Toxoplasma gondii.

Jest kosmopolitycznym pasożytem człowieka i zwierząt. Bytuje wewnątrzkomórkowo, głównie w komórkach układu nerwowego, siateczkowo-śródbłonkowego i w makrofagach. Wywołuje chorobę zwana toksoplazmozą.

Występuje w 3 formach życiowych:

• 
  wegetatywnej - szybko namnażającej się zw. tachyzoitem

• cysty tkankowej zawierającej bradyzoity

• formy przetrwalnej - oocysty (zawierającej 2 sporocysty wewnątrz których znajdują się po 2 sprozoity)

Cechy diagnostyczne tachyzoitu. Trofozoit łukowaty, sierpowaty lub owalny, przypomina cząstkę pomarańczy lub banana (2-8 x 2-4 μm) otoczony trójwarstwową pellikulą na która składają się: plazmolemma i dwie blisko leżące błony. Jeden biegun komórki zaokrąglony, drugi - ostro wydłużony. Koniec ten odgrywa rolę podczas wnikania do komórki żywiciela, zawiera kompleks apikalny z konoidem i toksonemami. Na końcu apikalnym znajdują się trzy główne typy organelli wydzielniczych: mikronemy, roptrie i granule o dużej gęstości oraz struktura zwana konoidem. Mikronemy wydzielają swoiste białka na wczesnych etapach inwazji, ułatwiając wiązanie do komórek gospodarza oraz ruch ślizgowy. Również roptrie uwalniają białka podczas inwazji i można je wykryć w świetle wakuoli zwanej parazytoforem (PV) oraz jako wbudowane w jego błonę. Białka z granul pojawiają się podczas tworzenia PV oraz w trakcie jego dojrzewania. Ich funkcją jest modyfikacja środowiska PV, która umożliwi wewnątrzkomórkowe przeżycie i namnażanie parazyta (modyfikacje błony PV uniemożliwiają łączenie się z nią lizosomów). Konoid jest strukturą o kształcie stożkowatym, złożoną z 14 filamentów skręconych odwrotnie do ruchu wskazówek zegara. Dzięki zdolności do obracania, przechylania, rozciągania i kurczenia pełni funkcję mechaniczną przy wnikaniu trofozoitu do komórek gospodarza. Poniżej organelli wydzielniczych znajduje się plastydo-podobne organellum - apikoplast otoczone poczwórną błoną. Wewnątrz niego zlokalizowany jest kolisty DNA o 35 kb. Jednakże większość białek funkcjonalnych apikoplastu kodowana jest przez jądrowy DNA. T. gondii posiada pojedyncze jądro oraz jeden mitochondrion (przypuszcza się, że znaczenie tego organellum dla metabolizmu komórkowego zależy od postaci w Tg w cyklu życiowym). Toksoplazma tworzy pseudocysty z tachyzoitami o średnicy 500 μm, głównie w makrofagach. W preparacie z wysięku otrzewnowego myszy barwionym metodą Giemsy są widoczne trofozoity z niebieskofioletową cytoplazmą i wyraźnym, dużym fioletowym jądrze. W niektórych trofozoitach uwidacznia się przestrzeń okołąjądrowa.

Cysty tkankowe są kuliste lub owalne (20-200 μm) z licznymi bradyzoitami. Bradyzoity morfologicznie przypominają tachyzoity i zawierają podobny zestaw organelli (z wyjątkiem ziaren amylopektyny i mniejszej ilości granul o dużej gęstości). Mają postać bardziej wydłużoną. Nie ulegają tak dynamicznym podziałom jak tachyzoity, ale są mniej od nich patogenne. Cysty tkankowe pokryte są własną otoczką i błoną komórkową zniszczonej komórki żywiciela. Po pewnym czasie zostają otoczone tkanką łączną i ulegają wysyceniu solami wapnia. Cysty utrzymują się w organizmie żywiciela prawdopodobnie przez całe życie, stanowiąc przewlekłą formę zakażenia. W czasie obniżenia odporności (AIDS, radioterapia, immunosupresja) może dojść do reaktywacji pasożyta - pękania cyst i uwalniania toksoplazm.

Chorobotwórczość.

Toksoplazmoza wrodzona. Występowanie szacuje się na 1-4 przypadków na 1000 noworodków. W Polsce stwierdza się rocznie 200-400 jej przypadków. Zakażenie płodu następuje głównie w czasie czynnej infekcji u matki. Obecnie kwestionuje się możliwość przeniesienia zakażenia do płodu od matki z przewlekłą postacią choroby (obecność przeciwciała IgG, bez wzrostu ich miana). Możliwość zakażenia płodu wzrasta z czasem trwania ciąży: zależy od przepuszczalności łożyska, zjadliwości pasożyta, stanu układu odpornościowego matki i płodu. Ryzyko przeniesienia zakażenia od świeżo zainfekowanej matki wynosi 30-40%. Ryzyko zakażenia płodu w: I trymestrze ciąży 17-25%, e II 25-54%, III 60-90 %. Im w późniejszym okresie ciąży choruje matka, tym krótszy jest czas potrzebny do zakażenia płodu, ale stopień ciężkości choroby jest odwrotnie proporcjonalny do okresu ciąży, w którym nastąpiło zakażenie u matki. Płody zakażone w I trymestrze ulegają poronieniu, lub umierają w okresie noworodkowym z powodu licznych zmian patologicznych. Płody zakażone w II lub III-cim trymestrze mają przebieg choroby od bez- (75-85%), lub skąpoobjawowego do wystąpienia różnych ciężkich objawów klinicznych. Toksoplazmoza wrodzona w postaci bezobjawowej u noworodków może rozwinąć się w późniejszym czasie (w przeciągu miesięcy lub nawet lat w wieku dojrzewania); dotyczy to głownie zmian w narządzie wzroku.

Obraz kliniczny toksoplazmozy wrodzonej nie jest jednorodny. Postać klasyczna zw. Triadą Sabina-Pinkertona wykazuje:

1. zapalenie siatkówki i naczyniówki

2. wodogłowie lub małogłowie

3. zwapnienia śródczaszkowe

Rzadko jest opisywana w całości. Stwierdzenie jednego lub dwu objawów dotyczących OUN lub narządu wzroku jest wskazaniem do wykonania badań w kierunku toksoplazmozy u noworodka.

Toksoplazmoza nabyta. Zakażenie nabyte ma zazwyczaj charakter bez- lub skąpoobjawowy. Objawy kliniczne opisywane są u 5-20% pacjentów. Okres wylęgania wynosi ok. 2 tygodni. Najczęściej notuje się:

• postać węzłową , której głównym objawem jest powiększenie węzłów chłonnych gł. szyjnych, ale też podżuchwowych, karkowych, pachowych rzadziej pachwinowych. Średnica powiększonych węzłów może wynosić ok. 3 cm. Węzły mogą być bolesne, ale nie wykazują tendencji do ropienia i tworzenia przetok. Ponadto występuje osłabienie, stany podgorączkowe lub gorączka, apatia, zlewne pocenie się, bóle i zawroty głowy, bóle mięśniowo-stawowe

• postać brzuszna, cechująca się pogorszeniem łaknienia, bólami brzucha, wymiotami, powiększeniem wątroby lub śledziony, węzłów chłonnych krezkowych, żółtaczką.

• postać oczna lub oczno-węzłowa; Proces zapalny obejmuje warstwy wewnętrzne siatkówki na całej jej grubości i przylegającą naczyniówkę. Rzadko atakowany jest nerw wzrokowy (inaczej niż przy t. wrodzonej). Ma charakter przewlekły i nawrotowy. Poszerzające się zmiany bliznowate na dnie oka powodują ubytki w polu widzenia i obniżenie ostrości wzroku.

Wykrywanie.

Metody służące do wykrywania obecności T. gondii można podzielić na bezpośrednie mające na celu wykrycie pasożyta lub jego antygenu oraz pośrednie wykorzystujące właściwości immunogenne pasożyta, badające reakcji odpowiedzi immunologicznej zarówno humoralnej (wykrywanie przeciwciał, różnicowanie przeciwciał), jak i komórkowej organizmu żywiciela na inwazję parazyta (test skórny, transformacji blastycznej, rozetkowy).

metody bezpośrednie:

1. Największe znaczenie diagnostyczne ma izolacja T. gondii z materiału pobranego od zakażonego pacjenta. Pierwotniaki można wykrywać w preparatach wykonanych z wód płodowych, płynu mózgowo-rdzeniowego, płynu gałkowego, węzłów chłonnych i szpiku kostnego. Utrwala się je alkoholem i barwi metodą Giemsy lub Wrighta. Bardzo rzadko wykrywa się w ten sposób trofozoity. Lepiej stosować pobrany materiał do hodowli tkankowych lub wszczepienia go myszy. Wada: oczekiwanie na wynik ok. 6 tyg.

2. Poszukiwanie tachyzoitów w materiale biopsyjnym czy sekcyjnym.

3. Stwierdzenie krążącego, rozpuszczalnego antygenu toksoplazma we krwi i płynach ustrojowych (płyn owodniowy, mózgowo-rdzeniowy, wewnątrzgałkowy). Antygen ten występuje we krwi w ostrej fazie pierwotnego zakażenia.

metody pośrednie:

Polegają na wykrywaniu swoistych przeciwciał, które mogą być skierowane przeciwko cytoplazmie lub błonie komórkowej pasożyta. Przy czym na początku inwazji powstają przeciwciała skierowane przeciwko antygenom błonowym, w następnej kolejności antygenom cytoplazmatycznym.

1. Odczyn barwny Sabina-Feldmana. Polega na pochłanianiu barwnika błękitu metylenowego przez tachyzoity Tg (w teście używa się żywych toksoplazm). W obecności dopełniacza i specyficznych przeciwciał klasy IgG i IgM - tachyzoity się nie barwią. Odczyn jest wysoce czuły i swoisty, jednak nie różnicuje klas przeciwciał, może powodować zakażenia wśród personelu, dlatego obecnie nie używa się go powszechnie, ale stosuje jedynie jako test referencyjny.

2. Odczyn immunoenzymatyczny (ELISA) wykrywa wszystkie typy przeciwciał (IgG, IgM, IgA, IgE). Testy ELISA badające przeciwciała w klasie IgM i IgA są wykorzystywane do diagnostyki w toksoplazmozie wrodzonej. Metoda ta jest wysoce czuła i swoista.

3. Odczyn ELIFA (Vidas Toxo-IgG, Vidas Toxo-IgM) - w teście tym stosuje się błony mikroporowate. Test ten bada swoistość przeciwciał metodą immunoprecypitacji i charakterystykę izotopu przeciwciała metodą immunofiltracji z zastosowaniem przeciwciał znakowanych enzymem. Metoda ta wykrywa przeciwciała klasy IgG i IgM i ma zastosowanie w diagnostyce zarówno toksoplazmozy wrodzonej jak i nabytej.

4. Odczyn immunofluorescencji pośredniej - IFA wykrywa przeciwciała skierowane przeciwko antygenom powierzchniowym pasożyta, i może różnicować je między sobą przy zastosowaniu antyimmunoglobulin monoklonalnych. Test jest czuły, powtarzalny. Wadą tej metody jest występowanie wyników fałszywie dodatnich spowodowanych obecnością przeciwciał przeciwjądrowych lub czynnika reumatoidalnego. Testem tym bada się przeciwciała klasy IgG oraz IgM.

5. Test aglutynacji immunoadsorpcyjnej (ISAGA) - umożliwia wykrycie swoistych przeciwciał przeciwko Tg za pomocą aglutynacji z odpowiednim antygenem. Odczyn wykrywa przeciwciała klas: IgE, IgM/IgA. Wykrywanie przeciwciał techniką ISAGA PLUS IgA/IgM ma szczególne znaczenie w diagnostyce toksoplazmozy wrodzonej

Podstawowym celem diagnosty jest stwierdzenie czy istnieje zarażenie i jakie jest jego stadium choroby.

Dowody inwazji w toksoplazmozie nabytej:

1. Serokonwersja (odczyn ujemny przechodzi w dodatni)

2. Wzrost miana przeciwciała anty-Tg (wysoki poziom IgM)

3. Obecność krążącego antygenu rozpuszczalnego Tg

4. Wysoki poziom przeciwciał toksoplazmozowych IgG

5. Zmiany w węzłach chłonnych

6. Trofozoity w węzłach chłonnych, mięśniach i płynie mózgowo-rdzeniowym.

W toksoplazmozie wrodzonej zwraca się uwagę na:

1. Przeciwciała IgM we krwi niemowlęcia

2. Obecność rozpuszczalnego antygenu Tg

3. Wysoki poziom IgG

4. Obecność pasożyta w tkankach lub płynach ustrojowych płodu lub niemowlęcia.

U pacjentów z dominującymi objawami ze strony narządu wzroku lub OUN w surowicy krwi stężenie swoistych przeciwciał może być niskie ze względu na istnienie bariery naczyniowo-ocznej, czy izolowanej produkcji przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym. W takiej sytuacji można wyliczyć współczynnik korelacji, porównując miano przeciwciał w badanym płynie ustrojowym z ich mianem w surowicy. Współczynnik ten nosi nazwę wskaźnika Patasmana i wynosi 8 i powyżej dla oka, 4 b więcej dla OUN w zakażeniach wrodzonych.

U osób, u których badania serologiczne mogą nie dawać jednoznacznej odpowiedzi diagnostycznej (dzieci z nieprawidłową odpornością: AIDS, immunosupresja, niektóre noworodki; chorych z postacią mózgową lub oczną toksoplazmozy; w diagnostyce prenatalnej) można stosować metody molekularne - PCR. Metodą PCR można badać: krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn owodniowy, płyn wewnątrzgałkowy, łożysko.

Ponadto stosuje się badania nieswoiste:

1. radiologiczne - w diagnostyce zmian wewnątrzczaszkowych (tomografia komputerowa z podaniem środka cieniującego, rezonans magnetyczny), USG - w diagnostyce prenatalnej pozwalające wykryć uszkodzenia płodu np. wodogłowie, małogłowie, Rtg czaszki - umożliwia ocenę zwapnień wewnątrzczaszkowych

2. Badania okulistyczne

3. Badania neurologiczne

4. Badanie słuchu

A B

C

A: Tachyzoity T. gondii utrwalone formaliną wybarwione innmunofluorescencyjnie techniką OIF. Reakcja pozytywnah (tachyzoity + ludzkie przeciwciała w kierunku Toxoplasma + antyludzkie IgG wyznakowane FITC = fluorescencja.)
B: Negatywna reakcja OIF dla przeciwciał w kierunku T. gondii.

C: Negatywna reakcja OIF dla przeciwciał w kierunku T. gondii, efekt polarnego wybarwienia.

---