupy: Th1 i Th2. Limfocyty Th1 wydzielają: IL-2, IFN-gamma, IL-12 oraz TNF-alfa. Te cytokiny stymulują reakcje nadwrażliwości typu późnego, aktywność cytolityczną komórek CD8, wspomagają aktywację makrofagów oraz syntezę przez limfocyty B przeciwciał klasy IgG2a wiążących dopełniacz. Limfocyty Th 2, natomiast, wydzielają: IL-4, IL-5, IL-10 oraz IL-13. Aktywują limfocyty B, eozynofile i stymulują wytwarzanie przeciwciał klasy IgE.

Komórki prezentujące antygen

Ważną grupę komórek odpowiedzialnych za prezentację antygenu limfocytom, są komórki prezentujące antygen (antigen presenting cells - APC). Do tych komórek należą: komórki dendrytyczne, makrofagi i limfocyty B (aktywują spoczynkowe limfocyty CD4). Ich rola polega na internalizacji antygenu, przetworzeniu go i pocięciu na peptydy. W obrębie siateczki śródplazmatycznej fragmenty peptydów wiążą się z cząsteczkami MHC klasy I lub II i przenoszone są na powierzchnię komórki. Związanie peptydu z cząsteczkami MHC przez swoiste ugrupowanie aminokwasowe zapewnia odpowiednią orientację przestrzenną sprzyjającą ekspozycji epitopów, wiążących się z receptorem limfocytów T.

Rozpoznanie alloantygenów przeszczepu

Już w trakcie zabiegu operacyjnego, po zwolnieniu zacisków naczyniowych, przepływ krwi biorcy przez przeszczepiony narząd powoduje wypłukanie komórek dendrytycznych dawcy (tzw. „komórek pasażerskich”), na powierzchni których ekspresja cząsteczek HLA jest szczególnie wysoka (klasy II i I). Komórki te migrują do regionalnych węzłów chłonnych biorcy. Tam dochodzi do rozpoznania alloantygenów dawcy przez receptor limfocytów T (TCR). Rozpoznanie antygenów MHC może odbywać się dwoma niezależnymi drogami bezpośrednią i pośrednią.

W rozpoznaniu bezpośrednim receptor limfocytów T rozpoznaje nienaruszone cząsteczki MHC prezentowane przez komórki dendrytyczne lub makrofagi dawcy (komórki prezentujące antygen). Ta droga jest unikalna dla transplantacji. Bezpośrednie rozpoznanie aktywuje większy odsetek komórek T i powoduje intensywną odpowiedź immunologiczną.

W rozpoznaniu pośrednim antygeny MHC dawcy zarówno klasy I jak i II przetworzone do krótkich peptydów prezentowane są przez komórki APC biorcy alloswoistym komórkom T. Rozpoznanie pośrednie skutkuje powstaniem małej liczby alloreaktywnych klonów komórek T, może prowadzić do subklinicznego odrzucania. Uważa się, że limfocyty T uczulone na drodze bezpośredniego rozpoznania odgrywają znaczącą rolę w ostrym lub wczesnym odrzucaniu przeszczepu, natomiast uczulone na drodze pośredniej w odrzucaniu przewlekłym. W wyniku rozpoznania antygenu przez TCR następuje aktywacja, różnicowanie i proliferacja limfocytów w obwodowych węzłach chłonnych.

Aktywacja limfocytów

Pierwszy sygnał aktywacji

Rozpoznanie obcego antygenu jest pierwszym sygnałem aktywacji limfocytów T. Proces ten zachodzi dzięki receptorowi na powierzchni limfocytów T związanemu z kompleksem CD3. Związanie MHC/alloantygen przez kompleks TCR/CD3 aktywuje kaskadę białkowych kinaz tyrozynowych, które przenoszą sygnał z powierzchni komórki do cytoplazmy i do jądra komórkowego, w celu zwiększenia ekspresji genów odpowiedzialnych za syntezę cytokin. Białkowe kinazy tyrozynowe zmieniają poziom fosforylacji białek receptora CD3, ZAP-70, fosfolipazy C-gamma i białek adaptorowych. W wyniku fosforylacji następuje aktywacja licznych szlaków biochemicznych, z których najlepiej poznano szlak kalcyneuryny, kinazy białkowej C, Ras, Rac i kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (mitogen activated protein - MAP). W szlaku kalcyneurynowym, po zwiększeniu stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego i związaniu z kalmoduliną następuje aktywacja fosfatazy kalcyneuryny. Kalcyneuryna defosforyluje cytoplazmatyczny czynnik jądrowy pobudzonych limfocytów T (NFAT), co powoduje jego przemieszczenie z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie łączy się z częścią jądrową tego czynnika. W jądrze NFAT przyłącza się do regionu promotorowego (sekwencji regulatorowych) genów dla wielu cytokin, z których najważniejsza jest IL-2. Blokowanie szlaku kalcyneurynowego jest podstawowym mechanizmem działania cyklosporyny i takrolimusu, nazwanych blokerami kalcyneuryny.

Drugi sygnał aktywacji

Do pełnej aktywacji limfocytów konieczny jest drugi sygnał. Limfocyt, który rozpozna antygen, a nie otrzyma drugiego sygnału nie zostanie zaktywowany, a ponadto traci zdolność aktywacji po rozpoznaniu antygenu w przyszłości. Zjawisko to określane jest mianem anergii lub tolerancji immunologicznej. Z kolei zaktywowanemu limfocytowi, do rozpoczęcia w przyszłości proliferacji potrzebny jest tylko pierwszy sygnał. Drugi sygnał tworzą cząsteczki kostymulujące obecne na powierzchni limfocytu i na komórce prezentującej antygen. Połączenie się cząsteczek z ich ligandami na powierzchni komórki tworzy tzw. synapsę immunologiczną. Na powierzchni limfocytów znajdują się liczne cząsteczki (między innymi: CD2, CD11a/CD18, CD28, CD40L i CD49d), które wiążą się z ich ligandami na powierzchni aktywowanych komórek prezentujących antygen (CD58, CD54, CD80(B7.1)/CD86 (B7.2), CD106), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Najsilniejszy drugi sygnał pochodzi z wiązania cząsteczki CD28 znajdującej się na limfocycie T z jej ligandem B7.1 (CD80) na komórce APC. Również wiązanie CD40L z cząsteczką CD40 na komórce APC silnie pobudza komórki APC i zwiększa ekspresję cząsteczek z rodziny B7. O istotnej roli cząsteczek kostymulacyjnych w aktywacji limfocytów świadczy fakt, że blokowanie tych cząsteczek zapobiega odrzucaniu przeszczepu.

Jak wcześniej wspomniano, uwolniona w wyniku aktywacji limfocytu T IL-2 wiąże się z jej receptorem (IL-2R) na powierzchni limfocytu indukując przejście komórki w fazę G1 cyklu komórkowego. Podwojenie ilości DNA i rozpoczęcie podziału mitotycznego kończy fazę S cyklu komórkowego. Następuje różnicowanie limfocytów T w kierunku limfocytów cytotoksycznych CD8 i klonalna ekspansja swoiście uczulonych limfocytów. Wytwarzane przez aktywowane limfocyty T IL-2, INF-gamma wpływają na proliferację i aktywację innych grup komórek jak limfocyty B, NK, monocyty/makrofagi, a także zwiększają ekspresję cząsteczek HLA i ułatwiają powstanie zapalenia.

Równolegle z tworzeniem się cytotoksycznych limfocytów T, rozwija się aktywacja limfocytów B, czyli ramię humoralne odpowiedzi immunologicznej. Stymulowane przez cytokiny limfocyty B, po związaniu swoistego alloantygenu przez receptor limfocytu B, proliferują i różnicują się w komórki wydzielające przeciwciała skierowane przeciw cząsteczkom HLA przeszczepu.

Rycina 1. Drogi aktywacji limfocytów

Faza efektorowa odpowiedzi immunologicznej; uszkodzenie przeszczepu

Limfocyty cytotoksyczne po związaniu z komórkami przeszczepionego narządu, niszczą je poprzez indukcję szlaków (głównie kaskadę aktywacji kaspaz), prowadzących do apoptozy, czyli zaprogramowanej śmierci komórki. W tym celu limfocyty wykorzystują dwa mechanizmy. Jeden polega na uwolnieniu zawartości ziaren cytolitycznych, perforyny i granzymów, które zadają „śmiertelny cios” komórce. Drugi mechanizm jest związany z aktywacją swoistych receptorów dla nadrodziny TNF, a mianowicie cząsteczki FasL znajdujacej się na limfocytach CD8 i CD4, która reaguje z receptorem Fas na komórce docelowej przeszczepu.

Ważną rolę w uszkodzeniu przeszczepu pełni reakcja opóźnionej nadwrażliwości. W tej reakcji istotną rolę odgrywają zaktywowane limfocyty Th1, makrofagi i NK oraz wydzielane przez nie cytokiny: TNF-alfa i TNF- beta oraz IFN-gamma. Wymienione cytokiny zwiększają ekspresję indukowalnej syntazy NO. Powstający w dużych stężeniach NO zwiększa przepuszczalność naczyń i powoduje obrzęk przeszczepu.

Ponadto, TNF-alfa/beta łącząc się ze swoimi receptorami, indukuje apoptozę komórek docelowych lub martwicę poprzez mechanizm wzbudzenia kaspazy

W reakcji odrzucania przeszczepu mogą uczestniczyć przeciwciała wydzielane przez limfocyty B. Przeciwciała po związaniu z alloantygenami na śródbłonku naczyń uszkadzają przeszczep poprzez aktywację dopełniacza. Przeciwciała mogą też powodować zniszczenie komórek w mechanizmie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC).

W procesie odrzucania oprócz wyżej wymienionych swoistych komórkowych i humoralnych mechanizmów biorą udział nieswoiste reakcje zapalne. Już w pierwszych godzinach po transplantacji w przeszczepionej nerce pojawiają się makrofagi i granulocyty biorcy, jako mediatory odporności wrodzonej, w wyniku aktywacji przez uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne. W późniejszym okresie, alloswoiste komórki efektorowe gromadzą się w świetle naczyń okołocewkowych, a w dalszym rozwoju zapalenia naciekają tkankę śródmiąższową, powodują zapalenie żyłek i cewek. Naciek zapalny może obejmować naczynia i kłębuszki nerkowe. Intensywność i skład komórek nacieku zależy od aktywności procesu odrzucania i rodzaju reakcji odrzuceniowej

Badania immunologiczne przed transplantacją

W okresie przygotowywania chorego do transplantacji oznacza się grupę krwi, antygeny zgodności tkankowej (HLA) i ocenia się stopień humoralnego uczulenia. Bezpośrednio przed zabiegiem transplantacji wykonuje się testy dla wykluczenia przeciwciał skierowanych przeciwko dawcy narządu, tzw. testy krzyżowe (cross-match).

Antygeny zgodności tkankowej.

Antygeny odpowiedzialne za odrzucanie przeszczepu nazwano

antygenami zgodności tkankowej lub antygenami transplantacyjnymi. Kompleks kodujących je genów nazwano głównym układem zgodności tkankowej (major histocompatibility complex; MHC), a u człowieka antygenami leukocytarnymi-HLA (human leucocyte antigens). Najważniejszą funkcją cząsteczek tego układu jest wiązanie i prezentacja antygenów limfocytom T w celu zapoczątkowania odpowiedzi immunologicznej, a także niszczenie komórek w fazie efektorowej.

Geny HLA

Geny kodujące cząsteczki HLA znajdują się na krótkim ramieniu chromosomu 6, z wyjątkiem genów łańcucha beta antygenów klasy I. Region ten obejmuje 4 mln par zasad i zawiera ponad 100 genow. Kompleks HLA i jego produkty podzielono na 4 klasy. Klasę I stanowią regiony HLA-A, HLA-B, HLA-C, które kodują łańcuch ciężki. W tym regionie znajdują się także geny: HLA-E, HLA-F, HLA-G i HLA-H, których funkcja nie jest jeszcze znana. Klasę II stanowi region D, podzielony na subregiony: DR, DP, DQ. W regionie DR znajduje się locus DRA oraz loci DRB1 - DRB9. Do klasy III zaliczono region S, w którym znajdują się geny dla składowych dopełniacza. Klasa IV obejmuje geny dla czynnika martwicy nowotworu (TNF) i inne geny odpowiedzialne za reaktywność immunologiczną.

Budowa cząsteczek HLA

Antygeny HLA są glikoproteinami, zbudowanymi z 2 polipeptydowych łańcuchów alfa i beta, połączonych ze sobą nie kowalencyjnie. Syntetyzowane są w siateczce śródplazmatycznej. Różne cząsteczki HLA mają podobną budowę, lecz różnią się resztami aminokwasowymi w rowku wiążącym peptyd. Kształt rowka zależy od sekwencji aminokwasów budujących rowek.

W cząsteczkach klasy I łańcuch ciężki alfa jest polimorficzny, składa się z 3 domen zewnątrzkomórkowych, części przezbłonowej i części znajdującej się w cytoplazmie komórki. Łańcuch lekki beta (beta2 mikroglobulina) jest identyczny we wszystkich cząsteczkach klasy I. Jest kodowany przez gen znajdujący się na chromosomie 15. Z aminokwasami rowka cząsteczek klasy I wiązane są peptydy złożone z 8-9 aminokwasów. Peptydy pochodzą z białek wytwarzanych endogennie w cytozolu komórki. Po degradacji przez proteasomy peptydy są przenoszone do siateczki śródplazmatycznej i wiązane z cząsteczkami HLA. Kompleks cząsteczka HLA klasy I - peptyd jest transportowany na powierzchnię błony komórkowej, gdzie jest rozpoznawany przez komórki CD8. Antygeny klasy I występują na prawie wszystkich jądrzastych komórkach i płytkach krwi.

W cząsteczkach HLA klasy II łańcuchy alfa i beta mają podobną budowę. U wszystkich osobników łańcuch alfa jest kodowany przez 1 gen DRA. Łańcuch beta może być kodowany przez 9 genów DRB1 do DRB9. Antygeny kodowane przez geny locus DRB1 występują u wszystkich osobników. Łańcuchy alfa i beta mają 2 domeny zewnątrzkomórkowe, fragment transbłonowy i krótki fragment wewnątrzkomórkowy. Miejsce wiązania peptydu jest utworzone przez domeny alfa 1 i beta 1, najbardziej zmienne regiony cząsteczki klasy II. Struktura rowka jest podobna jak w antygenach klasy I. Peptydy wiązane z rowkiem są dłuższe, obejmują 10-25 aminokwasów. Pochodzą z degradacji białek wchłoniętych przez komórkę na drodze endocytozy. Powstałe w endosomch peptydy łączą się z cząsteczkami klasy II i transportowane są na powierzchnię komórki, gdzie są rozpoznawane przez limfocyty CD4.

Antygeny klasy II znajdują się na komórkach układu immunologicznego: na limfocytach B, monocytach/makrofagach, komórkach dendrytycznych, komórkach Langerhansa i komórkach nabłonkowych grasicy. W wyniku aktywacji np. interferonem mogą pojawiać się m.in.na pobudzonych limfocytach T, nabłonku jelita, tarczycy i komórkach śródbłonka. Szczególnie istotna rola antygenów klasy II w odrzucaniu przeszczepu wynika z faktu, że prezentują egzogenne peptydy limfocytom CD4, które wykazują pomocniczą rolę w aktywacji limfocytów CD8 i limfocytów B, a same ulegając proliferacji zapoczątkowują proces odrzucania.

Tabela 1. Charakterystyczne cechy cząsteczek HLA klasy I i II

	Klasa I (A, B, C)	Klasa II (DP, DQ, DR)
			Budowa	polimorficzny łańcuch ciężki alfa i niezmienny łańcuch lekki - beta 2 mikroglobulina	łańcuch beta bardziej polimorficzny niż alfa
			Występowanie	wszystkie komórki jądrzaste	limfocyty B, monocyty/makrofagi, komórki dendrytyczne, aktywowane komórki T, śródbłonka, nabłonka itp.
			Funkcja	prezentacja peptydów wytwarzanych endogennie limfocytom CD8; aktywacja limfocytów CD8; indukcja fazy efektorowej odpowiedzi immunologicznej	prezentacja egzogennych peptydów limfocytom CD4; aktywacja limfocytów CD4; indukcja odpowiedzi mmunologicznej

• Metody oznaczania antygenów HLA

Powszechnie stosowaną metodą wykrywania antygenów HLA był test mikrolimfocytotoksyczny zależny od dopełniacza (complement dependent cytotoxicity; CDC), opisany przez Terasakiego i McClellanda w 1964 roku. Polegał na reakcji swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko poszczególnym antygenom HLA z limfocytami badanej osoby, w obecności króliczego komplementu. Źródłem przeciwciał do typowania były surowice uzyskane od osób otrzymujących mnogie transfuzje, a w ostatnich latach przeciwciała monoklonalne otrzymywane techniką hybrydoma. Oznaczanie serologiczne obarczone było dużym błędem. Pod koniec lat osiemdziesiątych, wprowadzono metody biologii molekularnej, które umożliwiły dokładne typowanie HLA. Powszechnie stosowane techniki wykorzystują łańcuchową reakcję polimerazy, do powielenia fragmentu DNA o polimorficznej sekwencji.

Obecnie najczęściej używana jest metoda PCR-SSP (Polymerase chain reaction with Sequence Specific Primeres), która trwa 2-4 godzin i pozwala na prospektywne typowanie antygenów klasy II i I. Polega na przeprowadzeniu łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem starterów (primerów) o sekwencjach specyficznych dla poszczególnych alleli genów kodujących antygeny HLA. Identyfikacja alleli jest oparta na obecności lub braku wzmocnionego produktu przez określenie jej ruchliwości na żelu agarozowym. Innym komercyjnym testem genetycznego typowania DNA jest hybrydyzacja z alleloswoistymi sondami (PCR - SSO; PCR with Sequence Specific Oligonucleotides Hybridization

W przeszczepianiu nerek wykorzystuje się typowanie molekularne o niskiej rozdzielczości, co odpowiada typowaniu serologicznemu. Pośrednia rozdzielczość powinna być stosowana w retransplantacji. Wysoka rozdzielczość, która obejmuje kilkadziesiąt alleli dla danej swoistości nie znajduje zastosowania w transplantacji narządów unaczynionych.

Nazewnictwo antygenów HLA

Nazwy antygenów HLA są określone cyframi arabskimi, w kolejności, w której były wykrywane np. pierwszy antygen oznaczono HLA-A1, drugi HLA-A2, trzeci HLA-A3, czwarty HLA-B4, piąty HLA-B5 itd. Po wprowadzeniu technik molekularnych wprowadzono cztero cyfrowy zapis, z których 2 pierwsze cyfry oznaczają antygen odpowiadający antygenowi oznaczonemu w przeszłości serologicznie, a kolejne 2 cyfry oznaczają numer allelu. Poprzedzająca je gwiazdka oznacza, że były oznaczane metodami genetycznymi np. HLA-A*0101.

Antygeny HLA-DR różnicuje się na podstawie łańcucha beta kodowanego przez locus DRB1. Zapis HLA-DRB1*0101 oznacza antygen HLA-DR1 numer allelu 1.

Polimorfizm genów HLA

Geny w obrębie głównego układu zgodności tkankowej wykazują duży polimorfizm, który jest wynikiem przystosowania się układu odpornościowego człowieka do walki z zakażeniami. Dzięki polimorfizmowi cząsteczki HLA mogą prezentować limfocytom różnorodne peptydy drobnoustrojów, co umożliwia odpowiedź przeciwinfekcyjną, ale równocześnie stanowi przeszkodę w dobraniu narządu do przeszczepu. Z każdym regionem genu związane są serie alleli. Obecnie poznano w locus A -119 alleli; w B -238; w C - 38; w DRB - 190 (w transplantacji ma znaczenie 9); w DQB - 30 i w locus DP - 73 allele.

Dziedziczenie antygenów HLA

Antygeny HLA są dziedziczone zgodnie z prawami Mendla. Każdy osobnik dziedziczy jeden zestaw genów od ojca drugi od matki, co sprawia, że w każdym loci znajdują się 2 allele. Zestaw alleli na jednym chromosomie nazwano haplotypem. Obydwa haplotypy zarówno od ojca jak i matki ulegają takiej samej ekspresji na komórkach. Z tego wynika, że dziecko zawsze ma wspólny 1 haplotyp z ojcem i jeden z matką.

Nie zawsze jest możliwe wykrycie obydwu antygenów z danego loci, co wynika z dziedziczenia tego samego antygenu od obojga rodziców; np. u pacjenta w locus HLA-A wykryto jeden antygen HLA-A2, co oznacza, że ojciec i matka mieli antygen HLA-A2. O takim pacjencie mówimy, że jest homozygotyczny w locus HLA-A.

Antygeny układu grupowego krwi ABO

Antygeny grup krwi ABO działają jak silne antygeny transplantacyjne. Grupy krwi ABO tworzą trzy antygeny A, B i H, które oprócz erytrocytów, znajdują się w tkankach i płynach ustrojowych, stanowiąc antygeny zgodności tkankowej. Ekspresję tych antygenów stwierdzono na śródbłonku naczyń, nabłonku przewodu pokarmowego, płuc, gruczołów ślinowych, cewek nerkowych, pęcherza moczowego, oraz w szpiku kostnym.

We krwi większości osób dorosłych występują naturalne przeciwciała, izoaglutyniny anty A w grupie B, anty B w grupie A, anty A i anty B w grupie O, natomiast w grupie AB nie ma przeciwciał. Izoaglutyniny powstają około 5. miesiąca życia. Ich miano wykazuje duże indywidualne różnice. U osób powyżej 65 roku życia miano przeciwciał znacznie się obniża.

Przeszczepienie niezgodnego pod względem grup krwi narządu może spowodować nadostre odrzucanie w wyniku reakcji przeciwciał z antygenami grup krwi na śródbłonku naczyń przeszczepu. W konsekwencji dochodzi do zakrzepicy naczyń, martwicy i wylewów krwawych do tkanki śródmiąższowej, prowadząc do nieodwracalnego uszkodzenia przeszczepu.

Mniejsze antygeny zgodności tkankowej

Wpływ na odrzucanie mogą mieć także mniejsze antygeny zgodności tkankowej (minor histocompatibility complex - mHC), kodowane przez wiele genów znajdujących się na różnych chromosomach. Antygeny mHC są rozpoznawane przez limfocyty CD8 jako peptydy związane z własnym MHC (restrykcja MHC). Kombinacja tych mniejszych antygenów może spowodować silną reakcję odrzucania, szczególnie przy pełnej zgodności antygenów HLA.

Antygeny komórek śródbłonka i monocytów, mogą być przyczyną nadostrego odrzucania przeszczepu.

• Badanie humoralnego uczulenia

Istotnym składnikiem badania zgodności tkankowej jest wykrywanie i charakteryzacja przeciwciał cytotoksycznych skierowanych przeciw antygenom HLA u pacjentów oczekujących na przeszczep nerki. Badanie przeciwciał umożliwia przybliżoną ocenę stanu immunologicznego chorych, prognozowanie prawdopodobieństwa znalezienia dawcy zgodnego w próbie krzyżowej, wybór metody wykonania próby krzyżowej jak i odpowiedniego leczenia immunosupresyjnego. Badania przeciwciał są powtarzane w 6. tygodniowych odstępach czasu. Uczulenie przeciw antygenom HLA powstaje najczęściej w wyniku transfuzji krwi, ciąży, wcześniejszego przeszczepu, który był niezgodny HLA, posocznicy bakteryjnej i chorób autoimmunologicznych. Ocenia się, że uczulenie występuje u 10-12% chorych oczekujących na pierwszy przeszczep i u 45% oczekujących na drugi przeszczep.

Wykrywanie przeciwciał anty-HLA

Obecność przeciwciał jest wykrywana testem cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC; complement dependent cytotoxicity), w którym surowica pacjenta jest inkubowana z limfocytami panelu ponad 30 dawców, wybranych tak, aby prezentować ponad 95% swoistości HLA danej populacji. Zawarte w surowicy przeciwciała reagują z antygenami na powierzchni limfocytów powodując ich lizę. Nazwano je przeciwciałami reagującymi z panelem (panel reactive antibodies; PRA). Wyniki PRA są wyrażone odsetkiem komórek z panelu, które uległy lizie. PRA 50% oznacza, że przeciwciała obecne w surowicy pacjenta zabiły limfocyty od 15 z 30 dawców. Wskazuje też, że co drugi potencjalny dawca będzie niezgodny z biorcą. Bardziej czułymi metodami wykrywania przeciwciał są: test CDC z globuliną antyludzką, cytometria przepływowa z selekcjonowaną pulą limfocytów oraz testy immunoenzymatyczne z zastosowaniem rozpuszczalnych antygenów HLA opłaszczonych na podłożu stałym.

Postępowanie z chorym uczulonym

Chorzy uczuleni wymagają starannych badań dla odróżnienia alloprzeciwciał od autoprzeciwciał. Autoprzeciwciała są obojętne dla przeszczepu, ale mogą dać dodatnią próbę krzyżową CDC i uniemożliwić wykonanie skutecznej transplantacji.

Określenie klasy przeciwciał alloreaktywnych pozwala na ocenę ryzyka odrzucania, które jest o 50% mniejsze, jeśli przeciwciała należą do klasy IgM, niż w przypadku przeciwciał klasy IgG. Ważne jest również oznaczenie swoistości antygenowych przeciwko, którym skierowane są przeciwciała. Często chory ma tylko jedno przeciwciało, które krzyżowo reaguje z wieloma antygenami HLA przez wiązanie antygenu, który jest powszechnym epitopem. Z czasem, reaktywność przeciwciał anty HLA może ulec obniżeniu lub też zmienia się ich swoistość, co ułatwia znalezienie dawcy z ujemną próbą krzyżową.

Chorzy wysoko uczuleni, to jest tacy, u których PRA wynosi powyżej 85%, długo oczekują na transplantację ze względu na trudności znalezienia zgodnego dawcy narządu. Dla zwiększenia szansy na przeszczep surowice wysoko-uczulonych chorych są wysyłane do wszystkich ośrodków transplantacyjnych w kraju i testowane z limfocytami wszystkich potencjalnych dawców. Inne postępowanie polega na określeniu antygenów HLA przeciw, którym pacjent nie wytworzył przeciwciał i poszukiwanie dawcy z takim zestawem antygenów.

Zwiększeniem szansy na ujemną próbę krzyżową i transplantację jest eliminacja przeciwciał przez zabiegi plazmaferezy lub immunoadsorbcji oraz podawanie wysokich dawek immunoglobulin dożylnie, co powoduje supresję tworzenia przeciwciał anty HLA.

Uczulenie wpływa niekorzystnie na wyniki transplantacji; roczne przeżycie przeszczepu jest niższe u wysoko-uczulonych. Chorzy uczuleni wymagają lepiej dobranych nerek i bardziej agresywnej immunosupresji.

Przeciwciała inne niż anty-HLA

Przeciwciała anty endotelialne mogą być przyczyną odrzucania przeszczepu. Stwierdzenie ich obecności wymaga skomplikowanych technik badawczych. Wskazaniem do oznaczenia przeciwciał anty-endotelialnych jest przede wszystkim powtórna transplantacja po stracie przeszczepu z powodu humoralnego odrzucania pomimo, nieobecności przeciwciał anty HLA.

Zasady immunologicznego doboru dawcy i biorcy

W transplantacji nerek przestrzega się 3 zasad immunologicznego dobrania dawcy i biorcy przeszczepu:

1. dobór w zakresie układu grupowego krwi ABO

2. dobór antygenów HLA

3. wykluczenie obecności przeciwciał w surowicy biorcy skierowanych przeciw antygenom HLA klasy I i II dawcy (ujemny test krzyżowy)

Właściwy dobór dawcy i biorcy zwiększa szansę na długoletnie funkcjonowanie przeszczepu.

Dobór w zakresie układu grupowego krwi ABO

Zasady doboru antygenów grupowych krwi są podobne jak do przetaczania krwi. Narząd od dawcy grupy O, może być przeszczepiony biorcom wszystkich grup. Biorca grupy O może otrzymać narząd grupy O. Biorca grupy AB może otrzymać narząd każdej grupy. Sprawia to, że pacjenci grupy O, oczekują najdłużej na przeszczep, a grupy AB najkrócej. Dla stworzenia równej szansy na transplantację nerki od osób zmarłych, zwłaszcza pacjentom z grupą O, zaleca się przeszczepianie narządów identycznych ABO. Wyjątek mogą stanowić transplantacje z 6 zgodnymi antygenami HLA lub brakiem (zerem) niezgodności.

Kolejnym, ostatnio podnoszonym, argumentem przeciw przeszczepianiu narządów grupy O biorcom z grupą krwi A, B lub AB jest rozwój izoaglutynin anty A lub anty B, które powodują anemię hemolityczną i trombocytopenię. Izoaglutyniny są wytwarzane przez limfocyty B dawcy, które zostały przeniesione wraz z przeszczepionym narządem.

Dobieranie czynnika Rh (antygenu Rhesus) nie obowiązuje, ponieważ nie stwierdzono jego obecności na śródbłonku naczyń.

Tabela 2. Dobranie dawcy i biorcy pod względem antygenów grupowych krwi

Dawca	Biorca
		Grupa krwi: O	O, A, B, AB
		Grupa krwi: A	A, AB
		Grupa krwi: B	B, AB
		Grupa krwi: AB	AB

• Przeszczepianie wbrew układowi grupowemu ABO

Niektóre ośrodki transplantacyjne rutynowo przeszczepiają nerki od dawców grupy A2 biorcom grupy B lub O, a A2B biorcom grupy B. Skuteczne transplantacje są możliwe dzięki niskiej ekspresji antygenu A2 na śródbłonku oraz niskiego miana naturalnych przeciwciał anty A2. Przeszczepianie nerek grupy A2 ma na celu skrócenie czasu oczekiwania na przeszczep pacjentom grupy B i O oraz zwiększenie szansy na otrzymanie przeszczepu od żywego, spokrewnionego dawcy.

Przeszczep nerki z niezgodną grupą krwi, inną niż A2, wymaga przygotowania biorcy poprzez obniżenie miana izoaglutynin anty A lub anty B za pomocą plazmaferezy lub immunoadsorbcji oraz podania leków hamujących produkcję przeciwciał. Tacy chorzy wymagają też silnej immunosupresji po przeszczepieniu z indukcją przeciwciałami antylimfocytarnymi. Transplantacja wbrew układowi antygenów ABO stanowi zagrożenie dla przeszczepu i może być przeprowadzona tylko u wybranych i odpowiednio przygotowanych chorych.

Dobranie antygenów HLA

Liczba niezgodnych antygenów HLA określa wielkość odpowiedzi immunologicznej na przeszczep. Znalezienie dawcy o identycznych antygenach HLA z biorcą zwiększa szansę na swoistą tolerancję. W transplantacji nerek obowiązuje dobór w loci HLA-A, HLA-B i HLA-DR.

Polimorfizm antygenów należących do każdego loci, sprawia, że istnieje mała szansa dobrania (0,3 - 10%) niespokrewnionych osób z 6 zgodnymi antygenami HLA. Stąd, też prowadzono badania nad wpływem mniejszej liczby dobranych antygenów oraz wpływem poszczególnych regionów HLA na przeżycie przeszczepu. Te analizy wykazały, że wpływ niezgodności w locus HLA-DR na przeżycie przeszczepu w pierwszym roku, jest większy niż w loci HLA-B i HLA-A. W miarę upływu czasu po transplantacji zaznacza się niekorzystny wpływ wszystkich 3 loci. W pełni dobrane przeszczepy we wszystkich 3 loci HLA-A, HLA-B i HLA-DR mają priorytet w przeszczepianiu. Również dobranie antygenów HLA-DR i HLA-B poprawia przeżycie przeszczepu. Większa liczba niezgodności, powyżej 2 lub 3 antygenów nie ma już większego wpływu na poprawę przeżycia przeszczepu. Oznacza to, że przeżycie przeszczepu jest zbliżone u pacjentów z 4, 5 czy 6 niezgodnościami. Ten fakt należy uwzględnić w systemie allokacji nerek opartych na doborze HLA. Przy gorzej dobranych nerkach należy rozważyć, czy powinny być przeszczepione u biorcy, którego odległość od ośrodka wpłynie istotnie na wydłużenie czasu zimnego niedokrwienia, czy też przeszczepione lokalnie w krótszym czasie, ale z nieco gorszym doborem. Przedłużenie czasu zimnego niedokrwienia powyżej 36 godzin zwiększa ryzyko ATN. Mniej zgodne nerki, ale z bezpośrednią funkcją mają lepsze przeżycie przeszczepu, aniżeli lepiej dobrane, ale z opóźniona czynnością.

Zalecany jest dobór antygenów HLA wg następującej hierarchii:

6 zgodnych antygenów w loci A, B i DR;

0 niezgodnych antygenów w loci A, B i DR;

0 niezgodnych antygenów w loci B i DR;

1 niezgodny antygen w loci B i DR;

2 niezgodne antygeny w loci B i DR

Wpływ dobrania antygenów HLA na wyniki przeszczepiania nerek

Wieloośrodkowe badania amerykańskie i europejskie wykazały poprawę przeżycia w pełni zgodnych przeszczepów w porównaniu z niezgodnymi. Trzy do dziesięcio-letnie przeżycie przeszczepionych nerek było o 5 -10% wyższe. Pół okres przeżycia (tj. okres czasu w którym 1/2 biorców z funkcjonującym przeszczepem w pierwszym roku, będzie miała nadal czynny przeszczep) dla biorców z 6 zgodnymi antygenami HLA- A, B, DR wynosił 20 lat; a dla biorców z jedną niezgodnością 10 - 12 lat, a przy jeszcze większej liczbie niezgodności 7 - 9 lat. Przekonującym dowodem korzystnego wpływu dobrania 6 antygenów na przeżycie przeszczepu był brak cech histopatologicznych przewlekłego odrzucania w biopsjach wykonanych w 24 miesiącu po transplantacji. W gorzej dobranych nerkach cechy przewlekłego odrzucania wystąpiły u połowy biorców.

Także dobór 4 antygenów HLA-B i DR zwiększa szansę 10-cio letniego przeżycia o 20% w porównaniu z brakiem doboru tych antygenów. Również pełne dobranie antygenów DR poprawia przeżycie przeszczepu; 10-cio letnie przeżycie przeszczepu w grupie biorców z zerem niezgodności DR, w porównaniu z dwoma niezgodnościami wynosiło odpowiednio 74,2 vs 56,9%. Dobór 2 antygenów DR zmniejsza częstość ostrego odrzucania. Prawdopodobieństwo znalezienia biorcy i dawcy z 0 niezgodnych antygenów DR wynosi 95%, jeśli pula oczekujących obejmuje 800 chorych.

Wpływ dobrania antygenów HLA może być zatarty przez inne czynniki jak np. „efekt ośrodka”, wiek dawcy i biorcy, czas niedokrwienia ciepłego i zimnego, ”jakość” przeszczepionej nerki, stopień uczulenia, rodzaj leczenia immunosupresyjnego, błędy w typowaniu, przyczynę przewlekłej niewydolności nerek.

Wyniki transplantacji od żywych dawców, pomimo gorszego dobrania HLA są lepsze niż od dawców zmarłych.

Wpływ dobrania jest szczególnie silny u osób wysoko-uczulonych i przy powtórnych transplantacjach. Przy powtórnych przeszczepach należy unikać niezgodności, zwłaszcza w locus HLA-DR, która występowała w poprzednim przeszczepie. Należy przeszczepiać lepiej dobrane nerki, szczególnie w zakresie antygenów DR.

Próba krzyżowa przed transplantacją nerki

Najważniejszym badaniem w doborze biorcy i dawcy przeszczepu jest próba krzyżowa (cross-match), wykonywana bezpośrednio przed przeszczepem, która ma wykluczyć obecność przeciwciał przeciw antygenom HLA klasy I i II dawcy narządu. Ujemny wynik testu jest warunkiem wykonania przeszczepu. Podstawową metodą wykrywania przeciwciał jest standardowy test mikrolimfocytotoksyczny CDC, który polega na inkubacji surowicy biorcy z limfocytami dawcy i z dopełniaczem króliczym. Obecność w surowicy przeciwciał przeciw antygenom dawcy powoduje śmierć limfocytów. Martwe komórki ulegają wybarwieniu po dodaniu barwnika (eozyna lub błękit trypanu) i są liczone w mikroskopie fazowo-kontrastowym. Wynik testu jest ujemny, jeśli nie stwierdza się martwych komórek lub ich ilość nie przekracza 10%. Dodatni test, (powyżej 10% zabitych limfocytów) wskazuje na obecność we krwi biorcy przeciwciał. Przeszczepienie narządu biorcy, który ma przeciwciała skierowane przeciwko dawcy prowadzi do nadostrego odrzucania przeszczepu, podobnie jak w niezgodnych antygenach grup krwi.

U pacjentów, u których w czasie badania przeciwciał cytotoksycznych wykryto autoprzeciwciała, które mogą dać „fałszywie” dodatni wynik próby krzyżowej, należy je usunąć albo przez absorbcję autologicznymi limfocytami lub przez dodanie do surowicy dithiothreitolu.

Testy krzyżowe z limfocytami T i B

Limfocyty do testu krzyżowego od dawców żywych pochodzą z krwi obwodowej, a od dawców zmarłych z węzłów chłonnych lub śledziony. Test krzyżowy wykonuje się oddzielnie z populacją limfocytów T i limfocytów B. Test z limfocytami T wykrywa przeciwciała przeciw antygenom klasy I, a z limfocytami B zarówno przeciw antygenom klasy I jak i II. Na limfocytach B znajduje się więcej cząsteczek HLA klasy I niż na limfocytach T, stąd w teście z limfocytami B wzrasta możliwość wykrycia niskiego miana przeciwciał przeciw klasie I. Wykrywanie przeciwciał z limfocytami T a nie wykrywanie ich z limfocytami B sugeruje, że nie są to przeciwciała anty HLA.

Stwierdzenie obecności przeciwciał przeciw antygenom klasy II, które są także wykrywane testem z limfocytami B, wymaga ich oddzielenia od klasy I przez absorbcję surowicy płytkami krwi. Szkodliwość tych przeciwciał może się ujawnić w wyniku ekspresji antygenów klasy II na komórkach śródbłonka. Ekspresja tych antygenów może być indukowana śmiercią mózgu lub uszkodzeniem niedokrwienno/reperfuzyjnym. Wtedy to śródbłonek naczyń staje się celem ataku immunologicznego zarówno komórkowego jak i humoralnego. Przeciwciała anty klasa II HLA stwierdzano we wczesnej dysfunkcji, a nawet w nadostrym odrzucaniu.

Modyfikacje testu krzyżowego CDC

Test CDC nie wykrywa przeciwciał o niskim mianie i takich, które nie wiążą dopełniacza. W celu poprawy czułości testu krzyżowego wprowadzono szereg modyfikacji między innymi: wydłużenie czasu inkubacji, dodatkowe płukania komórek oraz inkubację w różnych temperaturach.

Dodanie anty-ludzkiej globuliny (AHG) do standardowego testu CDC zwiększa dwa do trzykrotnie czułość testu (CDC-AHG). AHG krzyżowo wiąże przeciwciała do komórek docelowych, przez co zwiększa skuteczność wiązania składowej dopełniacza C1q, zapoczątkowując lizę komórek zależną od dopełniacza. Próba CDC- AHG jest szczególnie wskazana w powtórnych przeszczepach i u osób uczulonych.

Test krzyżowy wykonany metodą cytometrii przepływowej (FC)

Próba krzyżowa wykonana metodą FC jest wielokrotnie bardziej czuła, niż standardowa próba CDC i CDC-AHG. Wykrywa przeciwciała skierowane przeciwko komórkom T lub B metodą pośredniej immunofluorescencji. Pozwala na wykrycie przeciwciał o niskim mianie, zarówno tych, które wiążą jak i nie wiążą dopełniacza, umożliwia rozróżnienie klasy przeciwciał IgG lub IgM.

Korelacja testu FC z wynikami klinicznymi u biorców pierwszego przeszczepu, pozostaje nadal kontrowersyjna. Panuje pogląd, że próba FC jest zbyt czuła dla transplantacji wykonanych po raz pierwszy, przez co pozbawia szans na transplantację pacjentów, u których ten zabieg może być bezpiecznie przeprowadzony. Z dotychczasowych badań wynika, że u nieuczulonych biorców pierwszego przeszczepu, dodatni wynik testu FC z komórkami T nie ma wpływu na roczne przeżycie przeszczepu, natomiast pięcioletnie przeżycie przeszczepu jest niższe. Technika FC jest trudna i kosztowna, a uzyskane wyniki stwarzają problemy w interpretacji, stąd też nie znalazła szerokiego zastosowania w doborze pierwszego przeszczepu. Wyjątek stanowią dzieci i transplantacje rodzinne.

Dobranie biorcy i dawcy na podstawie próby FC jest zalecane w powtórnych transplantacjach i u pacjentów wysoko-uczulonych. Korelacja testu FC z wynikami klinicznymi w retransplantacji jest bardziej jednoznaczna. Niższe przeżycie przeszczepu, i dodatkowo gorszą wczesną funkcję stwierdzano u biorców drugiego przeszczepu, których surowice wykazywały dodatni test FC z limfocytami T. Biorcy drugiego przeszczepu dobrani na podstawie próby FC mieli istotnie wyższe roczne jak i siedmioletnie przeżycie przeszczepu, niż gdy dobranie było wykonane testem CDC-AHG. U żadnego chorego z ujemnym testem CDC i dodatnim FC nie wystąpiło nadostre odrzucanie.

Test FC powinien być stosowany łącznie z testem CDC, a jego wynik należy rozpatrywać w kontekście stopnia uczulenia i powtórnej transplantacji. Dla biorców pierwszego przeszczepu jedynie dodatni test CDC-AHG, który wykrywa przeciwciała IgG anty HLA, wykonany z limfocytami B lub B i T jest przeciwwskazaniem do przeszczepu. U pacjentów uczulonych lub/i powtórnie przeszczepianych dodatni test FC stanowi przeciwwskazanie do przeszczepu.

Dodatni test krzyżowy w rodzinnym przeszczepie jest wskazaniem do odczulania pacjenta. Tydzień przed planowanym zabiegiem transplantacji usuwa się przeciwciała zabiegami plazmaferezy i podaje dożylnie immunoglobuliny. Zwykle po takim przygotowaniu dodatni test krzyżowy ulega konwersji do ujemnego. Po zabiegu transplantacji można powtórzyć opisaną procedurę. W immunosupresji zalecana jest indukcja Thymoglobuliną oraz leczenie takrolimusem, MMF i kortykosteroidami.

Testy krzyżowe z surowicami „historycznymi” i bieżącymi u pacjentów uczulonych

Amerykańskie Towarzystwo Zgodności Tkankowej i Immunogenetyki zaleca wykonywanie testu krzyżowego z surowicami z ostatnich 6. miesięcy oraz ze świeżo pobraną surowicą dla pierwszego i drugiego przeszczepu, natomiast z wszystkimi historycznymi surowicami, (w których stwierdzono PRA) i świeżo pobraną surowicą dla trzeciego i czwartego przeszczepu. Dodatnia próba z historyczną surowicą jest przeciwwskazaniem do przeszczepu, bowiem powtórna ekspozycja pacjenta na antygeny HLA przeciwko, którym poprzednio wytwarzał przeciwciała, może spowodować ponowną ich produkcję i w konsekwencji przyczynić się do humoralnego odrzucania przeszczepu. Analizy retrospektywne wykazały, że przeżycie przeszczepu u biorców z ujemną bieżącą próbą krzyżową, lecz dodatnią z surowicą historyczną było istotnie krótsze niż u tych chorych, u których obydwie próby były ujemne.

• Dobór tkankowy w transplantacji trzustki

W przeszczepie trzustki obowiązuje zgodność układu grupowego ABO i ujemna próba krzyżowa podobnie jak w przeszczepie nerki. Dobór antygenów HLA zarówno w zakresie HLA-A, HLA-B i HLA-DR poprawia przeżycie trzustki. Wyniki różnią się w zależności od kategorii przeszczepu. Analiza 9 000 przeszczepionych trzustek reportowanych w UNOS wykazała istotny wpływ doboru w locus A i B na roczne przeżycie w przeszczepie samej trzustki (74% vs 60%) oraz w przeszczepie trzustki po nerce (85% vs 70%), natomiast nie uwidoczniono takiego wpływu przy równoczesnym przeszczepie trzustki i nerki. Przedtransplantacyjna próba krzyżowa powinna być wykonana czułymi testami CDC z AHG lub cytometrią przepływową.

• Dobór w transplantacji wątroby

O wyborze biorcy przeszczepu decyduje zwykle stan kliniczny i czas zimnego niedokrwienia. Należy przestrzegać dobrania grup krwi w układzie ABO. Przeszczep wbrew barierze ABO u osób dorosłych jest związany z bardzo wysokim stopniem powikłań (>80%) jak ostre odrzucanie, zakrzepica, zapalenie dróg żółciowych i hepatitis fulminans. U dzieci z niezgodną grupą krwi wskazana jest plazmafereza lub immunoadsorbcja przed i po przeszczepie.

Dodatni test krzyżowy nie jest przeciwwskazaniem do przeszczepu wątroby, pomimo, że u chorych z dodatnim testem stwierdzano większą częstość epizodów ostrego odrzucania

• Dobór tkankowy w transplantacji serca

W przeszczepianiu serca obowiązuje zgodność grup krwi, natomiast nie obowiązuje allokacja zależna od doboru HLA. O wyborze biorcy decyduje stan kliniczny, czas zimnego niedokrwienia i wielkość serca.

U pacjentów z wcześniejszą ekspozycją na obce antygeny, podobnie jak w przygotowaniu do przeszczepu nerki konieczne jest oznaczanie PRA. U chorych z PRA > 10%, zwłaszcza ze wspomaganiem lewej komory (otrzymują duże ilości krwi) konieczne jest wykonanie przedtransplantacyjnej próby krzyżowej za pomocą czułych testów: CDC z globuliną antyludzką i cytometrią przepływową. Pacjenci z dodatnimi testami nie powinni być przeszczepiani. U tak dobranych biorców obserwowano wczesne ostre odrzucanie, a przeżycie przeszczepu było o 18% niższe w porównaniu z chorymi, u których testy były ujemne. Przedoperacyjna plazmafereza, wlewy wysokich dawek immunoglobulin przed i po zabiegu transplantacji zwykle pozwalają na kontrolę humoralnego odrzucania u chorych uczulonych i/lub z dodatnim testem krzyżowym.

Odrzucanie alloprzeszczepu

Przedstawiony powyżej patomechanizm uszkodzenia alloprzeszczepu jest charakterystyczny dla ostrego komórkowego i zależnego od przeciwciał odrzucania przeszczepu. W klinice, w zależności od mechanizmu i czasu wystąpienia wyróżnia się 3 typy odrzucania: nadostre, ostre i przewlekłe.

Nadostre odrzucanie przeszczepu

Nadostre odrzucanie spowodowane jest obecnością przeciwciał we krwi biorcy, które reagują z antygenami na powierzchni śródbłonka naczyń przeszczepu. W wyniku aktywacji dopełniacza i układu krzepnięcia następuje martwica i zakrzepica naczyń. Przeciwciała mogą być skierowane przeciw antygenom układu ABO grup krwi, antygenom HLA klasy I, II lub komórkom śródbłonka. W obecnej dobie nadostre odrzucanie zdarza się rzadko, a jeśli, to z powodu innych niż anty HLA przeciwciała lub też pomyłki. Wykonywanie testu krzyżowego przed zabiegiem przeszczepienia oraz przestrzeganie doboru grupy krwi, skutecznie zapobiega temu powikłaniu.

Objawy kliniczne występują w czasie kilkunastu minut do kilku godzin po wykonaniu połączeń naczyniowych. Przepływ krwi przez nerkę ustaje, nerka sinieje, staje się wiotka, przestaje wydalać mocz. W biopsji stwierdza się martwicę i zakrzepicę naczyń z obecnością granulocytów wielojądrzastych w obrębie zakrzepów. Rozpoznanie nadostrego odrzucania jest wskazaniem do usunięcia przeszczepu, z powodu nieodwracalności zmian.

Ostre komórkowe odrzucanie przeszczepu

Ostre odrzucanie charakteryzuje się ostrym pogorszeniem czynności przeszczepu w wyniku cewkowo-śródmiąższowego i naczyniowego zapalenia będącego następstwem odpowiedzi immunologicznej biorcy na alloprzeszczep. W procesie tym oprócz wyżej wymienionych swoistych komórkowych i humoralnych mechanizmów biorą udział nieswoiste reakcje zapalne. Już w pierwszych godzinach po transplantacji w przeszczepionej nerce pojawiają się makrofagi i granulocyty biorcy, jako mediatory odporności wrodzonej, w wyniku aktywacji przez uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne. W późniejszym okresie, alloswoiste komórki efektorowe gromadzą się w świetle naczyń okołocewkowych, a w dalszym rozwoju zapalenia naciekają tkankę śródmiąższową, powodują zapalenie żyłek i cewek. Naciek zapalny może obejmować naczynia i kłębuszki nerkowe. Intensywność i skład komórek nacieku zależy od aktywności procesu odrzucania i rodzaju reakcji odrzuceniowej

Ostre odrzucanie występuje najczęściej między 5 a 90 dniem, chociaż może zdarzyć się w każdym czasie po przeszczepieniu. Obecnie częstość odrzucania zmniejszyła się z 50 do około 20%, w związku ze stosowaniem nowych leków immunosupresyjnych jak MMF, takrolimus, sirolimus oraz indukcji monoklonalnymi przeciwciałami anty-CD25. Kliniczne objawy ostrego odrzucania to zmniejszenie ilości oddawanego moczu, zwiększenie stężenia kreatyniny, białkomocz, zredukowane frakcyjne wydzielanie sodu, obrzęki, nadciśnienie tętnicze. Odrzucaniu mogą towarzyszyć objawy ostrego zapalenia: gorączka, obrzęk przeszczepu i tkliwość, zwiększenie CRP. W badaniu USG nerka jest powiększona, kora obrzękła. W badaniu dopplerowskim wzrasta opór obwodowy z powodu wazokonstrykcji i ucisku małych naczyń przez obrzęk i naciek. Często jedynym objawem odrzucania, chociaż nieswoistym i późnym, jest zwiększenie stężenia kreatyniny powyżej 25% od wartości podstawowej.

„Złotym standardem” rozpoznania jest biopsja przeszczepu. Badanie histopatologiczne wykazuje obrzęk i różnego stopnia naciek komórkami jednojądrzastymi tkanki śródmiąższowej, penetrację limfocytów w ścianę kanalików (tubulitis) i naczyń z obrzękiem śródbłonka (endothelialitis, vasculitis). Zapalenie naczyń wskazuje na cięższą formę odrzucania, podobnie jak obecność granulocytów kwasochłonnych w nacieku. Zmiany morfologiczne są oceniane wg kryteriów Banff. Klasyfikacja Banff została po raz pierwszy opublikowana w 1993 r., a nastepnie zmodyfikowana w 1997 i 2001 r. Stopień nasilenia poszczególnych zmian patologicznych w ostrym odrzucaniu oceniany jest w czterostopniowej skali (0 - 3), a do opisu lokalizacji zmian stosuje się oznaczenia literowe: „g” - zmiany w kłębuszkach, „v” - zmiany w naczyniach, „t” - zmiany w cewkach, „i” - zmiany w tkance śródmiąższowej, „ah” - szkliwienie tętniczek.

Modyfikacja klasyfikacji Banff z 1997 r. definiuje następujące typy ostrego odrzucania:

typ I - ostre odrzucanie przeszczepu cewkowo-śródmiąższowe bez cech zapalenia naczyń (I A, I B),

typ II - ostre odrzucanie przeszczepu naczyniowe z objawami zapalenia błony wewnętrznej naczyń (II A, II B),

typ III - ciężkie odrzucanie ze zmianami obejmującymi całą grubość ściany.

Wycinki z obecnością niewielkich zmian zapalnych są opisywane jako graniczne odrzucanie lub podejrzenie odrzucania (borderline).

W leczeniu ostrego odrzucania stosuje się wysokie dawki steroidów, podawane w postaci metyloprednizolonu w dawce 500-1000 mg/dobę przez 3-5 dni. Zwykle, 70-80% chorych odpowiada na takie leczenie. Nawroty ostrego odrzucania są wskazaniem do wzmocnienia podstawowego leczenia immunosupresyjnego (zwiększenie dawek leków lub zamiana cyklosporyny na takrolimus, dodanie MMF lub sirolimusu). Brak poprawy czynności przeszczepu po 5 dniach od zapoczątkowania leczenia pulsami steroidów, pozwala na rozpoznanie steroido-opornego odrzucania i jest wskazaniem do stosowania poliklonalnych przeciwciał antylimfocytarnych lub monoklonalnego przeciwciała anty CD3 (OKT3). Przed rozpoczęciem leczenia przeciwciałami powinna być wykonana biopsja, zwłaszcza, jeśli rozpoznanie było oparte na objawach klinicznych.

Ostre odrzucanie przeszczepu zależne od przeciwciał

Ten typ odrzucania, w przeszłości nazywany przyspieszonym lub naczyniowym, rozwija się powyżej 24 godzin po przeszczepieniu. Jest wynikiem uczulenia biorcy przed transplantacją na alloantygeny dawcy, które nie zostało wykryte w rutynowo stosowanych testach krzyżowych, z powodu zbyt niskiego miana przeciwciał lub też następstwem szybkiej produkcji przeciwciał w odpowiedzi na ponowny kontakt z antygenami przeszczepu. Odrzucanie może nakładać się na opóźnioną czynność przeszczepu, naśladować ostrą martwicę cewek lub wystąpić w początkowo funkcjonującym przeszczepie w różnym czasie po zabiegu przeszczepienia lub też może wystąpić równolegle z odrzucaniem komórkowym.

Klinicznie przebiega jako ciężkie odrzucanie oporne na leczenie pulsami metyloprednizolonu i przeciwciałami antylimfocytarnymi. Histopatologiczne cechy odrzucania obejmują zapalenie lub/i zakrzepicę kłębuszków i małych naczyń, naciek granulocytarny kapilarów okołokanalikowych i/ lub kłębuszków, martwicę włóknikowatą ściany naczyń lub ostrą martwicę cewek.

Podstawą rozpoznania odrzucania zależnego od przeciwciał jest obecność złogów fragmentu rozpadu dopełniacza, C4d, na śródbłonku kapilarów okołocewkowych, wykrywanych w badaniu immunofluorescencyjnym bioptatu nerki oraz obecność przeciwciał przeciw antygenom HLA klasy I i/lub II dawcy przeszczepu.

W 2001 roku wprowadzono podział odrzucania humoralnego, w którym wyróżniono 3 postaci:

1. imitującą ostrą martwicę cewek (ATN), ze złogami C4d

2. z obecnością zakrzepów w kapilarach, ze złogami C4d

3. z zapaleniem naczyń „v=3”, ze złogami C4d

Leczenie polega na usunięciu przeciwciał i mediatorów humoralnego odrzucania oraz zastosowania leków immunosupresyjnych, które będą hamować dalszą produkcję przeciwciał. W tym celu stosowano plazmaferezy, początkowo codziennie lub co drugi dzień (łącznie 4-7 zabiegów). Po każdej plazmaferezie podawano immunoglobuliny w dawce od 100 mg/kg m.c. do 500 mg/ m.c. Zabiegi powtarzano aż do uzyskania poprawy klinicznej i zaniku alloprzeciwciał. Zamiast plazmaferez stosowano zabiegi immunoadsorbcji oraz w pojedynczych przypadkach przeciwciała anty-CD20. Kolejną metodą leczenia jest stosowanie dużych dawek immunoglobulin 2 g/kg m.c. podawanych przez kilka dni.

---