ĆWICZENIE XII

Temat I: Udział drobnoustrojów w obiegu azotu w przyrodzie.

Bakterie symbiotyczne wiążące azot cząsteczkowy.

Bakterie odpowiedzialne za tworzenie brodawek korzeniowych u roślin motylkowych należą do rodzaju Rhizobium. Występują one w glebie jako wolno żyjące, ściśle tlenowe, gramujemne pałeczki wykorzystujące do wzrostu związki organiczne. Niektóre szczepy (Bradyrhizobium) są zdolne do wzrostu autotroficznego wykorzystując H₂. Na podstawie swoistości gospodarza oraz charakteru wzrostu można wyróżnić trzy podgrupy którym nadano nazwy rodzajowe. Do grupy Rhizobium zalicza się najszybciej rosnące bakterie brodawkowe wielu pospolitych roślin hodowlanych. Grupa Bradyrhizobium japonicum obejmuje rosnące bardzo wolno symbionty soi. Do trzeciej grupy należy Azorhizobium caudinodans, bakteria wytwarzająca brodawki łodygowe. Bakterie symbiotyczne są drobnymi i na ogół ruchliwymi pałeczkami o wymiarach 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm. Będąc organizmami zdecydowanie tlenowymi, mogą się jednak rozwijać przy znacznym nawet zmniejszeniu ciśnienia atmosferycznego tlenu. Bakterie te mogą całymi latami przebywać w glebie bez jakiegokolwiek kontaktu z rośliną. Oczywiście w tych warunkach nie potrafią wiązać azotu atmosferycznego i muszą mieć do swojej dyspozycji gotowe już związki tego pierwiastka, podobnie jak ogromna większość pozostałych drobnoustrojów. Prawie wszystkie rośliny motylkowe mogą wytwarzać brodawki przy współudziale ryzobiów, a dany gatunek Rhizobium zwykle może wchodzić w układ symbiotyczny z różnymi roślinami motylkowymi. Brodawki korzeniowe u poszczególnych roślin motylkowatych powstają w różnych miejscach, tworząc na korzeniach specyficzne ugrupowania. Jak już wspomniano, bakterie tej grupy zaliczono do rodzaju

• Rhizobium lub Bradyrhizobium, w którym występują podstawowe gatunki, a mianowicie:

• Rhizobium leguminosarum var. trifolii współżyjące z koniczynami

• Rhizobium leguminosarum var: viceae współżyjące z grochem, groszkiem, soczewicą, wyką

• Rhizobium leguminosarum var. phaseoli współżyjące z fasolami 

• Rhizobium meliloti współżyjące z lucerną, nostrzykiem

• Rhizobium loti współżyjące z komonicą

• Bradyrhizobium japonicum współżyjące z soją

• Bradyrhizobium sp. współżyjące z łubinami i niektórymi innymi roślinami motylkowatymi.

a). Rhizobium leguminosarum biovar trifolii
b). Rhizobium leguminosarum biovar viciae
c). Rhizobium meliloti

Oprócz wymienionych gatunków bakterii brodawkowych, w przyrodzie licznie występują także inne, współżyjące z różnymi roślinami motylkowatymi, nawet z dziko rosnącymi. Należy nadmienić, ze niektóre szczepy Rhizobium mogą współżyć nie tylko z jednym, ale z wieloma gatunkami roślin motylkowatych. Mają one wtedy zdolność tzw. krzyżowego zakażania roślin.

Tworzenie się brodawki korzeniowej.

Bakterie wnikają z gleby do młodych włosków korzeniowych. Rośliny motylkowe zawierają lektyny. Są to glikoproteiny, które wiążą się ze swoistymi wielocukrami. Lektyny występują powszechnie w przyrodzie i prawdopodobnie spełniają szerokie funkcje rozpoznawcze. Interakcje między lektynami na zewnętrznej powierzchni włosków korzeniowych i wielocukrami na zewnątrz ściany komórkowej ryzobiów zbadano u R. trifolii zakażającego kończynę białą. Wiązanie następuje jedynie między zgodnymi partnerami; nie każdy gatunek Rhizobium może się wiązać z jakąkolwiek rośliną motylkową i odwrotnie. Jeśli połączenie jest możliwe, czubek włoska zagina się i penetrujące bakterie wyrastają w postaci tzw. nici zakaźnej otoczonej komórkami korzenia. Wyrastając w kierunku podstawy (do góry) zakażają one kolejne komórki epidermalne korzenia. Zwykłe komórki diploidalne ulegają zniszczeniu, lecz ryzobia namnżają się w często obecnych komórkach tetraploidalnych. Po wytworzeniu hormonów wzrostowych komórki epidermalne korzenia namnażają się. W wyniku rozrostu tkanki, wywołanego przez ryzobia oraz promotory wzrostu, najprawdopodobniej cytokiny, powstaje brodawka korzeniowa.

Fot. Brodawek korzeniowych a). seradeli, b). łubinu

 wg. Kunicki-Goldfinger

Rozmieszczenie brodawek na korzeniach roślin motylkowych:

a). kończyna, b). groch, c). lucerna, d). łubin

Szybko rosnące bakterie przekształcają się w zdeformowane komórki; zwane bakteroidami. 

Fot. Bakteroidy z komórek brodawki korzeniowej wyki

Wg Nowaka

Bakteroidy to formy zmienione - inwolucyjne - nie rozmnażające się, ale wciąż aktywne. Zazwyczaj bakteroidy są nie tylko znacznie większe od komórek macierzystych (10-12-krotnie), ale mają zdeformowane kształty, niekiedy bardzo charakterystyczne dla poszczególnych gatunków. 

a). bakteroidy kończyny 
b). bakteroidy grochu 
c). bakteroidy lucerny

Bakteroidy np. występujące w koniczynie tworzą często formy gruszkowate - rozdęte, a bakteroidy grochu przyjmują zazwyczaj postać rozwidloną w kształcie litery y. Nie wszystkie jednak bakteroidy odbiegają swoimi kształtami i wymiarami od komórek, z których powstały. Bakteroidy Rhizobium japonicum (nowa nazwa: Bradyrhizobium japonicum) prawie nie różnią się wyglądem zewnętrznym od form wegetatywnych. Bakteroidy, żyjąc w cytoplazmie komórek roślinnych pojedynczo lub w grupach, otaczają się błoną perybakteroidalną. Tkanka zawierająca bakteroidy jest czerwona, ponieważ zawiera barwnik leghemobinę. W miarę starzenia się brodawki następuje degradacja leghemoglobiny do zielonych barwników żółciowych (biliwerdyn) i brodawka również przyjmuje zieloną barwę. Samo wiązanie azotu atmosferycznego zachodzi najsilniej tuż przed kwitnieniem i podczas kwitnienia zakażonych bakteriami roślin motylkowatych. Po okwitnięciu, wobec zmniejszającej się asymilacji dwutlenku węgla przez rośliny i zwolnieniu tempa wzrostu, brodawki korzeniowe ulegają rozpadowi. Formy bakteroidalne zamierają i są trawione przez enzymy roślinne lub, jak twierdzą niektórzy uczeni, pewna ich część może rozpadać się na drobne ziarenkowate twory, z których wykiełkowują nowe formy wegetatywne. Natomiast bakterie, które nie uległy w brodawkach przekształceniu w bakteroidy przenikają do gleby, skąd mogą ponownie zakażać inne rośliny motylkowate, skoro tylko znajdą się w zasięgu ich korzeni.

Współżycie bakterii brodawkowych z rośliną polega na obustronnym świadczeniu usług. Tak, więc zarówno proces wiązania azotu atmosferycznego, jak i normalny rozwój bakterii symbiotycznych wymagają dopływu węglowodanów będących dla nich źródłem energii oraz materiałem budulcowym. Tych właśnie związków, soli mineralnych oraz prawdopodobnie niektórych ciał wzrostowych dostarcza bakteriom roślina. W zamianę za to bakterie zaopatrują rośliny w wytworzoną przez siebie witaminę B₁₂ i przede wszystkim związany azot.

Jak się okazuje, nie zawsze dochodzi do współżycia roślin motylkowatych z bakteriami. A. Hiltner rozróżnia ze względu na różną odporność roślin na zakażenie bakteriami oraz różne zdolności samych bakterii do zakażania roślin sześć możliwych stosunków pomiędzy rośliną motylkowatą a bakteriami:

1. Roślina jest bardzo odporna i bakterie w ogóle nie potrafią wniknąć do jej systemu korzeniowego.

2. Roślina nie jest tak odporna, aby uniemożliwić wniknięcie bakterii, lecz jest na tyle silna, że niszczy wnikające komórki bakterii. W tej sytuacji nie dochodzi do tworzenia się brodawek korzeniowych.

3. Roślina tworzy brodawki po wniknięciu bakterii, które jednak słabo asymilują azot atmosferyczny i ich komórki są stopniowo niszczone przez roślinę.

4. Właściwa symbioza polega na rozwoju bakterii w brodawkach i wiązaniu wolnego azotu z powietrza.

5. Nadmierna wirulencja (zjadliwości bakterii powoduje niszczenie tkanki roślinnej. Jest to już przejaw pasożytnictwa bakterii w stosunku do roślinnego gospodarza.

6. Całkowite pasożytnictwo bakterii w roślinie powoduje jej stopniowe zamieranie. 

Rozróżnia się ponadto trzy stadia współżycia bakterii z roślinami motylkowatymi. 

Stadium pierwsze to atakowanie rośliny przez wnikające do jej systemu korzeniowego bakterie, podczas którego roślina broni się. Okres ten trwa aż do momentu wytworzenia naczyń przewodzących asymilaty z systemu naczyniowego rośliny do utworzonej brodawki. 

Następnie zaczyna się okres drugi - stadium właściwego współżycia. Okres trzeci pojawia się z początkiem starzenia się rośliny. Zmniejszony dopływ asymilatów do brodawek stopniowo zamienia symbiozę w pasożytnictwo. 

Ten trzeci okres - stadium pasożytnictwa - można wywołać sztucznie, np. przez zaciemnienie roślin lub prowadzenie ich hodowli w środowisku bez takich mikroelementów jak bor. Jak wiadomo zaciemnienie rośliny uniemożliwia proces asymilacji CO₂ przez roślinę, a brak boru powoduje zahamowanie tworzenia się wiązek naczyniowych prowadzących asymilaty do brodawki.

Część praktyczna

a). Obserwacja korzeni roślin motylkowych (opis i rysunek dwóch typów brodawkowania).

b). Obserwacja mikroskopowa bakterii z rodzaju Rhizobium z hodowli laboratoryjnej w preparatach barwionych metodą Grama (pow. 1250x). Wykonanie rysunków bakterii z rodzaju Rhizobium.

c). Obserwacja mikroskopowa bakteroidów kończyny i peluszki w preparatach barwionych metodą negatywną (pow 1250x). Wykonanie rysunków bakteroidów.

Wykorzystania bakterii z rodz. Rhizobium w praktyce rolniczej.

Najczęściej stosowaną w praktyce rolniczej szczepionką bakteryjną jest Nitragina, przeznaczona dla roślin motylkowych. Zawiera ona efektywny, tj. wirulentny (łatwo zakażający rośliny) i aktywny (wiążący duże ilości N₂) szczep Rhizobium. Nitraginę sporządza się z najaktywniejszych szczepów przystosowanych do odpowiednich roślin, namnażając bakterie na specjalnych pożywkach. Następnie przenosi się je na sterylne podłoże, np. na glebę, lub też namnaża się bezpośrednio na odpowiednio wyjałowionym podłożu wzbogaconym w źródła energii i pokarm dla tych bakterii. Gotowe szczepionki przechowuje się w plastykowych torebkach lub w szklanych słoikach zaopatrzonych w odpowiednią instrukcję użycia. Umiejętnie i racjonalnie użyta szczepionka może przynieść duże korzyści gospodarcze, nie tylko na skutek znacznego zwiększenia plonów zielonej masy, ale i wydatnego zwiększenia zawartości w niej azotu. Należy pamiętać, że stosowanie nitraginy jako szczepionki nie zawsze jest uzasadnione, gdyż w glebie, którą zamierzamy wzbogacić aktywnymi szczepami mogą znajdować się już nie mniej aktywne szczepy rodzime Rhizobium lub Bradyrhizobium). Należy więc stosować szczepionkę tylko wtedy, gdy na określonym polu nie była uprawiana co najmniej przez kilka lat roślina motylkowata lub nastąpił wyraźny spadek jej plonów. Jak wiadomo katastrofalne zmniejszenie się plonowania tych roślin, czyli tzw. wykoniczynienie lub wylucernienie, może być spowodowane m. in. przez bakteriofagi, które wyniszczyły współżyjące z roślinami motylkowatymi bakterie. W tych warunkach użycie nitraginy jest jak najbardziej celowe. Polska Nitragina jest wytwarzana przez Wytwórnię Szczepionek Rolniczych w Wałczu. Zawiera ona jako nośnik bakterii jałową glebę z dodatkiem pożywki.

Temat II. Mikrobiologiczne przemiany siarki.

Obieg siarki - niektóre przemiany prowadzone przez bakterie

Wg Singeltona

Przemiany siarki. Siarka przyswajana jest przez rośliny w postaci rozpuszczalnych w wodzie siarczanów. W glebie natomiast siarka występuje głównie w związkach organicznych, zwłaszcza w białkach. Ponadto występuje też w glebie siarka elementarna i nie dotlenione związki siarki, jak siarczki, tioniany, a także nierozpuszczalne w wodzie siarczany, np. CaSO₄. 

Drobnoustroje biorą udział w udostępnianiu siarki roślinom przez mineralizację związków organicznych oraz przez utlenianie siarki wolnej i jej związków mineralnych.

W prosie mineralizacji drobnoustroje uwalniają siarkowodór, który wydziela się głównie przy rozkładzie aminokwasów siarkowych, takich jak metionina, cystyna, cysteina. Proces ten przebiega równolegle z procesem ich amonifkacji. Część siarkowodoru ulatnia się, a część ulega utlenieniu poprzez wolną siarkę do kwasu siarkowego, z którego powstają siarczany. Siarkę i siarkowodór utleniają bakterie zwane siarkowymi. Są to organizmy fototroficzne, reprezentowane przez bakterie purpurowe siarkowe i bakterie zielone, oraz organizmy chemolitotrofczne, reprezentowane przez bakterie z rodzaju Thiobacillus. Dla bakterii fototroficznych charakterystyczne jest środowisko wodne, gdyż wymagają zarówno dopływu światła, jak i warunków beztlenowych. W wodach występują na takich głębokościach, na jakich oba te warunki są spełnione. Glebowymi bakteriami siarkowymi są chemolitotrofczne bakterie siarkowe. 

Siarka elementarna może być zużywana np. przez archeona Sulfolobus oraz Thiobacillus Thiooxidans i Thiobacillus Ferroxidans

W naturalnych środowiskach, w wyniku działalności drobnoustrojów, siarczany nie tylko są wytwarzane, lecz także redukowane. Proces redukcji przeprowadzają niektóre drobnoustroje, które nazywa się desulfurikacyjnymi. Należy do nich rodzaj Desulfovibrio. Końcowym produktem redukcji siarczanów jest siarkowodór, który w glebie w reakcji z kationami tworzy siarczki, a jego nadmiar ulatnia się. Proces redukcji przebiega przede wszystkim w warunkach beztlenowych.

Dla bakterii siarkowych pożywką wybiórczą jest pożywka mineralna ze zredukowanymi związkami siarki lub z siarką elementarną. Siarka i jej związki mogą być też utleniane do siarczanów przez liczne bakterie chemoorganotroficzne, które jednak przeprowadzają procesy utleniania z małą aktywnością. Bakterii tych nie nazywa się bakteriami siarkowymi.

Część praktyczna

Demonstracja hodowli bakterii redukujących siarczany. Do probówki z płynną pożywką siarczanowo - żelazowo - glukozową wg Wilsona Blaira wsiano małą grudkę gleby (po dokładnym wymieszaniu pożywkę zaszczepioną glebą zalano delikatnie 2 cm warstwą agaru wodnego w celu wywożenia warunków beztlenowych. Czarne zabarwienie hodowli (FeS) wskazuje na rozwój w hodowli bakterii redukujących siarczany (Desulfovibrio desulfuricans).

Literatura wykorzystana przy opracowaniu ćwiczenia XI-XIII

• Chruściak E., Kulińska D., Romanowa I., Russel S. - Ćwiczenia z mikrobiologii. SGGW

• Duszkiewicz - Reinhard W. i inni - Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej. Wydawnictwo SGGW.

• Gołębiowska J. - Mikrobiologia rolnicza - Państwowe wydawnictwo Rolnicze i Leśne. Warszawa.

• Gostkowska K. i inni - Przewodnik do ćwiczeń z mikrobiologii dla studentów Wydziału Rolniczego. - Wydawnictwo AR w Lublinie

• Jabłoński L. - Podstawy mikrobiologii lekarskiej. - Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich.

• Kunicki - Goldfinger W. - Życie bakterii.

• Nowak A. i inni - Przewodnik do ćwiczeń z mikrobiologii. - Wydawnictwo AR w Szczecinie.

• Różalski A. - Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Wydawnictwo Uniw. Łódzkiego

• Schlegel H. G. - Mikrobiologia ogólna. Wydawnictwo Naukowe PWN.

• Singleton P. Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie. Wydawnictwo Naukowe PWN.

• Zmysłowska I. - Mikrobiologia ogólna i środowiskowa. Teoria i ćwiczenia. - Wydawnictwo UWM Olsztyn

---