SPRAWOZDANIE 1

Temat: Metodyka badań mikrobiologicznych.
Cel: Zapoznanie z metodyką badań mikrobiologicznych. Wykonanie posiewów powierzchniowego i głębinowego oraz na skos agarowy.

Sposób wykonania:

Jako materiał zaszczepiający podłoża hodowlane zastosowano próbki z bakteriami. Przygotowano 5 kolbek zawiera­jących po 9 ml jałowej wody buforowanej. Do pierwszej kolbki dodano jałową pipetą 1 ml próbki i dokładnie wymieszano. 1 ml tak przygotowanego rozcieńczenia odpowiada objęto­ści 0,1 ml badanej próbki (rozcieńczenie 10^-1). Ko­lejne rozcieńczenie (10^-2) zawierajęce w każdym 1 ml 0,01 ml wyjściowej próbki uzyskano, przenosząc 1 ml rozcieńczenia 10^-1 do następnej kolbki zawierającej 9 ml wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenia (10^-3, 10^-4 itd.) wykonano w sposób ana­logiczny zwracając szczególne uwagę na dokładne miesza­nie i zmianę pipet dla każdego rozcieńczenia.

W rutynowych ba­daniach wody rozcieńczenia próbek wykonuje się zachowując stosu­nek próbki wyjściowej do wody rozcieńczającej jak 1:9. Przy prawidłowo wykonanych rozcieńczonych, po okresie inku­bacji powinny wystąpić 10 -krotne różnice w liczebności bakterii wyrosłych przy posiewie materiału z kolejnych rozcieńczeń.

Wykonywanie posiewów

Posiewy bakteriologiczne wykonano się za pomocą oczek bakteriologicznych i pipet z podziałką o objętości od 0,1 do 10,0 cm³. Pod­czas posiewów wyloty probówek oraz igły i oczka bakteriologiczne służące do przenoszenia materiału opalano w płomie­niu palnika w celu zachowania jałowości.

Posiewy na podłoża płynne wykonano zanurzając pod powierzchnię cieczy oczko lub pipetę z materiałem zaszczepiającym. Posiewy na podłoża stałe wykonano na 2 spo­soby: metodą powierzchniową i głębinową.

W metodzie powierzchniowej posiewu równomiernie rozpro­wadzono materiał zaszczepiający na powierzchni zestalonej pożywki w płytce Petriego oraz w probówce na tzw. skos agarowy. Materiał zaszczepiający naniesiono na pożywkę jałową pipetą w ilości 0,1 ml, rozprowadzając go po powierzchni podłoża jałową głaszczką. Posiewy na agarze skośnym wykonano oczkiem bakteriologicznym, robiąc rysę na po­wierzchni podłoża.

W metodzie głębinowej posiewu, na dno jałowych płytek Pe­triego wlano pipetą 1 ml materiału zaszczepiającego i zalano ostudzoną pożywką stałą. Pożywkę wylano się z kolbek wprost na posiany materiał. Wieczko płytki podczas posiewu i zalewania agarem uchylano możliwie najmniej. W celu równomiernego rozprowadzenia zawiesiny bakteryjnej w pożywce, zawar­tość płytki dokładnie wymieszano. Pożywka powinna być rozprowadzana po dnie płytki równe, cienką warstwą. Po zestaleniu podłoża płytki odwraca się do góry dnem i wstawia do termostatu (odwracanie płytek jest konieczne ze względu na wydzielanie przez agar wody kondensacyjnej, która w przeciwnym wypadku osiadałaby na powierzchni podłoża, powodując rozlewanie wyrosłych kolonii).

Wyniki:

Rodzaj posiewu Rozcieńczenie	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5
P. powierzchniowy	n.pol.	n.pol.	293	64	4
P. głębinowy	n.pol.	n.pol.	631	59	11

Obliczenia:

Wszystkie obliczenia wykonano zgodnie z poniższymi wzorami:
Posiew powierzchniowy:

p

Posiew głębinowy:

Xg

Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli.

Rodzaj posiewu Rozcieńczenie	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5
P. powierzchniowy	n.pol.	n.pol.	2,93*10^6	6,4*10^6	4*10^6
P. głębinowy	n.pol.	n.pol.	6,31*10^5	5,9*10^5	1,1*10^6

Wyniki ostateczne:
Posiew powierzchniowy:

Posiew głębinowy:

Na posiewach powierzchniowym i głębinowym zaobserwowano kolonie bakterii w kolorach od białego przez żółty do czerwonego. W związku z tym nie możliwe było dokładne policzenie ilości wyrosłych bakterii w rozcieńczeniach 10^-1 i 10^-2. Wyhodowane bakterie wzrosły w sposób płaski lub lekko wzniesiony. Na posiewach 10^-3 wyrosłe bakterie miały mniejsze wielkości od tych wyrosłych na posiewach 10^-5, co spowodowane było mniejszym obszarem, na którym jedna bakteria mogła się rozwijać i rosnąć.

W przypadku posiewu na podłoże płynne i skos agarowy stwierdzono obecność bakterii w obu przypadkach. Dla pierwszego przypadku zaobserwowano zmętnienie wcześniej klarownego roztworu. Dla drugiego przypadku zaobserwowano widoczne gołym okiem liczne kolonie bakterii, ułożone zgodnie z kierunkiem prowadzenia oczka bakteriologicznego po powierzchni podłoża.

WNIOSKI:

Niedokładność obliczeń spowodował rozwój bakterii, które łącząc się w kolonie nie były możliwe do policzenia. Łączenie się bakterii w kolonie spowodowane było złym posiewaniem. Posiewane bakterie nie były należycie rozprowadzone po podłożu, co spowodowało ich wzrost w jednym miejscu. Uniemożliwiło to ich dokładne policzenie na wszystkich próbkach.
Obliczona liczba pierwotnych bakterii w obu posiewach różni się o rząd wielkości. Świadczy to o tym iż posiewy mogły zostać wykonane nieprawidłowo. Różnice mogły być spowodowane w błędach związanych z obliczeniem ilości kolonii na płytkach. Wpływ na wynik mogły mieć również różnice w składzie pożywki oraz zanieczyszczenia, które mogły pojawić się na próbce z powietrza.

Warszawa 12.11.2012

- 3 -

---