POMIAR ILOŚCI DNA W PRÓBIE

Jakość DNA można oceniać za pomocą różnych metod, włączając w to badanie absorbancji (gęstości optycznej), elektroforezą w żelu agarozowym lub użyciu fluorescencyjnych barwników wiążących DNA. Wszystkie trzy metody są wygodne, ale mają różne wymagania w zakresie sprzętu laboratoryjnego, wykonania i obliczeń które należy wykonać.

Metody wykorzystujące pomiar absorbancji

Najbardziej powszechną techniką w celu określenia czystości i ilości DNA jest pomiar absorbancji. Wymagany sprzęt ogranicza się do spektrofotometru wyposażonego w lampę UV, specjalne kuwety (w zależności od urządzenia) i roztwór oczyszczonego DNA. Odczyty absorbancji przy długości fali A=260 nm przeprowadza się z tego względu, że DNA absorbuje wtedy światło najsilniej, a odczytana wartość pozwala oszacować stężenie roztworu. Aby mieć pewność, że uzyskane wartości są miarodajne, odczyt powinien mieścić się w zakresie liniowym urządzenia (z reguły 0,1-1,0).

Stężenie DNA określa przez pomiar absorbancji przy 260 nm, dostosowując pomiar do wartości zmętnienia (zanieczyszczenia najlepiej pochłaniają światło przy długości fali = 320 nm). Dokonuje się tego odejmując wartość A=260nm od A=320nm, a następnie mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia i stosując zależność, w której absorbancja 260 = 1,0 gdy w próbie mamy 50μg/ml czystego dsDNA:

Stężenie (μg / ml) = (odczyt A260 - odczyt A320) x współczynnik rozcieńczenia × 50μg/ml

Całkowita zawartość DNA (µg) jest uzyskiwana gdy pomnożymy stężenie DNA przez końcową objętość oczyszczonej próbki.

Wydajność DNA (µg) = stężenie DNA × całkowita objętość próbki (ml)

Jednak DNA nie jest jedyną cząsteczką, która może absorbować promieniowanie UV przy 260 nm. RNA ma również największy zakres absorbancji przy 260 nm, aminokwasy aromatyczne obecne w białku szczyt absorpcji uzyskują przy 280 nm. Gdy w roztworze badanym znajdą się obydwa zanieczyszczenia DNA, jeśli są obecne w roztworze DNA, przyczynią się one do zafałszowania wyniku. Dodatkowo, obecność guanidyny prowadzi do wyższej absorbancji przy długości fali = 260 nm. Oznacza to, że jeśli wartość przy A260 jest używana do wyliczenia ilości DNA, jego faktyczna zawartość może wydawać się większa niż w rzeczywistości.

Aby ocenić czystość DNA, należy zmierzyć absorbancję od 230nm do 320 nm w celu wykrycia innych możliwych zanieczyszczeń. Najczęściej do obliczenia czystości, używa się obliczenia stosunku absorbancji przy 260 nm podzieloną przez odczyt przy 280 nm. Dobra jakość DNA będzie miała wartość A260/A280 w granicach 1,7-2,0. Odczyt 1,6 nie eliminuje DNA do dalszych analiz, ale niższe wskaźniki wskazują, że obecnych jest tam więcej zanieczyszczeń. Wskaźnik można obliczyć po uwzględnieniu wartości zmętniania próby (szczyt absorbancji dla zmętnienia występuje przy A=320 nm).

Czystość DNA (A260/A280) = (odczyt A260 - odczyt A320) ÷ (odczyt A280 - A320 odczyt)

Silna absorbancja przy około 230nm może wskazywać, na zanieczyszczenie związkami organicznymi lub solami chaotropowymi. Stosunek 260 / 230 może pomóc ocenić poziom obecności soli w oczyszczonym DNA. Im niższy stosunek, tym np. większa ilość soli tiocyjanianu obecnego w roztworze. Jako wytyczna, wartość A260/A230 jest najlepsza, gdy jest większa od 1,5. Odczyt przy 320 nm wskazuje, czy roztwór jest mętny (zanieczyszczony drobnymi cząsteczkami). Dlatego też, dobrze jest wykonać analizę spektrum zanieczyszczeń, w zakresie od 230nm do 320 nm.

Tabela:  Substancje absorbujące i charakterystyczne dla nich długości fali [8].

Wykonanie pomiaru czystości DNA/RNA:

* Próbkę DNA/ RNA przed pomiarem rozmrozić i trzymać na lodzie. Bezpośrednio przed pomiarem zvortexować lub przepipetować góra-dół aby ją dobrze wymieszać.

* W menu urządzenia wybrać odpowiednia opcję (w przypadku NanoDrop'a 1000 jest to “Nucleic Acids”->ds DNA/ ssDNA/ RNA. Opcje różnią się wartością jednostkowej absorbancji przyjmowaną w przeliczeniu na stężenie, należy o tym pamiętać!)

* Przygotować czystą wodę (do inicjalizacji) oraz bufor, w którym rozpuszczany był kwas nukleinowy (próba “ślepa” używana jako kalibrator). Inicjalizację i kalibrację wykonać nakrapiając każdorazowo 1,2-1,5µl płynu.Za każdym razem zetrzeć szmatką okienko spektrofotometru.

* Nałożyć 1,2-1,5µl próbki na okienko, uważając na ewentualne bąbelki powietrza, które mogą zafałszować pomiar. Po wykonaniu pomiaru okienko przemyć wodą i przetrzeć szmatką.

↑TAK JEST MIODZIO↑

(krzywe przy 230 charakterystycznie schodzą, a przy 260 wskazują na zawartość DNA/RNA)

Inne rodzaje zanieczyszczeń DNA/RNA:

* Zanieczyszczenia fenolem powodują wzrost absorbancji w zakresie 200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Obraz (w przypadku ryciny 3 dotyczy próbek znaczonych strzałką, oprócz jasnoniebieskiej) jest podobny jak w przypadku zanieczyszczenia solami chaotropowymi. Takie DNA/RNA nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych. A260/230 i A260/280 mogą przyjmować zaskakujące wartości (>2. lub <1,4 w zależności od stężenia fenolu i towarzyszących zanieczyszczeń, np. chloroformu i alkoholu izoamylowego)

Zanieczyszczenie fenolem (czerwona strzałka) oraz niepoprawna aplikacja próbki na okienko (oznaczone czarnymi strzałkami)

* Zanieczyszczenie izotiocyjanianem lub chlorkiem guanidyny - widoczne na ryc. 2 (krzywa czarna i jasnozielona). Wydatny pik przy długości fali 230nm i towarzyszące mu przesunięcie absorbancji DNA/RNA w prawo w kierunku 270nm to cechy charakterystyczne tej kontaminacji. Taka próbka w żadnym wypadku nie nadaje się do zastosowań enzymatycznych, sole izotiocyjanianu są silnymi zwiazkami chaotropowymi i unieczynniają eznymy! Najczęściej oba parametry A260/A280 i A260/A230 <1,4.

Zanieczyszczenie solami chaotropowymi. Charakterystyczna „skocznia mamucia” na wykresie absorbancji.

* Zanieczyszczenie białkami - powodują wzrost absorbancji w zakresie 200-230 nm i rozszerzenie krzywej w zakresie 250-280 nm. Przy niewielkim zanieczyszczeniu (<0,1% ) możemy nie obserwować „górki” z prawej strony wykresu, a jedynie niewielki spadek A260/280.

Wysokie zanieczyszczenie białkowe DNA we wszystkich próbkach.

* Zanieczyszczenie etanolem i/lub izopropanolem - nie obserwuje się znaczącej zmiany absorbancji, szczególnie w roztworach zbuforowanych. W wodzie parametr A260/230 może być nieznacznie obniżony. Przy niewielkiej domieszce etanolu reakcje enzymatyczne nie są mocno zakłocóne, warto jednak przywiązywać wagę do dokłądnego wysuszenia pelletu przd rozpuszczeniem, ponieważ zanieczyszczenia etanolem i izopropanolem są niewykrywalne spektrofotometrycznie!

* Zanieczyszczenie DNA przez RNA (i vice versa)- oba kwasy nukleinowe są koekstragowane i zazwyczaj występują razem po izolacji. Mają także bardzo zbliżoną pochłanialność i emisję światła, więc są nirozróżnialne spektrofotometrycznie. W przypadku konieczności pozbycia się DNA z RNA musimy wykonać trawienie próbek DNAzą.

Przyczyna złych/dziwnych wyników pomiaru absorbancji:

* A260/230 jest >2,3

Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez spektrofotometr. Objawia się to poszarpaną krzywą (ryc. 2)

* Absorbancja A260 jest ujemna.

Powodem może być kalibracja urządzenia innym buform niż użyty do rozpuszczenia próbek (np.woda vs TRIS-HCl). Inna możliwość to nieprawidłowe nakropienie próbki na okienko i pomiar powietrza zamiast kropli przez spektrofotometr. (ryc. 2)

* Urządzenie nie potrafi wyznaczyć absorbancji

Próbka zawieszona jest w pieniącym się bądź lepkim buforze, nakropiono zbyt mało próbki bądź poza strefą pomiaru (okienko jest puste).

Przykład:

jeżeli 5 μl wyekstraktowanego DNA w 1000μl (1ml) daje nam 0.14 (A260 - A320)

to współczynnik rozcieńczenia = 1000 / 5 = 200

0.14 X 200 X 50 = 1400 μg/ml lub 1.4 mg/ml

---