Sprawozdanie z podstaw genetyki

Wykonali:

Błaszczak Łukasz

Boczewska Klaudia

Durzyńska Sylwia

Dietetyka grupa 1
Celem ćwiczenia jest samodzielne wyizolowanie własnego materiału genetycznego oraz diagnostyka oporności na wirus HIV z użyciem gotowego zestawu diagnostycznego PCR

Do najważniejszych etapów pracy z DNA należy zaliczyć m.in.:

• odpowiednie pobranie materiału biologicznego

• odpowiednie przechowywanie próbki

• izolacja DNA oraz jego charakterystyka

Ostatni przykład jest jednym z najważniejszych etapów pracy z DNA. Musi on zapewniać wysoką jakoś preparatu DNA, umożliwiającego wykonywanie analiz. Jeśli dojdzie do zdegenerowania lub zniszczenia DNA nie uzyska się wyników.

Cel izolacji: uzyskanie z maksymalną wydajnością wysokocząteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatu DNA z białek i inhibitorów enzymów, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA

Procedura oczyszczania DNA składa się z 4 etapów i jest przeprowadzana z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajne i selektywne wiążące kwasy nukleinowe. Próbka wymazu poddawana jest lizie enzymatycznej z wykorzystaniem zoptymalizowanego buforu SSL Buffer oraz silnej proteazy (proteinazy K). Na tym etapie degradacji ulegają błony oraz wszystkie białka komórkowe. Po dodaniu soli chaotropowych i etanolu, lizant przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA zawiązanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest z minikolumny buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (pH 7-9) i jest gotowe do wykorzystania w technikach biologii molekularnej (np. PCR) lub może być przechowywane do późniejszego użycia

Aby pobrać od badanej osoby materiał potrzebny do izolacji należy mocno potrzeć pałeczką wymazową wewnętrzną stronę policzka w celu pobrania wymazu z błon śluzowych jamy ustanej, a następnie końcówkę z pobranymi komórkami nabłonka umieścić w probówce 1,5 ml typu Eppendorf i odciąć wystający patyczek. Osoba badana nie powinna nic spożywać co najmniej na pół godziny przed pobraniem wymazu.

Następnie dodajemy 350 μm buforu do lizy SSL Buffer oraz 6 μm Proteinase K i worteksujemy przez 3 sekundy.

Inkubujemy przez 30 minut w temperaturze 56 °C. W czasie inkubacji należy kilka razy odwracać probówki w celu mieszania.

Po inkubacji dodajemy 350 μm buforu wiążącego SSB Buffer i worteksujemy przez 3 sekundy.

Inkubujemy przez 6 minut w temperaturze 70 °C.

Następnie aby uzyskać jak największą ilość lizatu dokładnie wyciskamy o ścianki probówki końcówkę pałeczki, a później odrzucamy pałeczkę wymazową. Jeśli nie usuniemy pałeczki wymazowej z próbówki może wypłynąć to na obniżenie wydajności izolacji DNA ze względu na niecałkowite naniesienie lizatu na minikolumnę.

Później dodajemy 200 μm 96 - 100 % etanolu, mieszaninę należy mieszać przez kilkakrotne odwracanie probówki.

Następnie przenosimy 700 μm lizatu na złożę minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej.

Wirujemy przez 1 minutę przy 10 - 12 tys.rmp.

Po wirowaniu wylewamy przesącz z próbówki odbierającej i umieszczamy w niej z powrotem minikolumnę.

Następnie nanosimy całą pozostałą objętość lizatu na złoże minikolumny.

Ponownie wirujemy przez 1 minutę przy 10 - 12 tys.rmp.

Po wirowaniu przenosimy minikolumnę do nowej próbówki odbierającej (2 mm).

Do minikolumny dodajemy 600 μm buforu płuczącego SSW1 Buffer i wirujemy przez 30 sekund przy 10- 12 tys.rmp.

Wylewamy przesącz z próbówki odbierającej i umieszczamy w niej z powrotem minikolumnę.

Dodajemy do minikolumny 400 μm buforu płuczącego SSW1 Buffer i wirujemy przez 2 minut przy 12 - 14 tys.rmp .

Następnie „wirujemy na sucho” - po opróżnieniu probówki odbierającej wirujemy suchą kolumnę przez 1 minutę przy 12 - 12tys.rmp.

Ostrożnie wyjmujemy suchą kolumnę z probówki odbierającej i umieszczamy ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.

Nanosimy 50 - 100 μm Elution Buffer podgrzanego do temperatury 70 °C centralnie na złoże w minikolumnie.

Inkubujemy kolumnę z buforem przez 2 minuty.

Po inkubacji wirujemy przez 1 minutę przy 10 - 12 tys.rmp.

Usuwamy minikolumnę, a wyizolowane DNA przechowujemy w temperaturze +4°C lub -20°C do czasu następnych analiz.

Elektoforeza

Techniki elektroforetyczne wykorzystywane są do rozdziału cząsteczek na podstawie szybkości poruszania się w polu elektrycznym. Szybkość ta powiązana jest z ich ładunkiem i masą. Kwasy nukleinowe w buforach o pH bliskim neutralnego obdarzone są ładunkiem ujemnym i poruszają się w stronę dodatniej anody. Rozdział następuje więc na podstawie masy odpowiednich fragmentów co pozwala na ustalenie ich wielkości, ustalenie degradacji preparatu oraz określenie ewentualnych zanieczyszczeń (białko, RNA). Do rozdziału kwasów nukleinowych wykorzystuje się dwa typy żelów: agarozowy i poliakrylamidowy. Elektroforeza poliakrylamidowa (PAGE) umożliwia rozdział mniejszych cząstek od 5 - 1000 pz, natomiast przy użyciu elektroforezy na żelu agarozowym możliwy jest rozdział fragmentów nawet do 20 kpz.

Elektroforeza musi być przeprowadzana w odpowiednim buforze. Najczęściej stosowanym buforem jest TAE (Tris-octan, EDTA) lub TBE (Tris-boran, EDTA).

Przed naniesieniem na żel próbki zawiesza się w buforze zawierającym „obciążacz” (glicerol, Ficoll lub sacharoza) oraz barwnik umożliwiający śledzenie przebiegu elektroforezy (Xylene cyanol/cyjanol ksylenowy - niebieski, Bromophenol blue/błękit bromofenolowy - fioletowy lub Orange G/oranż G - pomarańczowy).

Umieszczenie w niektórych studzienkach fragmentów DNA o znanej wielkości (tzw. wzorców DNA) pozwala na dokładny pomiar masy cząsteczkowej badanych fragmentów.

Prążki DNA w żelu barwi się przy użyciu bardzo małych stężeń barwnika fluoryzującego w świetle nadfioletowym UV - np. bromku etydyny (emituje światło o pomarańczowym zabarwieniu), wbudowującego się między zasady (interkalacja). Już nawet kilkadziesiąt ng DNA można wykryć bezpośrednio w żelu w świetle lampy UV. Należy pamiętać, że obecność związku interkalującego do DNA w żelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. Innym barwnikiem DNA jest np. SYBR Green, którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25 razy większa niż EtBr.

Elektroforeza w żelu agarozowym

Agaroza - polisacharyd rozpuszczony w roztworze wodnym tworzy stały żel. Jest to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów. Polisacharyd ten zbudowany jest z około 800 liniowo połączonych reszt heksozy (inaczej 400 reszt agarobiozy). Agarobioza to dwucukier zbudowany z D-galaktozy i 3,6- anhydro-L-galaktozy. Powstawanie żelu agarozowego jest reakcją odwracalna, w wyniku której pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę III-rzędową. Łańcuchy te rozgałęziając się tworzą sieć. Wielkość porów żelu agarozowego zależy od stężenia agarozy i określa zakres ciężaru makrocząsteczek np. DNA czy RNA, które można w niej elektroforetycznie rozdzielać.

Kiedy poddamy żel działaniu pola elektrycznego w obecności buforu, który przewodzi prąd elektryczny, fragmenty DNA migrują w żelu w kierunku elektrody dodatniej (DNA ma silny ładunek ujemny) z szybkością zależną od ich wielkości i kształtu. Proces ten może być zatem wykorzystywany do rozdzielenia mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości (rys.1).

Małe liniowe fragmenty poruszają się szybciej niż większe, których ruch jest silniej hamowany przez plątaninę włókien agarozy tworzących żel. Szybkość, z jaką przesuwa się w żelu cząsteczka DNA jest odwrotnie proporcjonalna do jej masy cząsteczkowej.

Elektroforeza agarozowa jest powszechnie stosowana w laboratoriach biologicznych. Wykorzystuje się ją w takich eksperymentach biologii molekularnej jak: sekwencjonowanie, foot-printing, analizy produktów PCR, primer extension. Oprócz zastosowań analitycznych, wykonuje się również rozdziały preparatywne, pozwalające na oddzielenie prążka o interesującej nas masie i elucji DNA do roztworu.

Przygotowanie formy na żel:

Wkładamy tackę na żel do formy do wylewania żeli (ciemny pasek musi znajdować się pomiędzy rowkami przytrzymującymi grzebień), następnie wybraliśmy grzebień o odpowiedniej grubości i liczbie zębów) i umieścić w formie.

Wykonanie żelu o grubości ok. 5 mm:

Do kolby szklanej dodaliśmy 0,7 g agarozy i 70 ml TBE. Rozpuszczaliśmy przez ok. 2 min w mikrofalówce, ostudziliśmy do temp ok. 50-60 stopni Celsjusza. I dodaliśmy 14 µl bromku etydyny. Wymieszaliśmy i wylaliśmy do saneczek. Końcówką do pipety usunęliśmy powstałe nieliczne pęcherzyki powietrza. Żel spolimeryzował po ok. 15 minutach.

Wykonanie elektroforezy:

Z otrzymanego żelu wyjeliśmy grzebień.

Umieściliśmy saneczki w aparacie do elektroforezy, a następnie wypełniliśmy zbiornik buforem do elektroforezy, aż do przykrycia żelu (ok. 2 mm nad powierzchnią żelu).

Końcówką od pipety przepłukaliśmy kieszonki buforem do elektroforezy.

Przygotowany wcześniej marker znanych wielkości DNA M100-500 (2,5 μl markera + 0,5 μl buforu obciążającego 6 x Green) lub 2,5 μl markera Ready to use DNA M100-500 (Green) umieściliśmyć w pierwszej, lewej kieszonce, natomiast przygotowane próbki wyizolowanego DNA (10 μl DNA + 2 ul 6 x Green) nanieśliśmy do kolejnych kieszonek w żelu.

Zapisaliśmy kolejność naniesionych próbek. Przykryliśmy zbiornik pokrywą, podłączyliśmy elektordy do zasilacza, zasilacz do prądu i włączyliśmy przycisk znajdujący się z tyłu urządzenia.

Elektroforezę prowadziliśmy przy napięciu 110 V i natężeniu 250 mA. Nacisnęliśmy przycisk „start” i prowadziliśmy elektroforezę.

Po zakończeniu elektroforezy wyłączyliśmy całą aparaturę, zlaliśmy bufor z saneczek osuszyliśmy je, a następnie przenieśliśmy do komory systemu wizualizacji.

Otrzymany obraz elektorforezy



Amplifikacja DNA metodą PCR:
-umożliwia specyficzną amplifikację in vitro wybranych odcinków DNA i RNA przepisanych na cDNA
dzięki wykorzystaniu dwóch starterów komplementarnych co do sekwencji docelowej
- niezbędna jest znajomość sekwencji nukleotydowej
- czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów (fragmentów DNA) ponad 1
milion razy mimo obecności innych sekwencji

Co jest potrzebne do przeprowadzenia amplifikacji DNA metodą PCR i do czego?:
1. Jednoniciowe DNA/cDNA - matryca
2. Dwa startery komplementarne do matrycy - ograniczają długość syntetyzowanego łańcucha
3. dNTP - substraty reakcji dostarczają energii do jej przebiegu
4. Termostabilna polimeraza DNA Taq lub Hypernova - enzym katalizujący reakcję
5. Kationy Mg²⁺ - wpływają na prawidłowy przebieg procesu hybrydyzacji oraz na aktywność
enzymu polimerazy, mają pozytywny wpływ na ilość i jakość uzyskanego produktu
6. Bufor reakcyjny - uzupełnienia niezbędne do aktywności enzymu jony metali (Mg lub K)



Reakcja amplifikacji DNA składa się z powtarzających się cykli a każdy z nich z trzech etapów:
1. Denaturacja dwuniciowego DNA - rozplecenie podwójnej helisy DNA matrycowego w 92-96⁰C
2. Przyłączenie starterów do komplementarnych sekwencji zdenaturyzowanej matrycy DNA w 32-
37⁰C
3. Wydłużenie starterów - polega na dołączeniu począwszy od wolnego końca 3' - OH startera,
nukleotydów komplementarnych względem amplifikowanej nici DNA w 72⁰C

Ogólny sposób wpisywania programu termogramatora:
nazwanie programu: klikamy przycisk enter → wpisujemy nazwę naszego programu → klikamy przycisk enter
wybór temperatury: wybieramy „Block” i klikamy enter → wybieramy „Segment 1” → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → klikamy przycisk enter → wybieramy „Cycle” → klikamy przycisk eneter → „3 step” → klikamy przycisk enter → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → klikamy przycisk enter → option? Wybieramy „NO” → wpisujemy temperatury i czasy potwierdzając enterami → krok 3 → w „Cycle” wpisujemy ilość cykli → klikamy przycisk enter → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → segment 5. : wybieramy „END” → Save? Wybieramy „Yes”


Warunki na których uczyliśmy się obsługi termocyklera:
1. Wstępna denaturacja: 4 minuty 95⁰C
2. Denaturacja: 40 sekund 96⁰C
3. Dołączenie primerów: 40 sekund 50⁰C 34 cykle
4. Elongacja: 1 minuta 71⁰C
5. Wydłużanie końcowe: 2,5 minuty 71⁰C



Właściwe warunki w jakich było przeprowadzone ćwiczenie:
1. Wstępna denaturacja: 2 minuty 96⁰C
2. Denaturacja: 30 sekund 96⁰C
3. Dołączenie primerów: 30 sekund 55⁰C 40 cykli
4. Elongacja: 30 sekund 72⁰C
5. Wydłużanie końcowe: 2 minuty 72⁰C
6. ∞ 4⁰C



Wpisywanie programu termocyklera użytego w ćwiczeniu:
nazwanie programu: klikamy przycisk enter → wpisujemy nazwę naszego programu → klikamy przycisk enter
wybór temperatury: wybieramy „Block” i klikamy enter → wybieramy „Segment 1” → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę (96⁰C ) i czas (2 minuty) potwierdzając enterem → klikamy przycisk enter → wybieramy „Cycle” → klikamy przycisk eneter → „3 step” → klikamy przycisk enter → wpisujemy temperatury i czasy 1. 30 sekund 96⁰C
2. 30 sekund 55⁰C
3. 30 sekund 72⁰C
potwierdzając enterami → klikamy przycisk enter → „option?” Wybieramy „NO” → wpisujemy temperaturę (72⁰C) i czas (2 minuty) potwierdzając enterami → krok 3 → w „Cycle” wpisujemy ilość cykli (40) → klikamy przycisk enter → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę (4⁰C) i czas (99 minut) potwierdzając enterem → segment 5. : wybieramy „END” → „Save?” Wybieramy „Yes”

Przygotowanie reakcji PCR

Przygotowaliśmy mieszaniny reakcyjne dla 8 próbek badanych

a) 4 próbki grupy

b) 2 próbki kontroli pozytywnej

c) 2 próbki kontroli negatywnej

Do eppendorfu 500μl trzymanego na schłodzonej podstawce dodaliśmy 158 μl Master Mix, 20 μl mieszaniny dNTPs i 2 μl polimerazy DNA (w sumie 180 μl mieszaniny reakcyjnej). Zawartość eppendorfu przepipetowaliśmy 6-7 razy bardzo powoli.

Do eppendorfu 200μl dodaliśmy 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej oraz 2,5 μl DNA. Zawartość przepipetowaliśmy 3 razy bardzo powoli i schowaliśmy do lodówki.

I Próby wspólne

Do 2 eppendorfów 200 μl podpisanych „188 pz” i „220 pz” dodajemy :

1) 188pz- 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej oraz 2,5 DNA kontroli pozytywnej 188 pz

2) 220 pz- - 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej oraz 2,5 DNA kontroli pozytywnej 220 pz

Przepipetowaliśmy 2-3 bardzo powoli, a następnie schowaliśmy do lodówki.

II Próby wspólne

Do eppendorfu 200 μl dodaliśmy 22,5 μl mieszaniny reakcyjnej oraz 2,5 μl wody jałowej.

Przepipetowaliśmy bardzo powoli 2-3 razy i przenieśliśmy na schłodzonej podstawce do bloku w termocyklerze i puszczamy reakcje PCR

Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej dla jednej próby badanej

Dodaliśmy 39,5 μl Master Mix, 5 μl mieszaniny dNTPs oraz 0,5 μl polimerazy DNA + 5 μl Dna otrzymanego wg protokołu.

Rozdział elektroforetyczny uzyskanego produktu z użyciem markera wielkości.

Wykonanie elektroforegramu z wykorzystaniem systemu do obrazowania żeli.

I. Przygotowanie próbek ( 8 prób)

Próby wspólne

Do pierwszej dodaliśmy 5 µl markera Ready to use DNA M100-500

Do drugiej 2 µl barwnika i 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli negatywnej

Do trzeciej 2µl barwnika 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 220 pz

Do czwartej 2 µl barwnika 10µl mieszaniny reakcyjnej PCR kontroli pozytywnej 188 pz

Próby indywidualne

Dodaliśmy 2µl barwnika I 10 µl mieszaniny reakcyjnej PCR badanej próbki

II Przygotowanie formy na żel.

Wkładamy tackę na żel do formy do wylewania żeli (ciemny pasek musi znajdować się pomiędzy rowkami przytrzymującymi grzebień), następnie wybraliśmy grzebień o odpowiedniej grubości i liczbie zębów-13) i umieścić w formie.

III Wykonanie 2% żelu

Do kolby szklanej dodaliśmy 1,4 g agarozy i 70 ml TBE. Rozpuszczaliśmy przez ok. 2 min w mikrofalówce, ostudziliśmy do temp ok. 50-60 stopni Celsjusza. I dodaliśmy 14 µl bromku etydyny. Wymieszaliśmy i wylaliśmy do saneczek. Końcówką do pipety usunęliśmy powstałe nieliczne pęcherzyki powietrza. Żel spolimeryzował po ok. 15 minutach.

IV wykonanie elektroforezy

Z otrzymanego żelu wyjeliśmy grzebień. Umieściliśmy saneczki w aparacie do elektroforezy, a następnie wypełniliśmy zbiornik buforem do elektroforezy, aż do przykrycia żelu (ok. 2 mm nad powierzchnią żelu). Końcówką od pipety przepłukaliśmy kieszonki buforem do elektroforezy. Przygotowane wcześniej próby wspólne i indywidualne nanieśliśmy do kieszonek. Przykryliśmy zbiornik pokrywą, podłączyliśmy elektordy do zasilacza, zasilacz do prądu i włączyliśmy przycisk znajdujący się z tyłu urządzenia. Elektroforezę prowadziliśmy przy napięciu 90 V i natężeniu 26 mA. Nacisnęliśmy przycisk „start” i prowadziliśmy elektroforezę.

Po zakończeniu elektroforezy wyłączyliśmy całą aparaturę, zlaliśmy bufor z saneczek osuszyliśmy je, a następnie przenieśliśmy do komory systemu wizualizacji.

Otrzymany obraz elektroforetyczny

Wnioski: Wszyscy badani są homozygotami typu dzikiego. Nie posiadają oporności na wirusa HIV. Wszystkie prążki znajdują się na wysokości 220 pz.

Niewidoczność prążka pierwszego i słaba widoczność prążka 2 może być spowodowana błędami w pipetowaniu materiału do kieszonek. Z powodu nieszczelności niektórych ependorffów część materiału w nich zawartych uległa wyparowaniu. Co więcej próbka pierwsza (prążek pierwszy) zawierała prawie o połowę zmniejszoną ilość materiału w stosunku do pozostałych.

Koleją przyczyną nieprawidłowości może być fakt, iż początkowo elektroforeza zachodziła w odwrotnym kierunku do zamierzonego: DNA powinno migrować w kierunku anody, elektrody dodatniej czerwonej, a z nieuwagi wykonujących migrowało w kierunku katody.

---