2.Denaturacja i degradacja DNA

Denaturacja DNA jest procesem polegającym na rozrywaniu wiązań wodorowych pomiędzy zasadami przeciwległych nici DNA. Denaturacja DNA zachodzi w komórkach podczas replikacji oraz transkrypcji i jest katalizowana przez kompleksy enzymatyczne. Jest naturalnym procesem nie mającym negatywnych konsekwencji dla żywotności komórki (rozdzielone nici ulegają potem renaturacji)

Natomiast degradacja DNA polega na rozrywaniu kowalencyjnych wiązań fosfodiestrowych występujących w każdej z nici DNA. Reakcja ta katalizowana jest przez nukleazy.

W komórce żywej działanie nukleaz prowadzi do śmierci komórki. (przykład system obronny restryktaz)

3.Wektory

Po co konstruujemy wektory?

Gdyby niechroniony w żaden sposób fragment DNA został wprowadzony do komórki, uległby natychmiastowej degradacji przez występujące w niej nukleazy. Dlatego też interesujący nas fragment, który chcemy umieścić w danym organizmie, musimy sprzęgnąć z natywnie występującą w nim cząsteczką DNA i umożliwić jego replikację .Tak zmodyfikowane cząsteczki DNA nazywane są wektorami do klonowania

Wektor klonujący zawiera zazwyczaj:

-polilinker- sekwencja rozpoznawana i cięta przez enzymy restrykcyjne

-marker- umożliwia selekcję i ułatwia wyszukanie komórek które uległy transformacji ( najczęściej jest to gen kodujący opornośc na antybiotyki)

-gen reporterowy-pozwalający na wizualizację komórek które uległy transformacji- np. święcace na zielono białko GFP

4. Jakie geny znajdują się w bibliotece cDNA?

Geny aktywne transkrypcyjnie w danej komórce (?)

5.Charakterystyczne cechy dwóch termostabilnych polimeraz w PCR

Polmeraza Taq: szybkość 1kb/min, brak właściwości naprawczych, błędy 2,2*10^-5, optymalna temperatura polimeryzacji 72 stopnie, izolowana z Thermus aquaticus, optymalne ph 9, T(1/2) 94st= 40 minut.

Polmeraza Pfu: szybkość 0,5kb/min, właściwości naprawcze, błędy 2,6*10^-6, optymalne pH-6,5, izolowana z Pyrococcus furiosus.

6. Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne występują w komórkach bakteryjnych jako naturalny system obrony przed heterogennym DNA- tną obce, niezmetylowane specyficznie cząsteczki DNA zabezpieczając komórkę przed np. fagami. Jedną z najważniejszych cech restryktaz znajdujących zastosowanie w biologii molekularnej jest powtarzalność fragmentacji cząsteczek DNA. Enzymy restrykcyjne znalazły ogromne zastosowanie w biologii molekularnej- w manipulacji fragmentów DNA- amplifikacji genów, ekspresji heterogennego genu w komórce gospodarza, analizie genomu i genów itd.

7. Szczepionki DNA

W przeciwieństwie do tradycyjnych szczepionek, zawierająych drobnoustroje lub antygeny tych drobnoustrojów, do komórek wprowadzane jest samo DNA. Technika ta jest efektywna i mało skomplikowana. Obejmuje wprowadzenie genu kodującego dany antygen będący komponentem szczepionki do wektora ekspresyjnego, najczęściej plazmidu bakteryjnego i jego namnożenie. Następnie DNA izoluje się z komórek bakterii i wstrzykuje pacjentowi, np. śródskórnie lub domięśniowo . DNA integruje z gnomem pacjenta i następuje ekspresja genu.

8. Cykl ubikwitynowy

9. Splicing alternatywny i redagowanie DNA

Regulacja ekspresji genów u eukariontów, choc w głównej mierze przebiega na poziomie inicjacji transkrypcji, zachodzi również po transkrypcji. Przykładem mechanizmu potranskrypcyjnego jest redagowanie DNA, alternatywny splicing i wybór jednego z kilku miejsc terminacji transkrypcji, regulacja transportu mRNA z jądra oraz stabilności białek.

Konsekwencją redagowania DNA jest niekolinearność transkryptu z genem- po transkrypcji zachodzą punktowe zmiany mRNA, np. deaminacja puryny i wytworzenie pirymidyny.

Nie są to jednak mutacje, lecz zmiany niejako „zaplanowane” przez komórkę.

Przykłady redagowania genów jądrowych: kodujący apoliproteinę B u ssaków- gen ten koduje 2 polipeptydy- dłuższy występujący w wątrobie i krótszy w jelicie. Sekwencja jelitowego mRNA zawiera w pewnym miejscu nonsensowny kodon UAA, w mRNA wątrobowym jest kodon CAA (glutamina). W wyniku redagowania CAA ulega deaminacji dając UAA.

Redagowanie jest bardziej powszechne w genomach mitochondrialnych- odkrycie tego zjawiska przyczyniło się do obalenia niektórych przypadków rzekomych odstępstw od uniwersalnego kodu genetycznego. Podczas redagowania może tez zachodzic np. dodawanie nukleotydów lub ich delecja. Mechanizm nie jest do końca poznany.

Alternatywny splicing

Dla niektórych genów istnieje kilka możliwości składania transkryptu- w jednym przypadku dany fragment DNA jest traktowany jak intron, w innym jak ekson. Dlatego też istnieje wiecej niż 1 rodzaj mRNA- w wyniku łączenia różnych eksonów. (genetyka molekularna- rys. s 245)

10. Specyficzne cechy sekwencji DNA eukariotów (chodzi o kodujące i niekodujące fragmenty) (?)

Lokalna sekwencja zasad w DNA wywiera duży wpływ na właściwości heliksu. Przykładowo kasety TATA w promotorach są najbardziej podatne na rozkręcanie i denaturację. Z kolei ciągi oligoA-oligoT są bardzo sztywne ze względu na występujące w nich silne skręcenie śmigłowe oraz dodatkowe wiązanie wodorowe. Takie homopolimery nie mogą tworzyc nukleosomu. W nukeosomach często powtarza się motyw AA-TT umożliwiający zaginanie.

Centromer-sekwencje satelitarne, telomery-powórzenia, i mysle ze te wszystkie powtórzenia (SINE, LINE,satelitarne DNA)

1.Budowa i funkcje spliceosomu

Spliceosom jest kompleksem pre-mRNA i snRNP (snRNP to kompleks sarna i białek). Jest odpowiedzialny za sfałdowanie i przycięcie przez pre-mRNA stosownej konformacji umożliwiającej zajście splicingu. Katalizuje też reakcje rozcięcia i ligacj, prowadzące do wycięcia intronu i połączenia eksonów.

2.Rola polimerazy RNA u prokariotów.

Rolą polimerazy RNA u prokariotów jest oczywiście przeprowadzenie transkrypcji. Polimeraza RNA składa się z części rdzeniowej kontrolującej tworzenie się właściwych par wiązań wodorowych i wytwarzającej wiązania fosfodiestrowe. Rdzeń wystarcza do elongacji, do inicjacji i terminacji potrzebne są białka pomocnicze. Polimeraza RNA (bez podjednostki sigma) może wytwarzac słabe wiązania z dowolnymi sekwencjami DNA i przemieszczać się wzdłuż nici dzięki zdolności DNA do tworzenia pętli. Po związaniu podjednostki sigma w okolicy promotora polimeraza traci zdolność tworzenia słabych wiązań z dowolną sekwencją i wytwarza trwały kompleks z promotorem. Zatem podjednostka sigma odpowiedzialna jest za rozpoznawanie promotora.

Podjednostka beta jest zaangażowana w wiązanie substratów reakcji. Podjednostka beta prim jest odpowiedzialna za wiązanie się enzymu z DNA. Podjednostka alfa-montaż rdzenia enzymu, oddziaływania polimerazy z białkami aktywującymi transkrypcję , wiązanie z sekwencją TATA w rejonie od -40 do -60 niektórych promotorów.

Taka struktura polimerazy RNA umożliwia jej współdziałanie z różnymi efektorami i białkami w różnych warunkach fizjologicznych. W miarę postępuj inicjacji transkrypcji miejsce zajmowane przez polimerze ulega znacznemu zmniejszeniu- od -55 +20 do -35 -55 (rys. str 195)

3.Co to są organizmy transgeniczne? Podaj przykłady.

Organizmy transgeniczne to organizmy posiadajże geny pochodzące z innego organizmu.

Przykłady: komórka drożdżowa posiadająca wbudowany do genomu gen pochodzący z komórki E.coli kodujący beta galaktozydazę. Rośliny oporne na herbicydy, szkodniki, niekorzystne czynniki środowiskowe, choroby.itd.

4.Translacja mitochondrialna (?)

Mechanizm translacji w mitochondraich jest zbliżony do bakteryjnego. Genom mitochondrialny koduje mt rRNA i tRNA niezbędne do translacji. Genom nie zawiera więkoszosci genów kodujących enzymy- są one transportowane z cytoplazmy- nie powstają w mitochondriach.

5. Budowa i funkcje SRP

SRP- rybonukleoproteina rozpoznająca i transportująca białka powstaje na drodze translacji do retikulum endoplazmatycznego u eukariota i błon u prokariota. SRP zbudowany jest z 6 polipeptydów przyłączonych do RNA. SRP łączy się z powstałym podczas translacji białkiem, większą podjednostką rybosomalną i wreszcie receptorem SRP w błonie retikulum (u eukariotów). Łączenie z podjednostką rybosomalną zatrzymuje translację, która jest kontynuowana w retikulum.

6.Co umożliwiają biblioteki genomowe?

Biblioteka genowa to zbiór różnych sekwencji DNA danego organizmu, które zostały sklonowane w wektorze w celu ich łatwiejszego oczyszczania, przechowywania i analizy. Biblioteki DNA to zestawy klonów DNA (genetycznie odrębny osobnik lub grupa organizmów identycznych genetycznie). Każdy z klonów powstał poprzez włączenie do wektora innego fragmentu DNA, który następnie został namnożony w komórkach gospodarza. Do skonstruowania biblioteki genowej wykorzystuje się komórki bakteryjne.

Biblioteki cDNA jest wtedy gdy DNA jest populacją kopii mRNA.

Główną funkcją biblioteki cDNA jest znacznie łatwiejsza analiza sekwencji i funkcji mRNA ponieważ robimy to na DNA a nie na uciążliwym RNA. Ponadto biblioteki cDNA umożliwiają przechowywanie fragmentów DNA ulegających ekspresji. Poddając analizie zgromadzone w takiej bibliotece cząsteczki DNA można stwierdzić, które geny są aktywne w danym typie komórek lub tkanek.

7.Modyfikacje PCR zwiększające swoistość produktu

●Nested PCR- stosowane są 2 pary starterów. Produkt powstały po amplifikacji z jedną parą starterów poddaje się kolejnej rundzie z drugą parą.;

●Booster PCR (regulowany PCR)- w początkowych cyklach używa się niskiej koncentracji starterów starterów dopiero potem normalnej. Zapobiega to dołączaniu starterów do sekwencji niecałkowicie komplementarnych;

●Hamowany PCR (toch-down PCR)-początkowo stosuje się warunki zapewniające dużą dokłądosc, potem warunki standardowe;

●hot start PCR

8. Metody badawcze w weterynarii.

???

9.Wektory w terapii genowej

●wirusowe- potrafią wprowadzać DNA lub RNA do komórki

●DNA plazmidowe bez żadnego nośnika jest w stanie wnikac tylko do mięsni szkieletowych

10.DNA satelitarny w genomie człowieka

Są to rozległe rejony złożone z tandemowo powtarzających się sekwencji (ułoozne w jednym ciągu, w przeciwieństwie do SINE i LINE). Wyróznia się 3 typy powtarzającego się DNA- satelitarny DNA-powtarzające się sekwencje tworzą zbiory długości 100-5000 kpz;, jednostką powtarzalną jest sekwencja długości do 200 pz; minisatelitarny DNA-zbiory długości 20-100 kpz jednostka powtarzalna:10-100pz; mikrosatelitarny DNA- zbiory tej samej długości co minisatelitarny DNA, lecz sekwencja powtarzająca się jest rzadko większa niż 4pz.

Takie powtórzenia zespolone zajmują ok 10% genomu człowieka.

1. Czym znakowane są sondy?

Izotopy promieniotwórcze- fosforu, siarki

Znakowanie nieradioaktywne: digoksygenina, biotyna, związki fluorescencyjne (rodamina, kumaryna, fluoresceina)

2. Metody przeszukiwania bibliotek genów

--metoda „odcisku”-jeśli znamy sekwencję poszukiwanego genu- łysinki lub kolonie bakteryjne które poddano transformacji przenosimy na filtr nylonowy, zanurzamy w roztworze do lizy, denaturujemy za pomocą NaOH i poddajemy hybrydyzacji ze znakowaną sondą

--jeśli znamy białko będące produktem genu- metoda immunoenzymatyczna;

kolonie (łysinki) przenosimy na membranę, prowadzimy lizę komórek bakteryjnych.

Doprowadzamy do związania do matrycy nie DNA, lecz uwolnionych białek. Dodajemy pierwszorzędowych przeciwciał, które specyficznie wiążą się do poszukiwanego białka. Odmywamy niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe i dodajemy przeciwciał drugorzędowych (zwykle zawierających enzym, np.fosfatazę alkaliczną) swoistych w stosunku do przeciwciał pierwszorzędowych Po usunięciu niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych nadchodzi kolej na dodanie bezbarwnego substratu. Teraz enzym obecny na cząsteczce przeciwciała drugorzędowego rozszczepia (hydrolizuje) substrat, który w wyniku tej reakcji uzyskuje charakterystyczny kolor. Zatem tam gdzie występowało dane białko, a jednocześnie szukana sekwencja odpowiedzialna za jego powstanie, pojawia się zabarwienie.

--jeśli szukana sekwencja koduje enzym; Dodatkowy warunek, który musi być spełniony jest taki, by dany enzym nie występował naturalnie w komórce gospodarza. W zależności od sposobu działania enzymu metoda analizy aktywności ma różną postać. Bibliotekę wysiewa się na medium wzbogacone o specyficzny substrat albo też pozbawione pewnego związku.

β-galaktozydaza

Załóżmy dla przykładu, ze w bibliotece DNA szukamy genu kodującego β-galaktozydazę: Po transformacji komórek E.coli wektorami, wysiewamy je na podłoże z X-gal i IPTG. β-galaktozydaza - enzym rozkładający syntetyczny substrat (X-gal) odpowiada za pojawienie się niebieskiego zabarwienia kolonii wytwarzających ten enzym.

α-amylaza

Innym przykładem enzymu, którego obecność wykrywa się metodą analizy aktywności białek jest α- amylaza. Jest to enzym zewnątrzkomórkowy, który umożliwia bakteriom E.coli wykorzystanie skrobii jako substratu pokarmowego. Skrobia normalnie nie przechodzi, bowiem przez błonę komórkową, natomiast produkty rozkładu- tak. Procedura detekcji enzymu polega na wysianiu badanych bakterii na agar ze skrobią. Następnie po kilkudniowej inkubacji agar ze skrobią barwi się jodyną i powstaje ciemnoniebieski kompleks odpowiedzialny za kolor pożywki. Rozjaśnienia wokół kolonii wskazują na rozkład skrobi spowodowany produkcją zewnątrzkomórkowego enzymu α- amylazy przez bakterie

3. Czy wielkość genomu zależy od wielkości genów? (?)

Myślę, ze wielkość genomu organizmów eukariotycznych nie zależy od wielkości genów ponieważ stanowią one bardzo niewielki procent genomu (u człowieka 2-3%). Na wielkość genomu wpływają głownie sekwencje powtórzone oraz unikatowe niekodujace.

Inaczej przedstawia się sytuacja u prokariotów- geny stanowią ok.75% wielkoscii chromosomu bakteryjnego a więc w tym przypadku wielkość gemonu alezy w duzum stopniu od wielkości genów.

4.Na czym polega PCR

5. Jakie obecnie choroby możemy rozpoznawać za pomocą reakcji PCR?

Choroby zakaźne wywoływane przez wirusy i bakterie, choroby genetyczne (np. dystrofia mięsniowa Duchenne'a, mukowiscydoza. Badania preimplantacyjne zarodków), wykrywanie predyspozycji do rozwoju nowotworów, wykrywanie nowotworów

6. Metoda Maxama Gilberta

Jest to metoda praktycznie już nie stosowana.

Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cząsteczek DNA związkami chemicznymi przecinającymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór fragmentów DNA o różnej długości co spowodowane jest takim doborem warunków , że w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Prążki na autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3` określoną zasadę.

7. Funkcja ogonka poliA i czapeczki guanylowej

Fukcja ogonka poliA nie jest do końca poznana. Przyjmuje się że zabezpiecza on przed degradacja końca 3'.

Czapeczka gyanylowa zabezpiecza przed degradacją przez endonukleazy w cytoplazmie oraz stanowi sygnał umożliwiający rozpoznanie przez rybosom początku cząsteczki mRNA

8.Co to znaczy że geny prokariota są niepodzielne?

Nie zawierają intronów, z jednego genu na drodze transkrypcji może powstac tylko jeden produkt mRNA.

9. Wymień substraty potrzebne do PCR- MgCl2, bufor Tris, startery lewy i prawy, woda, matrycowe DNA, termostabilna polimeraza DNA

10. Wady bibliotek genomowych DNA

Przygotowując bibliotekę wyizolowany DNA trawi się enzymem restrykcyjny w wyniku czego otrzymujemy tylko pewną liczbę sekwencji DNA reprezentujących kompletne geny, większość z nich zawiera tylko fragmenty genów oraz odcinki niekodujące.

11.Regulacja ekspresji genu na poziomie transkrypcji

-u prokariontów:

inicjacja transkrypcji: operony indukowane (np. laktozowy)- transkrypcja indukowana przez substrat, np. laktoza uruchamia transkrypcję operonu laktozowego; operony hamowane- substrat hamuje transkrypcję operonu, np. operon tryptofanowy hamowany przez tryptofan.

Represja kataboliczna- mechanizm umożliwiający wykorzystanie glukozy w obecności innych cukrów- np. w obecności laktozy. Operon laktozowy zostaje wyłączony,

Polega to na tym, ze białko CAP niezbędne do transkrypcji operonu laktozowego działa poprawnie tylko w obecności cAMP. Gdy glukoza jest obecna, hamuje działanie enzymu cyklazy adenylowej wytwarzającej cAMP i uniemożliwa transkrypcję peronu laktozowego.

13. Metody sekwencjonowania enzymatycznego DNA,

14. Skład kompleksu inicjującego translację

-mRNA

-mała podjednostka rybosomowa związana z mRNA w ściśle określonym miejscu „powyżej” kodonu inicjującego (zazwyczaj AUG)- u prokariota jest to tzw sekwencja Shine-Dalgarno (5'AGGAGGGU3') i znajduje się w odległości ok.10 nukleotydów od AUG

U eukariota mała podjednostka rozpoznaje czapeczkę i przesuwa się wzdłuż końca 3' aż napotka kodon start

-tRNA zaminoacylowany metioniną (u bakterii ze zmetylowaną metioniną)

W inicjacji bierze udział okreśłona liczba dodatkowych czynników białkowych - u bakterii IFI1, IFI2 i IFI3. IFI1 i IFI3 uniemożliwiają przyłączanie się dużej podjednostki, IFI2 przyłącza tRNA z metioniną do kompleksu inicjującego. U eukariota też są podobne czynniki białkowe.

15. Znaczenie białek genomowych (histony)

Histony są zasadowymi białkami których funkcja polega głównie na odpowiednim upakowaniu DNA w jednostki zwane nukleosomami stanowiące pierwszy poziom koncentracji DNA w jądrze komórkowym. Pełnią zatem przede wszystkim funkcje strukturalne. Ponadto zahamowanie syntezy histonów prowadzi do zahamowania replikacji, ponieważ nowo syntetyzowana nic musi być nawijana na histony. Poza tym, odstępy między nukleosomami w nowo zsyntetyzowanej nici są większe niż w starej co może stanowic jeden z sygnałów zabezpieczających dane fragmenty DNA przed przedwczesną powtórną replikacją. Histon H1 bierze udział w regulacji ekspresji genów, jest zazwyczaj jej represorem. Różnicowanie niektórych tkanek jest skorelowane w czasie z wymianą wariantów histonu H1.

W genomie bakteryjnym występują białka histonopodobne mające, podobnie jak histony, zdolność organizowania DNA w struktury wyższego rzędu. Są one jednak kwaśne (podobnie jak czynniki transkrypcyjne) i pełnią również podobne do nich funkcje-np. są represorami transkrypcji dla wielu genów

17.Najważniejsze cechy genów kodujących białka histonowe

Najważniejszą cechą sekwencji kodujących histony jest moim zdaniem ich wysoki stopień konserwatywności. Jako białka o fundamentalnej funkcji dla komórki histony zachowują wysoki stopień homologii u różnych gatunków eukariotów, bowiem prawie każda ich mutacja to mutacja letalna. (?)

18. Co to są pseudogeny? Podaj przykłady

Pseudogeny to zmutowane wersja genu wyjściowego nie mająca zdolności produkcji białka. Często zawiera mutacje nonsensowne, generujące kodony stop.

● przetworzone pseudogeny-kopie mRNA przepisane na DNA na drodze retrotranspozycji (brak intronów, promotora)

●fragmenty genów-brak 5' lub 3' regionu genu wyjściowego; powstały w wyniku delecji lub rekombinacji, która rozszczepiła gen wyjściowy.

Przykłady: pseudogeny globinowe gamma-aktyny, 5S rRNA

20. Sposoby regulacji ekspresji genów

●U Prokaryota:

-regulacja na poziomie inicjacji transkrypcji

○ włączanie i wyłączanie operonów przez substrat pozwalające na szybkie reakcje w zmieniającym się środowisku

-represja kataboliczna

○umożliwia priorytetowe wykorzystanie glukozy jako źródła węgla

mechanizm: W otoczeniu dostępna jest laktoza i glukoza. Laktoza (induktor) łączy się z białkiem represorowym przyczepionym do operatora i uniemożliwiającym transkrypcje operonu laktozowego. Następuje dysocjacja represora i związanego z nim induktora.

Aby transkrypcja zachodziłą na wysokim poziomie potrzebny jest jednak jeszcze jeden, a właściwie 2 elementy regulacyjne: jest to białko CAP związane z cAMP. Wiąże się ono w okolicy promotora i umożliwa wydajną transkrypcję. cAMP należy do klasy alarmonów- jest sygnałem głodu glukozowego. Gdy glukozy nie ma, cAMP jest produkowany przez cyklazę adenylową. Jeśli zaś glukoza jest obecna, cAMP nie jest wytwarzany, biało CAP nie ma zdolności wydajnego wiązania się w okolicy promotora i transkrypcja zachodzi na bardzo niskim poziomie.

-regulacja azotowa i enhancery

Preferowanym źródłem azotu jest amoniak. Bakterie mogą asymilować azot z amoniaku w wyniku redukcyjnej aminacji 2-ketoglutaranu, katalizowanej przez dehydrogenazę glutaminianu w wyniku czego powstaje glutaminian. Jednak jeśli stężenie NH₃ jest niskie to reakcja ta nie zachodzi i obniża się poziom glutaminy co stanowi sygnał uruchamiajmy kaskadę enzymatyczną której efektem jest aktywacja poprzez fosforylację białka NtrC, które z kolei aktywuje transkrypcję genu syntetazy glutaminy.

-Atenuacja

Atenuacja jest niezwykle ważnym procesem umożliwiajćym wysublimowane dopasowanie poziomu ekspresji genu w zależności od stężenia substratu w otoczeniu.

(str. 220-222 genetyka molekularna)

-Antyterminacja

Występuje u fagów. Umożliwia zniesienie sygnału terminacji transkrypcji;

U fagów występują geny ulegające wczesnej, średniej i późnej ekspresji.

Na początku produkty genów średnich i późnych nie powstają ze względu na występujący na początku ich sekwencji sygnał terminacji. Produkty wczesnych genów znoszą sygnał terminacjo genów średnich, a produkty genów średnich- sygnały terminacji genów późnych.

-regulacja przez alternatywne czynniki sigma

Podjednostka sigma jest odpowiedzialna za rozpoznawanie promotorów. Bakterie syntetyzuje alternatywne czynniki sigma rozpoznające róźne zestawy promotorów. Te inne czynniki pojawiają się np. w wyniku szoku cieplnego, sporulacji.

● U Eukaryota

- zmiany szybkości transkrypcji

○Oddziaływania polimerazy RNA II z czynnikami transkrypcyjnymi i czynników z matrycą DNA.

Czynniki transkrypcyjne zawierają domeny wiążące DNA. Są trzy typy domen: Helisa-zwrot-helisa, palce cynkowe :D oraz domeny zasadowe.

○sekwencje wzmacniające i wyciszające- działają cis lub trans dzięki zdolności DNA do tworzenia pętli.

-potranskrypcyjne systemy regulacyjne

○alternatywny splicing- dana sekwencja w jednym przypadku może zostac potraktowana jak intron i wycięta, a w innym jak ekson.

○redagowanie RNA

○regulacja przez wybór miejsca terminacji- mechanizm niewyjaśniony, wiadomo że znajduje się sygnał poliadenylacji o sekwencji AAUAAA który jest rozpozanawny przez endonukleaze, cięty i dołączany jest ogonek poliA.

○regulacja transportu mRNA do cytoplazmy

○regulacja stabilności mRNA i białek

21. Co to są plazmidy i jaka jest ich rola w inżynierii genetycznej?

Plazmidy są to koliste, pozagenomowe fragmenty DNA występujące u bakterii i drożdży. Posiadają własne miejsce startu replikacji. Wyróżniamy plazmidy typu R warunkujące opornośc na antybiotyki, typu F- konigację, plazmidy kolicynowe- kodują kolicyny zabijające inne bakterie, degradacyjne- kodują białka pozwaljaće na przyswajanie nietypowych związków jaktoluen czy kwas salicylowy, plazmidy wirulencji-nadają bakteriom zdolność do wywoływania chorób.

Plazmidy warunkują zmienność genetyczną bakterii.

W inżynierii genetycznej stosowane są jako wektory do klonowania oraz wektory ekspresyjne.

23. Etapy sekwencjonowania metodą Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilość jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie włączenia takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` końcu.

Synteza zostaje zahamowana losowo - powstaje mieszanina fragmentów o różnej długości.

Następnie mieszaninę z każdej probówki poddaje się elektroforezie elektroforezie odczytuje sekwencję.

24. Reagenty replikacji:

●białko inicjatorowe- u bakterii białko DnaA, produkt genu dnaA- owija wokół siebie DNA zrywając początkowe wiązania wodorowe; wykazuje właściwości ATPazy i kontynuuje zrywanie wiązań. Powstaje kompleks otwarty.

●helikaza replikacyjna- produkt genu dnaB, występuje w cytoplazmie cytoplazmie kompleksie z produktem genu dnaC. Białko DnaC służy do utrzymuje helikaze w stanie nieaktywnym oraz wprowadza ją do kompleksu otwartego. Wtedy oddysocjowuje uwalniając aktywną formę helikazy, która usuwa białko DnaA i kontynuuje rozdzielanie nici.

●białka stabilizujące SSB- przyłączają się do pojedynczych, rozdzielanych nici stabilizując je

●startery

●polimerazy DNA ( u bakterii replikazą jest polimeraza DNA III, u eukariotów polimeraza delta)

●topoizomerazy- topoizomeraza relaksująca naprężenia powstałe podczas procesu- nie wymaga dostarczania energii, gyraza- wprowadza nowe skręcenia, np. z dodatnich na ujemne, wymaga dostarczania ATP.

●ligazy łączace fragmenty Okazaki

●histony- przyłączają się do nowo zsyntetyzowanych nici

●dNTPs

●Mg²⁺

●primaza

---