Strony 122-132

Klonowanie u ssaków

Klonowanie u ssaków obecnie przeprowadzane jest z 3 powodów:

-Aby dokonać nokautu genu, które jest ważne do ustalenia funkcji niezidentyfikowanego genu, zwykle przeprowadzane u myszy

-Do produkcji rekombinowanych białek w technice zwanej farmingiem

-W terapii genowej w komórkach ludzkich

Wirusy jako wektory dla ssaków:

Od wielu lat wiadomo że wirusy są kluczem do klonowania u ssaków. Pierwszy ekesperyment klonowania wykonano w 1979 uzywajac wirusa SV40. Jego genom miał wielkosc 5.2 kb, i zawieral geny „wczesne” odpoweidzialne za infekcje i geny „pozne” odpoweidzialen za pordukcje otoczek biąłkowych wirusa. Jednak cierpiał na te same problemy co na przykład kaulimowirusy, istniałą bardzo ograniczona wielkosc insertu jaki można było w niego wklonowac. Trzeba było astpaic jeden z istniejacych genów, izamist niego wstawic insert. Wybrano jeden z genów późnych, leczp ozniej probowano tego również z genami wczesnymi.

Od roku 1979 zbadano wiele grup wirusow i kilka z nich okazało się przydatnych, jak np.

-Adenowirusy(AV), które miescily inserty do 8 kb. lecz swój własny genom mialy jeszcze wiekszy niż SV40 i były trudne do manipulacji.

-Papillomawirusy(PV), powodujące brodawki u bydła, które mialy duza pojemnosc do insertów, jak również w przebiegu ich cyklu infekcji, nastepowała korzystna mulitplikacja plazmidow do ąz 100 na komorke. Wektory transferowe powstałe w oparciu o bydlęcy papillomawirus(BPV) i E. Coli, mogly dzialac zarówno w komorkach myszy jak i E. Coli, przez co produkowały zrekombinowane białka.

-Adeno-podobne wirusy (AAV), ich struktura nie przypomina adenowirusów, lecz podobnie jak one są znajdowane w tych samych tkankach, ponieważ AAV korzystają z części białek produkowanych przez adenowirusy. W braku obecnosci adenowirusów, AAV integruje się z genomem gospodarza, w przypadku ludiz zajmujac zawszo to samo miejsce w chromosomie 19. Wiedza o tym miejscu pozwlaa dokaldnie zpalanowac eksperyment genetyczny, przez co AAV mają olbrzymi potencjał.

-Retrowirusy, najczesciej używane w terapii genowej, integrują się z DNA gospodarza w przypadkowych miejscach, lecz istotne jest że pozostają w nim bardzo stabilne.

Genom SV40 i wektora opartego na nim, SVGT-5:

Klonowanie bez wektorów

Jednym z głownych powodów niezbyt rozszerzonego dziaąłnia i uzytkowania iwrusów jako wektorów jest to że odkryto jest w moemncie gdy na uzytku powszechnym była mikroiniekcja wstrzykujaca bezposrednio do komórek odpowednie DNA. Było to łątwiejsze niż uzywanie wirusów choćby ze względu na ich wirulentność, grozącą zniszczeniem komórek i uszkodzeniem zawartego wnich DNA oraz nieprzewidywlanością ich użycia.

Mikroniekcja DNA jest podstawą do wykreowania transgenicznych zwierząt które zawieraja klonowane DNA we wszystkich swoich komórkach.Transgeniczne myszy mogą być generowane przez mikroiniekcję z zapłodnionej komórki jajowej, która jest następnie hodowana in vitro przez kilka podziałów komórkowych, a następnie wszczepiona do matki zastępczej.
Alternatywnie używane są zarodkowe komórki macierzystych (ES), które cechuje totipotencjalność, co oznacza że mogą róznicować się do dowlnego, czyli z komórki maciezystej możep owstac po róznicowaniu dowlona komórka, np. komórka jajowa, komórka szpiku, wątroby, nie jest to okrelsone przed etpaem roznicowania. Po mikroiniekcji na ES, powstaje chimera, która zaieera czesc komórek z klonami, a czesc niezmienionych. Otrzymanie niechimerycznych myszy, które zawieraja tylko sklonowany material odbywa się po skrzyzowaniu chimer, ponieważ niektóre komórki jajowe chimer zawieraja wylacznie sklonowane geny.

Wielokrtona liczba sklonowanego DNA w chimerze:

ROZDZIAŁ 8

Jak uzyskać klon określonego genu?

Do tej pory rozpatrywalismy spsooby wszczepiania klonów genów do roznorakich wektorów oraz omawialiśmy w jaki spsoób owe wektory są używane oraz jak rozpoznac komórki które nasze klony zawierają(selekcja rekombinantów). Teraz musimy spojrzeć na dostępne metody uzyskiwania klonu pojedynczego,określonego genu. Jest to krytyczny moment od którego zależy sukces lub niepowodzenie eksperymentu klonowania, wszystko jest zależne w nim od strategii którą przyjmiemy do wyobru konkretnego genu i odrożnenia go od innych. Kiedy problem roziwazemy i wybierzemy odpowedni klon genu, biolodzy molekularni wyssaja z niego wszystkei informacje spsoobami które przedstawione zostaną w rozdizalu 10 i 11. W tym rozdizale zajmiemy się tym jak wybrać pożądany klon genu.

8.1 Problem selekcji

Problem selekcji jest opisany na rys. 1.4 na samym początku. Nawet najprostszy organizm jak E. Coli zawiera tysiace genów i po przecieciu ich restryktazmi otrzymujemy fragmenty niosiace nasz pożądany klon jak i inne klony , niosace inne geny. Po ligacji nie nastepuje odróżnienie rekominató od siebie - każdy zaiwera pewne cząstki , kawąłki różne od innych z oglnej puli wprowadoznych przez nas insertów. W konsekwencji otrzymujemy rekombinanty, które zawieraja roznorodne geny, z których musimy wybrać ten włąsciwy, który bedziemy pozniej badac.

Problem selekcji:

Wystpeuja roznorakie procedury prowadzace do uzyskania z takeij mieszaniny rekombinantów pozadanego genu, wszystkie bazują na dwóch schematach:

• Bezpośrednia selekcja(8.2a), polega na tym że jedyne klony jakie uzyskujemy, to wlasnie klony poszukiwanego genu, żadne inne nie wystepują

• Identyfikacja klonu z biblioteki genów, która polega na przeszukaniu biblioteki genów, wytoroznej dzięki metodom typu „shotgun” , która zawiera wszystkie geny zawarte w komórce. Analiza takiej biblioteki pod kątem odpowedniej prowadzi do jego wyselekcjonowania.

Co jest jasne, bezpośrednia selekcja jest szybka i zazwyczaj to ona jest używana, jednak zdarzaja się sytuacje w których nie można jej zaaplikować do wszystkich i wowoczas przeszukanie biblioteki okazuje się jedynym wyjsciem, na szescie są ku temu pewne techniki.

Obydwie strategie:

8.2 Bezpośrednia selekcja

Spsobem na uzyaknie wlasciwych klonów na tej drodze jesy wysianie transformantów na płytce z agarem, gdzie kolonie które urosną będą jedynymi rekombinantami, które zaiwerają szukane przez nas geny. Najprostszym spsobem jest uzycie genów markerowych do selekcji, przede wszystkim tych odpoweidzlanych za odporność na antybiotyki. Przykłądem jest tu plazmid R6-5, który zaiwera geny odpornosci na 4 antybiotyki: kanamycyne, chloramfenikol, streptoymcyne i sulfonamid. Aby sklnowac gen odpronsci na kanamycyne, należy pociac go restryktazą EcoRI, gdyż znajduja się na nim miejsca rozpoznawane przez nią(13 takich miejsc) i otrzyamne jego kawałki(13 róznych typów kawałków) wklonować do pBR322, który w miedzyczasie tez zsotanei pociety przez EcoRI w odpowednich miejscach. Po ligacji pBR322 zaiwera różne inserty z R6-5 z których jeden(z 13) nosi w sobie gen odpornosci. Aby taki plazmid wyslekcjnoowac wysiewa się go an podloze z kanamycyną, na którym urosnie tylko bakteria, która go przyjęła i żande inne, które przyjęły inne fragmenty z plazmidu R6-5.

Rysunek do tego:

Bezpośrednia selekcja byłaby ogranicozan tylko do klonowania genów odporności na antybiotyki, gdyby nie technik iuzywajace zmutowanych bakterii E. Coli jako gospodarzy.

Dla przykladu rowazmy eksperyment klonowania genu trpA u E. Coli. Ten gen odpowiada za syntezę jednego z enzymów odpoweidzlanych za produkcję tryptofanu. Używamy szczepu auksotroficznego E. Coli, który ma uszkodozny ten gen, nazwijmy go szczepem trpA^- , ów mutant może przetrwać tylko jeśli tryptofan jest w podłożu, bo sam nie potrafi go sobie zsyntetyzować.

Eksperyment kolnowania przperowadzamy tak, że DNA typu dzikiego czyli zaiwerające nieuszkodzone geny, jest ciete na kwałki przez restryktazy i włączne do wektorów. Mieszanina po ligacji zawiera wektory z który jeden lub klilka mogą zawierać nieuszkodzną wersje genu trpA. Wektory uzywamy do transformacji zmutowanych komórek E. Coli i wysiewamy owe komórki na podłoze minimalne nie zaiwrające tryptofanu. Mogą na nim przezyć tylko rekombinanty zawierające gen trpA pochodzacy z wektora.

Rysunek do tego:

Chociaz uzywanie genów markerowych jest bardzo użyteczne ma ono dwa ograniczenia: musi być dostpeny szczep auksotroficzny(zmutowany) oraz wymagane jest konkretne podłoze na którym nastąpi selekcja rekombinantów z pożadanym genem. Geny markerowe mogą śłuzyc sleekcji dowlnych genów odpornosci na antybiotyki oraz odpowieidzlanych za produkcje aminokwasów. Nie są one ogranicozne do E. Coli ani nawet do bakterii, mogą być z powodzeniem używane u grzybów nitkowatych i drożdzy. Mogą być nawet uzyte do selekcji genów które normalnie w danym organizmie nie wystepują.

8.3 Identyfikacja klonu z biblioteki klonów

Choć bezposrednia selekcja jest łatwa w uzyciu, trzeba pamietac ze nie otrzymano wystarczającej ilości auksotrofów do badania wszystkich genów, jak również ta meotda zawodzi przy uzyciu genów z roślin lub zwierząt. Dlatego trzeba rozwazyc uzycie bibliotek klonów.

Biblioteka genów lub biblioteka genomowa to nazwa zbioru klnów, czyli transformoanych komórek, które przyjeły plazmidy lub inne wektory z genami. Reprezentuja ona cały genom organizmu. Powstaje ona przez oczyszczanie całkowitego komórkowego DNA, pociecie go restryktazami i umieszczenei fragmentów w wektorach. używane są wszystkei poznane przez nas wektory, a im wiekszy genom jest ciety, tym pojemniejszych wektorów uzywamy. Wektory transformuja nastpenie odpoednie komórki gospodarzy, których kolonie przechowywane na płytkach stanowią katlaog wszystkich genów organizmu, którego DNA mielismy na początku. Wp rzypadku bakterii, drożdży lub grzybów biblioteki zawieraja dokaldnie wszystkie geny tych zyjatek, lecz w przypadku ssaków lub rolsin, genów jest zbyt duzo, stąd biblioteki dla tych organizmów zaiwerają tylko geny pochodzace z okrelsonych typów komórek.

Charakterystyczną cechą wielokomórkowych organizmów jest specjalizacja poszczeglnych typów komórek. Korki clzoweika zaleznie od ich wystepowania zawieraja te same komplety genów, np. komórki watroby maja ten sam genom jak komórki mózgu, lecz inne geny aktualne są wyciszane w obu typach komrek, przez co ekspresjonowany w obu typach jest inny komplet białek. Ten fakt zostął wykorzystany przez twórców bibliotek w których przechowywane nie jest DNA, lecz mRNA. Jest to znakomity pomysł ponieważ mRNA zawiera w sobie transkrypty genów aktualnie uzywanych w danym typie komórki, co oznacza ze jego przechowanie odzwierciedla tylko używane geny, a pomija te wyciszane. Ta metoda jest szczególnie użyteczną jeśli gen jest ekspresjonowany w dużych nakładach, tak jak np. geny gliadyny, które w odpowednich typach komórek maja wysoki poziom ekspresji. W tych komrkach około 30% mRNA dotyczy genów gliadyny, wiec jelsi zdecydujemy się stowrzyc biblioteke opartą na tym mRNA, wówczas dostaniemy duza ilość klonów specyficznych dla gliadyny.

Przygotowanie biblioteki genów:

Specjalziacja komórek, różne geny są ekspresjonowane w róznych typach komórek:

---