Wyznaczanie stałej Michaelisa-Menten (Km), V_max oraz określanie typu inhibicji aktywności fosfatazy kwaśnej.

Wykonanie:

Celem ćwiczenia jest poznanie kinetyki enzymów (V₀, stałej Km i V_max), a także określenie wpływu inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznej.

Różne typy inhibicji można określić przeprowadzając reakcje enzymatyczne przy różnych stężeniach substratu i inhibitora, a następnie przedstawiając graficznie wyniki analiz.

Część I:

Reakcja bez inhibitora

Do 6 ponumerowanych probówek odmierzamy kolejno 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu, dodajemy po 0,75 ml buforu octanowego i uzupełniamy wodą do objętości 2,0 ml, a do siódmej probówki będącej próbą kontrolną odmierzamy 0,75 ml buforu octanowego i 1,25 ml wody destylowanej. Wszystkie probówki wstawiamy do łaźni wodnej o temp. 30°C i po ok. 5 min nie wyjmując prób z łaźni, dodajemy kolejno do każdej probówki po 0,5 ml wyciągu enzymu, mieszamy i prowadzimy reakcję jeszcze przez 15 min.

Po 15 minutach przerywamy działanie enzymu, dodając kolejno do probówek po 2,5 ml węglanu sodowego, mieszamy i oznaczamy absorbancję w fotometrze dla 420 nm.

Część II:

Reakcja z inhibitorem

Do 6 ponumerowanych probówek odmierzamy kolejno 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu, dodajemy po 0,75 ml buforu octanowego, po 0,05 ml 1mM molibdenianu amonu i uzupełniamy wodą do objętości 2,0 ml, a do siódmej probówki będącej próbą kontrolną odmierzamy 0,75 ml buforu octanowego o pH 5,3 i 1,25 ml wody destylowanej. Wszystkie probówki wstawiamy do łaźni wodnej o temp. 30°C i po 5 minutach nie wyjmując prób z łaźni, dodajemy kolejno do każdej probówki po 0,5 ml wyciągu enzymu, mieszamy i prowadzimy reakcję przez 15 minut. Po tym czasie przerywamy działanie enzymu, dodając kolejno do probówek po 2,5 ml węglanu sodowego, mieszamy i oznaczamy absorbancję w spektrofotometrze przy 420 nm.

Wyniki i obliczenia:

Wyniki dla reakcji bez inhibitora:

			Szybkość reakcji = ilość produktu
L.p.	Substrat [ml]	1/[S]	A420	V0= A420/0,002*139	1/V0
1.	0,05	6666	0,112	0,403	2,482
2.	0,1	3333	0,150	0,539	1,855
3.	0,2	1666	0,224	0,806	1,241
4.	0,3	1111	0,270	0,971	1,030
5.	0,4	833	0,312	1,122	0,891
6.	0,5	666	0,324	1,165	0,858

Wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu (wartości bez inhibitora):

Z wykresu i linii regresji wynika, że:

-1/Km = - 2456 Km = 0,0004

1/Vmax = 0,7368 Vmax = 1,357

Obliczanie wartości Vmax ze wzoru:

Vmax= Vo*(1+Km/[S])

Vmax= 1,165 *(1+0,0004/0,0015)

Vmax= 1,475

Wyniki dla reakcji z inhibitorem:

			Szybkość reakcji = ilość produktu
L.p.	Substrat [ml]	1/[S]	A420	Vi= A420/0,002*139	1/Vi
1.	0,05	6666	0,028	0,101	9,901
2.	0,1	3333	0,044	0,158	6,329
3.	0,2	1666	0,090	0,324	3,086
4.	0,3	1111	0,100	0,360	2,778
5.	0,4	833	0,144	0,518	1,930
6.	0,5	666	0,168	0,604	1,656

Wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu (wartości z inhibitorem):

Z wykresu i linii regresji wynika, że:

-1/Km = - 720,215 Km = 0,0014

1/Vmax = 1,0083 Vmax = 0,992

Obliczanie wartości Vmax ze wzoru:

Vmax= Vo*(1+Km/[S])

Vmax= 0,604*(1+0,0014/0,0015)

Vmax= 1,167

Porównanie obu wykresów:

Aktywność fosfatazy kwaśnej [μmol p-nitrofenolu/1g liści pszenżyta*1min]:

Do obliczeń biorę wynik 6., gdzie A= 0,324, a V₀= 1,165

0,5 ml 1,165 μmola

10 ml x

x = 23,3 μmola

10 ml 23,3 μmola

2,5 ml y

y = 5,825 μmola

2,5 ml 5,825 μmola

500 ml z

z = 1165 μmola

z / 10 g * 15 min = 7,767 [μmol/g*min]

Wnioski :

Aktywność fosfatazy kwaśnej wyniosła w tym doświadczeniu 7,767 μmola/g*min.

W części bez inhibitora uzyskaliśmy wartości Km = 0,0004, Vmax = 1,357 , a w części z inhibitorem wartości Km = 0,0014, V max= 0,992. Z obliczeń w pierwszym przypadku otrzymaliśmy Vmax= 1,475, a w drugim Vmax= 1,167, wartości te cechuje więc niewielki błąd pomiarowy. Z otrzymanych wartości wynika, że inhibitor wpłynął i na Km podwyższając ją i na Vmax obniżając ją - była to więc inhibicja mieszana, cechująca się działaniem częściowo jak inhibicja kompetycyjna, a częściowo jak niekompetycyjna.

4

---