ćwiczenia I

Podłoże mikrobiologiczne - środowisko zapewniające optymalne warunki do rozwoju mikroorganizmów. Musi być ono jałowe, przejrzyste i zawierać odpowiednie składniki - źródło węgla, azotu, energii (z reguły źródłem energii w podłożu jest węgiel).
Podłoże mikrobiologiczne musi być także wyposażone w odpowiednie pH, ciśnienie osmotyczne oraz potencjał redox.

Podział podłoży mikrobiologicznych:
a) stan skupienia:
- płynne - namnażanie bakterii,
- półpłynne - obserwacja ruchów bakterii + określanie cech biochemicznych,
- stałe - zwykle w formie tzw. `skosu', stosowane w celu przechowywania bakterii.
b) zawartość składników odżywczych:
- minimalne (zawierają jedno źródło węgla, pochodzące głównie z rozkładu węglowodanów, np. podłoże M9 - z ropą naftową),
- pełne (wiele źródeł węgla, np. bulion odżywczy),
- wzbogacone (stosowane z reguły do posiewu bakterii chorobotwórczych; wzbogacone o krew, mleko, żółtko jaja, itp.).
c) pochodzenie:
- naturalne (np. bulion),
- półsyntetyczne (większość składników podłoża jest znanych, lecz nie wszystkie),
- syntetyczne (o konkretnie określonym składzie).
d) zastosowanie:
- z dodatkiem czynnika selekcyjnego (np. podłoże z antybiotykiem, metalem ciężkim, itp.),
- podłoże do namnażania,
- wybiórcze (podłoże, w przypadku którego składniki powodują wzrost jednej grupy mikroorganizmów, hamując jednocześnie rozwój drugiej; z reguły są to podłoża stałe),
- namnażająco-wybiórcze (hamowanie namnażania jednej biomasy, namnażanie drugiej),
- identyfikacyjne (wykrywanie konkretnego gatunku mikroorganizmów).

Agar - policukier, otrzymywany z glonów. Posiada gęstszą konsystencję niż żelatyna i ulega topnieniu w temp. powyżej 45 stopni Celsjusza. Jest rozkładany przez nieliczne bakterie; jego skuteczniejszość jest więc większa niż żelatyny.

Żelatyna - białko, będące hydrolizatem kolagenu, pozyskiwane z wieprzowiny.

Dezynfekcja - zabijanie tylko form przetrwalnikowych.
Sterylizacja - zabijanie form wegetatywnych i przetrwalnikowych mikroorganizmów.
Pasteryzacja - rodzaj sterylizacji, w którym przyjmowaną temperaturą jest 60-70 stopni Celsjusza (WYJĄTEK! - pasteryzacja UHT - ciecz poddawana jest wysokiej temperaturze tylko na kilka sekund).

Ultra high temperature processing (UHT) - polega na błyskawicznym, 1-2 sekundowym podgrzaniu do temp. ponad 100 °C (135-150 °C dla mleka) i równie błyskawicznym ochłodzeniu do temperatury pokojowej. Cały proces trwa 4-5 sek. Zabija to florę bakteryjną nie zmieniając walorów smakowych produktu.

Proces stosowany był początkowo w mleczarstwie, obecnie stosuje się go w pełnej gamie produktów pakowanych aseptycznie.

Laminar - stanowisko pracy mikrobiologa, oddzielone od środowiska szybą, wyposażone w światło UV oraz przepływ sterylnego powietrza.

Autoklaw - urządzenie, służące sterylizacji pożywek o składnikach odpornych na wysokie temperatury. Sterylizacja możliwa jest dzięki gorącemu (120 stopni Celsjusza) sprężonemu powietrzu.

Wyjaławianie parą wodną przeprowadza się w autoklawach (aparatach ciśnieniowych), wyposażonych w przyrządy do pomiaru temperatury i ciśnienia oraz odpowiednie elementy zabezpieczające (zawory).
Sterylizacja parą wodą pod ciśnieniem
Wyjaławianie parą wodną prowadzi się w autoklawach wyposażonych w przyrządy do pomiaru temperatury i ciśnienia oraz elementy zabezpieczające w postaci zaworów. Parametry sterylizacji w autoklawach to:
• 121^°C w czasie 15 minut
• 134^°C w czasie 3 lub 5 minut
Sam proces sterylizacji składa się z kliku etapów:
• czas nagrzewania - potrzebny do przeniknięcia ciepła w głąb materiału
• czas wyrównywania temperatury - oddawanie ciepła materiałowi do chwili wyrównania temperatur
• czas wyjaławiania - właściwa sterylizacja
• czas schładzania autoklawu - od chwili przerwania ogrzewania do momentu wyrównania ciśnienia wewnątrz urządzenia do ciśnienia atmosferycznego

Ta metoda może być stosowana do sterylizacji bielizny, materiałów opatrunkowych, narzędzi, materiałów gumowych, wody czy roztworów substancji nie rozkładających się w temperaturze sterylizacji. W przypadku sterylizacji w hermetycznie zamkniętych pojemnikach wytwarza się nadciśnienie, którego wielkość zależy od stopnia wypełnienia. Należy więc pamiętać, by był on wypełniony w nie więcej niż 85%, gdyż może nastąpić rozerwanie pojemnika, gdy roztwór zajmuje ponad 90% pojemności. Należy również strzec się przed wyjmowaniem zawartości autoklawu tuż po jego otwarciu, kiedy jeszcze temperatury płynu i komory urządzenia nie są wyrównane.
Jest to metoda niezawodna, tania, szybka i bezpieczna dla ludzi i środowiska.

Suszarki - urządzenia, służące do sterylizacji szkła. Sterylizacja w wysokiej temperaturze (140-160 stopni Celsjusza).

Sterylizacja suchym, gorącym powietrzem
Przeprowadza się ją w sterylizatorach z wymuszonym obiegiem powietrza lub bez wymuszonego obiegu, stosując temp. 160-180^°C, utrzymywane przez okres od kilkunastu minut do dwóch godzin. Warunki tego rodzaju sterylizacji zależą głównie od wyjaławianego materiału i jego wytrzymałości termicznej. Nie można tutaj wyjaławiać gumy, wyrobów włókienniczych, płynów czy materiałów opatrunkowych. Materiał poddawany sterylizacji powinien być suchy, czysty i zabezpieczony przed powtórnym skażeniem za pomocą odpowiedniej folii. Metoda ta jest dość długotrwała i nie ekonomiczna. Charakteryzuje się powolną dyfuzją i penetracją ciepła oraz znacznymi różnicami temperatur między poszczególnymi punktami wewnątrz komory. W wielu krajach metoda ta została wycofana z użycia przy wyjaławianiu narzędzi, w Polsce wciąż stosuje się ją do sterylizacji szkła laboratoryjnego.

Aparat Kocha - służy do sterylizacji podłoży. Jest to wielki kocioł, z podwójnym dnem. W dolnym rejonie kotła znajduje się gorąca woda, która przechodząc w parę wodną (temp. Ok 100 stopni Celsjusza), unosi się w wyższe rejony kotła i sterylizuje podłoża. Jest to metoda sterylizacji, w przypadku której formy przetrwalnikowe i niektóre wirusy nie ulegają degradacji.

Sterylizacja przez filtrację - rodzaj sterylizacji, w przypadku którego używany jest specjalny zestaw filtrujący (lejek, kolba, pompka wytwarzająca podciśnienie, itp.). Wielkość porów w lejku zależy od filtrowanego materiału: 0,22 mikrometrów - dla bakterii, 0,45 mikrometrów - dla wirusów.






Sterylizacja promienieniami UV - ta metoda sterylizacji używana jest głównie do wyjaławiania pomieszczeń. Zakres długości fali świetlnych: 230 - 270 nanometrów (długość fali zabójcza dla bakterii: 260 nm).
Traktowanie bakterii falą o długości 260 nm powoduje tworzenie dimerów:
a) tyminy - DNA staje się niestabilne, co prowadzi do śmierci bakterii,
b) cytozyny - efekt mutagenny.

TYNDALIZACJA - 3-krotna sterylizacja podłoża (powodowanie kiełkowania form przetrwalnikowych, a następnie sterylizacja. Czynności te przeprowadza się 3 razy).

DEKOKTACJA - sterylizacja przez gotowanie.

WYŻARZANIE - opalanie sprzętu laboratoryjnego (ezów).

FOTOREAKTYWACJA - naprawda DNA u bakterii. Polega ona na rozszczepianiu dimerów przez odpowiedni enzym (fotoliazę).

Sanityzacja - działania, zapobiegające zakażeniom oraz ograniczające rozwój bakterii (traktowanie detergentami, środkami chemicznymi).

Aseptyka - postępowanie mające na celu dążenie do jałowości pomieszczeń, narzędzi, materiałów opatrunkowych i innych przedmiotów w celu niedopuszczenia drobnoustrojów do określonego środowiska, np. otwartej rany.

Antyseptyka - postępowanie odkażające, mające na celu niszczenie drobnoustrojów na skórze, błonach śluzowych, w zakażonych ranach. W przeciwieństwie do dezynfekcji, antyseptyka nie dotyczy odkażania przedmiotów.

ćwiczenia 2

Rodzaje mikroskopów:
a) Mikroskop akustyczny - przyrząd wykorzystujący fale ultradźwiękowe (o częst. do kilku GHz) do otrzymywania powiększonego obrazu elementów struktury ośrodka sprężystego,
b) Mikroskop elektronowy zbudowano według idei mikroskopu optycznego ale w miejsce promieni świetlnych używa się wiązki elektronów,
c) Mikroskop fluorescencyjny to mikroskop świetlny używany w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych, którego działanie oparte jest na zjawisku fluorescencji i fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskami odbicia i absorpcji światła (co jest wykorzystane w klasycznym mikroskopie optycznym). Pozwala na wyznakowanie interesujących elementów komórki (np. białek, czy organelli), fluoforami o zadanych właściwościach (np. barwie emisji),
d) Mikroskop holograficzny to mikroskop pozwalający uzyskać bardzo dużą głębię ostrości i szybką rejestrację obrazów 3D, dzięki pomiarowi natężenia i fazy promieniowania rozproszonego przez obiekt. W m.h. soczewkowym najpierw otrzymuje się zarejestrowany na płycie fot. obraz interferencyjny, a następnie, po jego wywołaniu, odtwarza z niego holograficzny obraz pozorny obserwowany za pomocą okularu,
e) Mikroskopia jonowa - bardziej poprawnie zwana mikroskopią pola jonowego Field ion microscopy (FIM) to technika analityczna stosowana w nauce o materiałach. Za pomocą tej techniki można oglądać atomy na powierzchni specjalnie spreparowanych, gładkich i twardych metalowych odkuwek,
f) Mikroskop konfokalny - nowoczesna odmiana mikroskopu świetlnego, w którym źródłem światła jest laser. Mikroskop ten umożliwia dokonywanie tzw przekrojów optycznych preparatu, analizuje bowiem światło pochodzące z jednej jego płaszczyzny, eliminując światło docierające z warstw położonych wyżej lub niżej,
g) Mikroskop optyczny to urządzenie do silnego powiększania obrazu, wykorzystujące do generowania tego obrazu światło przechodzące przez specjalny układ optyczny składający się zazwyczaj z zestawu kilku-kilkunastu soczewek optycznych. Mikroskop optyczny może wykorzystywać zwykłe światło dzienne, dostarczane do układu optycznego przez specjalne lusterko, lub wykorzystywać sztuczne światło, którego źródło znajduje się zazwyczaj pod analizowaną próbką.  Mikroskop optyczny używany do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym. Stosowany jest m.in. do badania: kruszców, minerałów, preparatów biologicznych, struktury komórek i tkanek, w matalografii, w przemyśle szklarskim i włókienniczym,


h) Mikroskop stereoskopowy (binokular) - mikroskop optyczny z oddzielną optyką dla obu oczu pozwalający na przestrzenne widzenie obrazu powiększanego.

Budowa mikroskopu optycznego:




Zdolność rozdzielcza mikroskopu - najmniejsza odległość między dwoma punktami, które dostrzegalne są jeszcze oddzielnie.
Zastosowanie olejku immersyjnego powoduje zwiększenie zdolności rozdzielczej mikroskopu.
Wzór:
d = 2A/ λ A - apertura numeryczna, lambda - dł.fali świetlnej.


Barwienie mikroorganizmów:
- barwienie proste - barwienie preparatu tylko jednym barwnikiem przez 1-2 minut, np. barwienie drożdży fioletem metylenowym,
- barwienie złożone - barwienie preparatu kilkoma barwnikami wg ściśle określonej kolejności lub znajdujących się w mieszaninie. (Barwienie metodą Gramma, Neissera, Ziehl-Neelsena),
- barwienie pozytywne - polega na zabarwieniu w preparacie komórek (dobrze wybarwiony obiekt na jasnym tle),
- barwienie negatywne - uniewidocznienie otoczenia (tło wybarwione, natomiast komórki jasne, niewybarwione). Metoda stosowana przede wszystkim do barwienia krętków i otoczek bakterii,
- barwienie przyżyciowe - działanie na nieutrwalony preparat żywych drobnoustrojów barwnikiem w dużym rozcieńczeniu, nie niszcząc komórek.

- barwienie utrwalone - barwienie nieżyjących drobnoustrojów, prowadzące do uszkodzenia komórek.

Barwniki - związki chem., zdolne do adsorbowania się na lub rozpuszczania się w barwionych substancjach, dając trwałe, barwne połączenia. W cząst. Tych związków wyróżniamy grupę chromoformową (barwną, grupy azo-, nitrozo-, azoksy-, itp.). i grupę auksochromową, zdolną do tworzenia soli z barwionym substratem.

Rodzaje barwników:
- kwaśne - często używane do barwienia tła preparatu, np. eozyna, fuksyna kwaśna, nigrozyna,
- zasadowe - najczęściej stosowane w roztworach alkoholowych lub wodnych, np. błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczkowy, fuksyna zasadowa.

BARWIENIE METODĄ GRAMA:
- zastosowanie: podział bakterii na Gram-dodatnie i Gram-ujemne,
- wykonanie rozmazu zawiesiny drobnoustrojów,
- utrwalenie w płomieniu palnika,
- barwienie: (wszystkie etapy barwienia przedziela się przemywaniem preparatu wodą)
a) r-r fioletu krystalicznego (2-3 min),
b) utrwalenie płynem Lugola (1,5-2 min),
c) odbarwienie etanolem (z dodatkiem acetonu, 30 sek.),
d) odbarwienie barwnikiem kontrastowym (np. safranina, 20 sek).
Drobnoustroje barwiące się na fioletowo są określane jako Gram-dodatnie, Gram-ujemne to natomiast te, które barwią się na różowy(czerwony)

BUDOWA ŚCIAN KOMÓRKOWYCH

Gram +	Gram -
- zbudowana z wielu warstw peptydoglukanu, który odwodniony etanolem zostaje uszczelniony, - alkohol powoduje wytrącanie się szkieletu cukrowego oraz denaturację peptydów, - efektem tego jest trwałe zamknięcie porów między warstwami mureiny i zatrzymanie barwnika w komórce. -barwią się na fioletowo (brązowe - dobarwiane)	- 1-3 warstw peptydoglukanu, (mureiny) - potraktowanie alkoholem tak cienkiej warstwy nie jest wystarczające by zamknąć pory komórkowe, -Ściana kom. jest cieńsza, zawiera mniej peptydoglikanu - barwnik więc zostaje wymywany, a komórka przybiera kolor różowy.

ćwiczenia 3

1.Komórka drożdży jako przykład komorki eukariotycznej . Budowa.

Drożdże - drobnoustroje eukariotyczne, rodzaj jednokomórkowych grzybów z rodziny drożdżakowatych (Saccharomycetaceae), mają zdolność do fermrntwania laktozy, wytwarzania białek z alkanów i odpadów papierniczych, produkcji glicerolu i D-glucitolu. Są źródłem enzymów np. β-D-galaktozydazy i lipazy.

Są chemoogranotrofami - wykorzystują związki organiczne jako źródło węgla i energii.

W dojrzałej komórce drożdżowej wyróżniamy ścianę komorkową, błonę cytoplazmatyczną, jądro komórkowe, rybosomy, mitochondria, aparat Golgiego, wodniczki(zawierają enzym hydrolizujący glikoproteidy)oraz materiały zapasowe.

2.Materiały zapasowe:

Glikogen - rezerwa cukrowa, odkładany w postaci ziaren (płyn Jugola - brunatnoczerwony) Tłuszcze (lipidy)- Sudan III - ceglastoczerwony Wolutyna (polifosforany) - błękit toluidynowi

gromadzone zależnie od warunków pokarmowych i gatunku

3.Budowa ściany komórkowej

W skład ściany komórkowej drożdży wchodzą hemopolimery - glukany i mannany, uzupełnione niewielkimi ilościami chityny i białek.

Białka są częścią glikoproteidów w ścianie, głównie mannoproteiny, spełniają rolę antygenów odgrywją rolę w zachowaniu integralności całej struktury ściany kom. są też receptorami swoistymi dla feromonów płciowych i toksyn.

Chityna (α-chityna) stanowi fragmęty sztywny, szkieletowy. Jest to polimer N-acetylo-D-glukozaminy.

Główną część ściany kom. stanowią mannoproteiny w skład których wchodzą 2 rodzaje polimerów mannozowych (wysokocząsteczkowy i niskocząsteczkowy oligomannan) połączonych kowalencyjnie z białkami ściany.

Część sztywną ściany komórki tworzą glukany z domieszka chityny. Determinują kształt komórki i zabezpieczają przed uszkodzeniami mechanicznymi, a także zapobiegają lizie komórki w środowisku hipotonicznym. W ścianie występuje wiele enzymów.

Mannoproteiny tworzą fragmęty zewnętrzny ściany - ich część cukrowa nadaje komórce swoistość immunologiczna

- mannany 30% + białka - glukany 30% - chityna - białka 13% + Plazmolemma (błona cytoplazmatyczna) - lipidy 1%

ściana komórkowa (glukany, mannany, chityna, niewielki ilości białka, lipidy) czasami heteropolisacharydy - galaktomannan, fukomannan, ksylomannan.

chityna oraz glukany = fragment sztywny, szkieletowy; determinują kształt kom., zabezpieczają przed uszkodzeniami

polisacharydy działają stabilizująco na ścianę komórkową

przestrzeń neryplazmatyczna

cytoplazma (większość przemian enzymatycznych, rozkład substancji niezbędnych dla komórki)

jądro komórkowe (materiał genetyczny)

rybosomy (produkcja białek)

mitochondria (procesy stanowiące główne źródło energii ATP dla komórki)

aparat Golgiego

wakuole (enzymy hydrolityczne)

materiały zapasowe: glikogen, tłuszcze, wolutyna (polifosforany)

gromadzone zależnie od warunków pokarmowych i gatunku

4.Rozmnażanie

Drożdże rozmnażaja się:

- wegetatywnie:

- przez pączkowanie (jednobiegunowe, 2-biegunowe, wielobiegunowe) - wytworzenie pączka na powierzchni komórki, który po osiągnięciu odpowiednich rozmiarów odrywa się; na powierzchni obu komórek pozostają blizny.

- przez podział (rozszczepianie) - Endomycetaceae, Schizosaccharomycetaceae - drożdże o kształcie cylindrycznym; następuje wzrost wydłuzeniowy, po środku tworzy się przegroda (septa) dośrodkowo zamykająca światło komórki; po całkowitym utworzeniu przegrody następuje stopniowe oddzielanie się komórek.

- artrospory - Trichosporon, Dipodascus - jednokomórkowe twory, powstają w skutek rozpadu grzybni podzielonej septami, na regularne cylindryczne fragmęty. Artrospory, grzybnia właściwa i pseudogrzybnia powstają często w jednej kulturze drożdrzy

- podział grzybni

-generatywne - na drodze płciowej (drożdże właściwe zaliczane do workowców): Polega ono na łączeniu się dwóch komórek (koniugacji) w wyniku czego powstaje worek wypełniony zarodnikami płciowymi:

haploidalne - (Octosporomyces octosporus) przebiega w haplofazie; haploidalne komórki układaja się parami obok siebie, kopulują i po zlaniu się ich jader zespalaja się. Jądro zygoty dzieli się mejotycznie, co prowadzi do powstania 4-8 haploidalnych spor (auksospor), które po uwolnieniu z worka przekształcają się w komórki macierzyste

diploidalne - (Saccharomycodes ludwigii) dochodzi do kopulacji 1n askospor wewnątrz worka, powstaje 2n zygota, która dalej przekształca się w komórki wegatatywne rozmnażające się na drodze pączkowania, nie są zdolne do mejozy i tworzenia generatywnych spor

podczas procesów płciowych drożdże wytwarzają feromony - oligopeptydy.

Cykl komórkowy drożdży - faza diploidalna i haploidalna

5. Warunki hodowli drożdży

Drożdże są tlenowcami, chociaż mogą również rosnąc w warunkach beztlenowych (fermentacja etanolowa).

rozmnażające się w temp. 25° - 28°C, o dużej trwałości fizjologicznej podczas fermentacji, które prowadzi się 1-3 dni. Do procesów fermentacji Saccharomycodes cerevisiae wykorzystuje glukozę, galaktozę, fruktozę, sacharozę, maltozę, maltotriozę i ksylozę.

- cukry (glukoza) - źródło węgla - azotu (aminokwasy) - soli mineralnych - fosfor ( fosforan amonu, brzeczka - słód jęczmienny)

Brzeczka - półprodukt stosowany przy produkcji piwa lub miodu pitnego. Brzeczka piwna przygotowywana jest ze słodu, chmielu, wody oraz ewentualnie innych surowców niesłodowanych, takich jak cukier, glukoza, miód, syropy owocowe.

6. Zastosowanie drożdży w przemyśle :

- winiarstwo i browarnictwo (Tokay, Malaga, Steinberg) - gorzelnictwo - oczyszczanie ścieków - piekarnictwo (CO2 - spulchnianie ciasta) - przemysł paszowy (dodatek do pasz - białko Torulopsis i Candida) - przemysł mleczarski

lizozym - enzym hydrolizujący wiązanie pomiędzy GlcNaC (N-acetyloglukozamina) i NAcMurA (kwas N-acetylumuraminowy) w peptydoglikanie

protoplasty - komórka całkowicie pozbawiona ściany, otoczona jedynie przez błonę cytoplazmatyczną ( działanie lizozymu za ścianę kom. bakterii Gram +) ma zawsze kształt kulisty, wrażliwe na ciśnienie osmotyczne (środowisko hipertoniczne utrzymuje je przy życiu)

sferoplasty - bakterie Gram - potraktowane lizozymem, zachowują pewną ilość składników ściany komórkowej

Mechanizm barwienia grama

1.Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.

2.Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie fioletowe.

3.Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też, że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka, które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach^[1] lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet^[1].

4.Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są fioletowe, zaś Gram-ujemne - bezbarwne.

5.Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) barwi komórki Gram-ujemne na różowo, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

Ściana komórkowa bakterii:

Gram +

- białko M (chroni bakterie przed fagocytozą)

- polisacharydy

- kwasy teichojowe

- białko A

- peptydoglikan (7-9 warstw)

- białka na zewnętrznej stronie błony

- błona komórkowa

- białka strukturalne błony komórkowej (wewnątrz błony)

- białka wewnętrznej strony błony komórkowej

Warstwę sztywną tworzy peptydoglikan. Warstwę plastyczną tworzy kilka rodzajów heteropolimerów kwasów: teichojowych, teichouronowych i lipoteichojowych ( nadają komórce ładunek ujemny)

Gram -

- lipopolisacharydy

- białka strukturalne (białko OmpA , białko śrudbłonowe - białko strukturalne u E. coli, lipoproteina Brauna

- antygen pokrywowy

- antygen wspólny

- białka porynowe ( białko funkcjonalne)

- błona zewnętrzna (lipidy, białka lipoproteiny Brauna, lipopolisacharydy, antygenwspólny)

- białka wiążące

- przestrzeń peryplazmatyczna (znajduje się w niej peptydoglikan)

- peptydoglikan ( 1-3 warstwa) (związane z peptydoglikanem)( oddziels przestrzeń peryplazmatyczną od warstwy plastycznej)

- oligosacharydy błonopochodne

- białka na zewnętrznej str. bł. kom.

- błona kom.

- białka strukturalne bł. kom.

- bałk. wew. str. błony kom.

Dominująca część ściany to warstwa plastyczna (błona zew.)

Peptydoglikan - ( inaczej murena, glikopeptyd, mukopeptyd, muropeptyd) tworzy tzw. warstwę sztywną. Zbudowany z N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylumuraminowego połączonych wiązaniem glikozydowym.

ćwiczenia 4

Grzyby strzępkowe (inaczej pleśniowe) - mikroorganizmy o budowie eukariotycznej, zaliczanie do grzybów właściwych.
- plecha utworzona jest z rozgałęzionych strzępek tworzących skupisko - grzybnię (mycelium),
- ściana kom. komórek strzępków zbudowana jest z glukanu i chityny, oraz z białek i lipidów,
- u grzybów wyższych strzępki podzielone są przegrodami poprzecznymi (septami) na jedno-, dwu- lub wielojądrowe kom.,
- u grzybów niższych strzępki są niepodzielone i stanowią wielojądrową komórkę - zwaną komórczakiem,

ROZWÓJ WEGETATYWNY:
- za pośrednictwem spor (forma spoczynkowa i jednocześnie używana do reprodukcji),
- spory są jednokom., i pigmentowanymi tworami, a u niektórych grzybów mogą być ruchliwe,

W zależności od sposobu i miejsca tworzenia spor wyróżnia się następujące ich rodzaje:
a) spory powstałe w wegetatywnej grzybni:
- chlamydospory (fragm. Strzępek dodatkowo obłonione),
- artrospory (stworzone z końcowych fragm. Strzępek grzybni, np. u Geotrichum),
- blastospory (tworzone w wyniku szczytowego lub bocznego pączkowania strzępki konidionośnej, np. u Cladosporium),
b) spory konidialne (- konidia - tworzone przez grzyby rozmnażające się bezpłciowo (anamorfy) np. u Penicillium, Aspergillus,
c) aksospory (- zarodniki - tworzone w workach (asci) u grzybów rozmnażających się płciowo (teleomorfy), np. Chaetomium,
d) zygospory (kom.tworzone u grzybów klasy Zygomycetes, rozmn. Się płciowo),
e) sporangiospory (umieszczone w sporangium (w zarodni), powstałe w bezpłciowym rozmnażaniu grzybów klasy Zygomycetes).

Spory (c.d):
- forma morfologiczna pleśni,
- w nich ulegają spowolnieniu przemiany metaboliczne,
- zawierają mało wody (6-13%),
- kiełkowanie i kierunek rozwoju strzępki jest stymulowany bodźcami zewnętrznymi (tropizmami) - fototropizm, hydrotropizm, tigmotropizm, co dowodzi szczególnej wrażliwości grzybów na czynniki środowiska,
- wykazują dużą zdolność przetrwalnikową (dzięki wielowarstwowej osłonie zewnętrznej).

KIEŁKOWANIE spor jest przejściem od stanu spoczynku (ANABIOZY) do stanu aktywności biologicznej:
- wyraźne zwiększenie objętości spory (pobieranie wody ze składnikami odżywczymi),
- woda aktywuje enzymy hydrolityczne oraz oddechowe i rozpoczynają się procesy energetyczne (zasilane związkami zapasowymi - mannitolem, trehalozą, fosfolipidami),
- chityna i glukan są gromadzone w regionach spory, z których wykształci się kiełek rostkowy, zapoczątkowujący wegetatywny rozwój grzybni; równocześnie w tych miejscach działają enzymy lityczne, rozpuszczające ść.kom., dzięki czemu możliwy jest ten etap rozwoju,
- Kiełkowanie sporów zależy od:
a) właściwości szczepu,
b) zawartości wody i subst.odżywczych,
c) składu podłoża,
d) temperatury,
e) wartości pH,
f) dostępności tlenu,
- wegetatywna grzybnia tworzy się w wyniku przekształcania kiełka rostkowego w strzępkę, jej wydłużania i rozgałęziania,
- wzrost strzępek grzybni jest APIKALNY (wierzchołkowy), w wyniku dostarczania tam materiałów, budujących ść.kom.,
- ść.kom. na wierzchołku strzępki jest cieńsza niż w odcinkach oddalonych od szczytu,
- materiały do budowy ściany są wytwarzane w ER w dalszych cz.strzępki, skąd w postaci pęcherzyków są przenoszone do końcowej cz.strzępki,
- pęcherzyki wydzielnicze transportują do apikalnej cz.strzępki enzymy lityczne, które wnikając do ść. Rozluźniają jej strukturę,
- w miejsca te dostarczane są enzymy syntezujące nową ścianę z mat. Z odpowiednich pęcherzyków,
- w miarę oddalania się od wierzchołka strzępki ść.kom.,jest pogrubiana BAZYPETALNIE (warstwy odkładane od str.wew.),
- struktura staje się bardziej zwarta, wzrasta ilość chityny i glukanu oraz pozostałych składników,
- odgałęzienia nowej strzępki tworzą się poprzez powstanie uwypuklenia, które staje się jej początkiem,

- długość strzępek jest nieograniczona,
- wegetatywny rozwój grzybni w pierwszym etapie związany jest z TELOFAZĄ (równowaga między pobieraniem składników podłoża a ich przemianą w reakcjach ),
- w miarę gromadzenia się różnych metabolitów i zakłócenia równowagi grzybnia wkracza w IDIOFAZĘ (zmiany morfologiczne),
- w idiofazie budowane są także septy, ść.poprzeczne, a niektóre komórki zmieniają się chlamydospory,
- zdolność tworzenia strzępek mostowych (anastomozy) - łączą rozgałęzienia różnych strzępek zabezpieczających ciągłość cytoplazmatyczną całej plechy,
- strzępki mające bezpośredni kontakt z podłożem tworzą grzybnię substratową (WGŁĘBNĄ), której f.jest pobieranie składników podłoża i transport do wierzchołkowych frakcji grzybni,
- w warunkach wzrostu w całej objętości pożywki (hodowla wgłębna) grzybnia występ.w formie mniej lub bardziej zwartej w postaci kuleczek (pellets),
- w cytoplazmie grzybów strzępkowych mogą gromadzić się subst.zapasowe: glikogen, wolutyna, lipidy,
- w błonach kom.występują sterole (najwięcej ergosterolu).


BUDOWA ŚCIANY KOMÓRKOWEJ GRZYBÓW STRZĘPKOWYCH


- 1 - warstwa zew. (amorficzny βglukan), bezpostaciowa - polisacharydy - glukan (30-60% suchej masy ściany),
- 2 - gruba siatka glikoproteinowa zatopiona w białku (np. mannoproteina),
- 3 - białko (20%), lipidy (1-3%),
- 4 - warstwa wew. - białko + chityna (10-30%) - chityna nadaje ść.kom.sprężystość i trwałość.

Rozmnażanie - stadium rozwojowe, w którego powstaje nowy osobnik o cechach typowych dla określonego gatunku.

WRÓŻNIA SIĘ DWA RODZAJE ROZMNAŻANIA:

a) bezpłciowe, wegetatywne (ANAMORFICZNE):
- jeden haploidalny organizm bez fazy jądrowej,
- utworzona grzybnia w idiofazie tworzy specyficzne struktury służące do przetrwania i rozprzestrzeniania,
- faza diploidalna istnieje w cyklu paraseksualnym - połącznie dwóch strzępek genetycznie różnych szczepów i utworzenie heterokariotycznej grzybni, w której w wyniku kariogamii może powstać diploidalne jądro,
- w wyniku rekombinacji genetycznej (mitotyczne c/o) powstaje nowa odmiana szczepu, łączącego cechy organizmów rodzicielskich,
- u Zygomycetes na szczycie strzępki powietrznej tworzy się sporangium (zarodnia), w której w wyniku mitot.podziału jądra powstają mitospory (sporangiospory) - haploidalne zarodniki.

b) płciowe (TELEOMORFICZNE):
- w tym rozmnażaniu uczestniczą kom.płciowe (gamety) jedno- lub różnoimienne, które tworzą się w gamentangiach (haploidalnych elementach płciowych),
- u grzybów bez organów płciowych, ale z cechami płciowości rozmnażanie to zachodzi między wegetatywnymi kom. O zróżnicowanej plechowości,
- w wyniku fuzji cytoplazmy dochodzi do utworzenia zygoty,
- u Zygomycetes przez pewien czas zygota zawiera podwójną l.jąder, ściana zygoty grubieje (staje się inkrustowana, ciemniejsza od grzybni, przyjmuje cechy przetrwalne, skąd określana jako zygospora),
- dochodzi do kariogamii, czyli po połączeniu haploidalnych jąder powstaje diploidalna zygota, a następnie w wyniku mejozy, tworzą się haploidalne zarodniki o zmienionych cechach,
- u Ascomycetes (workowców) z zygoty rozwija się wegetatywna dikariotyczna grzybnia, w której dikariotyczne jądra wędrują do strzępek workotwórczych, gdzie odbywa się kariogamia, a następnie podział redukcyjny i utworzenie worka z haploidalnymi zarodnikami (askosporami) o nowych cechach.




WARUNKI ROZWOJU:
- pozbawione zdolności do fotosyntezy i wykazują chemoorganotroficzny sposób odżywiania (energię czerpią z rozkładu zw.organ., które są dla nich jednocześnie źródłem węgla - rozłożone zw.organ. w postaci płynnej, przedostają się przez ść.kom. na drodze dyfuzji, a następnie w wyniku aktywnego transportu przez błonę cytoplazmatyczną są dostarczane do kom.),
- jeśli związki węgla występ.w formie polimerów (np.skrobia, celuloza), to są wcześniej hydrolizowane przez zewnątrzkom.enzymy do związków prostszych,
- azot przyswajają z azotanów czy soli amonowych; jeśli źródłem azotu są białka lub peptydy, to są one wcześniej rozkładane przez zewnątrzkom. Proteazy do formy przyswajalnej,
- w podłożu wzrostowym mogą być obecne takie pierwiastki jak: fosfor, potas, magnez, wapń, siarka, miedź, mangan, sód, cynk,
- grzyby strzępkowe są organizmami tlenowymi, co objawia się powierzchniowym wzrostem na podłożach,
- istnieją jednak gatunku grzybów (np. F. oksysporum, M. rouxii) które rosną również w warunkach beztlenowych,
- zahamowanie wzrostu niektórych gatunków grzybów (Penicillum, Aspergillus) jest możliwe przy obniżeniu wartości tlenu,
- większość pleśni, jako typowe organizmy mezofilne, rozwija się w temp. 20-35 stopni Celsjusza,
- największą odporność na temp. Wykazują chlamydospory, jako postać przetrwalna, oraz spory niektórych pleśni,
- wartość graniczna wody w podłożu, poniżej której ich wzrost jest hamowany, wynosi 11-14%,
- wilgotność względna powietrze (WWP - 70%) pobudza spory pleśni do kiełkowania i rozrastania się w postaci grzybni,
- grzyby strzępkowe najlepiej rosną w pH o przedziale 5-6 (wart.graniczna - 3,5),
- grzyby saprofityczne - główny czynnik biologiczny w rozkładzie materii,
- MIKORYZA - współdziałanie grzybów i korzeni; grzyb rozkłada mat.organ. do formy przyswajanej przez roślinę, a w zamian za to korzenie dostarczają aminokwasów, węglowodanów i innych subst.organ.,
- działalność grzybów strzępkowych w życiu człowieka:
a) powstawanie pleśni na prod.spożywczych,
b) udział w procesach BIODETERIORACJI (różne materiały - papier, skóra, tkaniny bawełniane, są miejscem rozwoju grzybów. Korozja wzbudzona przez mikroorganizmy prowadzi do niszczenia tych materiałów),
c) występowanie grzybów w pomieszczeniach mieszkalnych czy użyteczności publicznej (zagrożenia zdrowotne - nasilające się alergie, osłabienie uk.odpornościowego),
d) producenci wielu enzymów i kw.organicznych (zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym, włókienniczym, prod.antybiotyków),
e) znajdują zastosowanie w procesach oczyszczania wód,
f) usuwają z gleby różnego rodzaju ksenobiotyki.

Mikotoksyny - produkty przemian metabolicznych grzybów strzępkowych, są substancjami szkodliwymi zarówno dla ludzi, zwierząt jak i roślin

Więcej !!!!!!!!!

---