Metabolizm drobnoustrojów.

1. Źródła węgla, azotu, siarki i fosforu dla bakterii.

2. Prototrofy, auksotrofy, czynniki wzrostowe.

3. Rozkład białek i aminokwasów.

4. Rozkład wielocukrów (skrobi i celulozy).

5. Szereg cukrowy.

6. Różnice pomiędzy oddychaniem tlenowym, beztlenowym i fermentacją.

7. Działanie i wykrywanie dehydrogenaz.

8. Działanie i wykrywanie katalazy.

Podział bakterii:

-ze względu na źródła energii- fototrofy- wykorzystują energię świetlną (fotosyntezę), chemotrofy- wykorzystują energię chemiczną (chemosyntezę),

-ze względu na źródło protonów i elektronów- litotrofy- wykorzystujące związki nieorganiczne; organotrofy- wykorzystujące związki organiczne,

-podział ze względu na źródła C- autotrofy- źródłem węgla jest tu CO₂, heterotrofy- źródłem węgla są dla nich związki organiczne

fotolitoautotrofy- źródłem energii jest dla nich proces fotosyntezy, związki organiczne są dla nich źródłem protonów i elektronów, źródłem C jest dla nich CO₂; dla sinic źródłem protonów i elektronów jest H₂O, dla bakterii źródłem protonów i elektronów jest związek nieorganiczny (S, H, tiosiarczan, Fe).

chemolitoautotrofy- źródłem energii jest dla nich proces chemosyntezy (tylko bakterie), źródłem C jest dla nich CO_2. Dzieli się je na: rozkładające H₂- wodorowe, S₂-siarkowe, Fe²⁺ Fe³⁺- żelazowe, amoniak i azotyny rozkładane są do azotynów- bakterie nitryfikacyjne, bakterie rozkładają również siarczki.

Chemoorganoheterotrofy- są to głównie bakterie chorobotwórcze, źródłem C, źródłem protonów i elektronów oraz źródłem energii może być dla nich ten sam związek- związek organiczny (np. monosacharydy).

Chemolitoheterotrofy- źródłem energii, protonów, elektronów i węgla są dla nich związki nieorganiczne (np. bakterie nitryfikacyjne). Pobierają energię z utleniania tiosiarczanów- związków nieorganicznych, źródłem C jest dla nich np. metyloamina, mogą one również wykorzystywać związki organiczne.

Chemosynteza- przyswajanie tlenku węgla z atmosfery bez udziału światła, ale dzięki energii chemicznej z utleniania prostych związków nieorganicznych (np. wodór, siarkowodór, amoniak, meran), proces ten przeprowadzają chemoautotrofy.

Metabolizm to ogół zmian chemicznych zachodzących w komórce, katalizowanych przez enzymy. Obejmuje on:

-katabolizm- to reakcje chemiczne prowadzące do rozkładu związków nieorganicznych oraz organicznych, dostarczające energii oraz prekursorów do procesów biosyntezy

-anabolizm- to reakcje syntezy biologicznej z wytworzeniem substancji prostych (cukry proste, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, zasady purynowe i pirymidynowe) oraz związków złożonych (wielocukry, białka, kwasy nukleinowe, lipidy)

-amfibolizm- to szlaki metaboliczne, w zależności od zapotrzebowania komórki zachodzą w nich procesy dysymilacyjne, dostarczające energii lub produktów pośrednich, bezpośrednio włączanych w drogi anaboliczne (np. szlak glikolizy, cykl pentozowy, cykl kwasów trój karboksylowych- Krebsa).

Drobnoustroje korzystają z jednego lub dwóch źródeł energii: energii słonecznej - promienistej, lub energii chemicznej. Pierwsze źródło potrzebne jest bakteriom fototsyntezującym oraz sinicom, które zaliczamy do fototrofów. Energia chemiczna uwalniana w procesach utleniania związków wysokoenergetycznych wykorzystywana jest przez pozostałe drobnoustroje. Energia pobierana przez drobnoustroje gromadzona jest w związkach fosforowych, np. adenozyno trójfosforan- ATP. Wyróżniamy cztery typy reakcji chemicznych w których powstaje ATP:

-fosforylacja na poziomie substratu,

-dehydratacja 2-fosfoglicerynianu

-fosforoliza wiązań C-S, C-C, C-N

-fosforylacja sprzężona z transportem elektronów w łańcuchu przenoszącym- fosforylacja oksydacyjna w łańcuchu oddechowym, fosforylacja podczas fotosyntezy.

Część bakterii wykorzystuje dwutlenek węgla (autotrofy), który jest redukowany do związków organicznych. Donatorami elektronów i protonów w tych procesach są związki nieorganiczne (litotrofy), lub organiczne (organotrofy). Heterotrofy to bakterie niezdolne do wykorzystywania utlenionych źródeł węgla, korzystające natomiast z jego form organicznych. Wśród nich wyróżniamy prototrofy i auksotrofy. Najłatwiej przyswajalnym źródłem C są cukry proste (monocukry).

Źródła węgla dla bakterii

Źródłami węgla i energii są dla bakterii głównie cukrowce (węglowodany), lipidy, białka- dla bakterii wytwarzających proteazy, czynnik zjadliwości. i inne związki chemiczne. Drobnoustroje mogą przyswajać węgiel i energię w sposób niekonwencjonalny, np. dzięki węglowodorom i ich pochodnym. O wykorzystywaniu źródeł węgla przez drobnoustroje decydują: dostępność warunkowana możliwością wprowadzenia danego związku do cytoplazmy, zdolność jego przetworzenia w procesach metabolicznych oraz wydajność energetyczna- ilość energii chemicznej jaką mikroorganizm może uzyskać po jego utlenieniu. Najwydajniejsze są tu tłuszcze i węglowodany. W komórkach drobnoustrojów zachodzić może oddychanie endogenne- utlenianie składników wewnątrzkomórkowych, strukturalnych oraz zapasowych. Umożliwia to przeżycie komórek w złych warunkach, nawet w warunkach głodowych.

Węglowodory- alifatyczne i aromatyczne

Źródła azotu dla bakterii

Drobnoustroje mogą wykorzystywać następujące formy azotu: cząsteczkowy (atmosferyczny), mineralny (jony NH⁺₄, NO^-₃, NO^-₂) azot z prostych i złożonych związków organicznych.

Azot atmosferyczny

Stanowi on 78% składu powietrza. Ta forma azotu nie jest dostępna dla większości drobnoustrojów. Ten typ azotu wiązać mogą bakterie występujące w środowisku naturalnym np. bakterie fotosyntezujące, tlenowce z rodzaju Azotobacter, mikroaerofile z rodzaju Achromobacter, beztlenowce z rodzaju Clostridium, bakterie brodawkowe z rodzaju Rhizobium żyjące w symbiozie z korzeniami roślin oraz sinice. Azot w związkach organicznych występuje w postaci grup NH₂ lub NH, więc bakterie by móc z niego skorzystać muszą go zredukować. Wymaga to wiele energii z powodu silnych wiązań pomiędzy atomami azotu. Asymilację azotu zapewnia układ enzymatyczny (dehydrogenaza pirogronianowa, nitrogeneza oraz ferrodoksyna). Donatorem protonów i elektronów do procesu redukcji jest pirogronian. Na związanie 1 mola N₂ potrzeba około 20 moli ATP.

Azot mineralny

Zdolność tę wykazuje wiele drobnoustrojów. Łatwiej przyswajalne są sole amonowe niż azotany które przed wbudowaniem w związki organiczne muszą być zredukowane do NH⁺₄. Azotyny są niezwykle toksyczne są one więc źródłem azotu jedynie dla nielicznej grupy drobnoustrojów.

Źródła siarki dla bakterii

Oddychanie siarczanowe to dysymilacyjna redukcja siarczanów. Substratami oddechowymi są tu związki organiczne, akceptorami zaś siarczany w oddychaniu siarczanowym. Bakterie zdolne do oddychania siarczanowego to Desulfovibrio sp. oraz Desulfotomaculum sp. Do związków siarki wykorzystywanych przez bakterie należą: S, SO^2-₃, S₂O^2-₃, S₄O^2-₆ które utleniane są do SO^2-_4. Utleniane mogą również być SCN^-, CS_2,, (CH₃)₂S.

Źródła fosforu i innych makro mikroelementów dla bakterii

Obok pierwiastków biogennych (C, N, O, H) drobnoustroje do prawidłowego wzrostu potrzebują makro i mikroelementów. Są one pobierane ze środowiska jako sole mineralne. Do makroelementów zaliczamy fosfor, siarkę, magnez, wapń, żelazo i sód, do mikroelementów zaś mangan (Mn), miedź (Cu), kobalt (Co), molibden (Mo) i cynk (Zn). Jako źródło fosforu drobnoustroje wykorzystują jony fosforanowe, które są wykorzystywane są do syntezy fosfolipidów i kwasów nukleinowych jak również podczas przetwarzania i magazynowania energii. Jony PO^-3₄ są łatwo przyswajalne, ich stężenie w środowisku może mieć zasadniczy wpływ na metabolizm komórki. Potas i sód utrzymują właściwy potencjał elektrochemiczny i ciśnienie osmotyczne w komórce. Jony magnezu są stabilizatorem ściany komórkowej, występują też w bakterichlorofilu oraz w niektórych enzymach. Wapń pobierany najczęściej jako wolny kation stabilizuje enzymy. Jego obecność w jest niekiedy wymagana ponieważ warunkuje on np. aktywność zewnątrzkomórkowych hemolizyn. Żelazo, składnik cytochromów, ferrodoksyn i niektórych toksyn bakteryjnych jest pobierane ze środowiska z dużym trudem. Drobnoustroje chorobotwórcze muszą pobierać żelazo w trakcie zakażenia, w makroorganizmie żelazo nie występuje jednak w dużych ilościach. Jego pobieranie warunkują przenośniki- siderofory.

Prototrofy

Są to bakterie zdolne do wzrostu na podłożach zawierających jeden prosty związek organiczny oraz zestaw soli mineralnych. Jest to grupa bakterii niezwykle pospolitych w środowisku naturalnym, ubogim w składniki odżywcze. Rzadko występują one wśród drobnoustrojów chorobotwórczych. Przykładem jest tu E.coli.

Auksotrofy

Są to bakterie wymagające do wzrostu podłoży o bardziej złożonym, bogatszym składzie substancji odżywczych. Niektóre z nich dobrze rozwijają się na podłożach zawierających oprócz prostego związku organicznego (źródło węgla i energii) co najmniej jeszcze jeden związek a mianowicie czynnik wzrostowy (aminokwas, witaminę, zasadę azotową) którego drobnoustroje nie są w stanie same wytworzyć. Bakterie mlekowe i gonokoki posiadają niezwykle złożone wymagania pokarmowe. Biorąc pod uwagę rodzaje akceptorów elektronów i protonów w procesach dysymilacji (rozkład złożonych związków na proste z wytworzeniem energii), drobnoustroje dzielimy na zdolne do:

-fermentacji- utleniania biologicznego, ostatecznym akceptorem protonów i elektronów są tu związki organiczne,

-oddychania tlenowego- końcowym akceptorem protonów i elektronów jest tlen,

-oddychania beztlenowego- związki nieorganiczne (azotany, siarczany) stanowią tu ostateczny akceptor H⁺ i elektronów.

Heterotrofy- organizmy cudzożywne.

Czynniki wzrostowe

Oprócz podstawowych źródeł węgla, energii, azotu, a także makro i mikroelementów bakteriom potrzebne są również czynniki wzrostowe. Są to związki organiczne których komórka nie jest w stanie syntezować za pomocą posiadanych enzymów. Do związków tych zaliczamy witaminy, aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe, długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, sterole (organiczne związki chemiczne, alkohole steroidowe). Drobnoustroje nie zdolne do wzrostu bez tych związków nazywane są auksotrofami. Wyróżniamy dwie grupy takich drobnoustrojów: naturalne- np. bakterie mlekowe nie rosnące na podłożach minimalnych, oraz sztucznie indukowane, selekcjonowane, a następnie hodowane na odpowiednich podłożach mutanty auksotroficzne. Mutanty te są bardzo pomocne w badaniach zapotrzebowania bakterii na substancje odżywcze drobnoustrojów. Czynniki wzrostowe są miedzy innymi składnikami koenzymów, kwasów nukleinowych, są również niezbędne w procesach biosyntezy.

Rozkład białek ; Rozkład aminokwasów

Bakterie posiadają właściwości proteolityczne, czyli wykazują zdolność do hydrolizy białek, a następnie rozkładu aminokwasów. Enzymy odpowiedzialne za ten proces to proteazy (enzymy proteolityczne α (enzymy endogenne) i β (enzymy egzogenne) protezy. Rozszczepiają one wiązanie peptydowe pomiędzy resztami aminokwasów i są syntetyzowane np. przez bakterie z rodzaju Proteus, Bacillus, Clostridium, a także niektóre grzyby. Proteazy nie wykazują swoistości substratowej, są więc zdolne hydrolizować różne białka. Wśród tych enzymów wyróżniamy endopeptydazy (hydrolizuja wiązania znajdujące się wewnątrz łańcucha) hydrolizujące białko z wytworzeniem poli- i oligopeptydów oraz egzopeptydazy (hydrolizują one wiązania boczne) odszczepiające pojedyncze aminokwasy, włączane bezpośrednio do biosyntezy białek lub rozkładane w reakcjach deaminacji, dekarboksylacji, lub transaminacji. Deaminacja to odłączenie od aminokwasu grupy NH₂. Wyróżniamy deaminację oksydacyjną, redukcyjną, desaturacyjną, hydrolityczną oraz typu Sticklanda. Deaminacja oksydacyjna to np. rozkład kwasu glutaminowego oraz fenyloalaniny. Deaminacja redukcyjna to przemiana polegająca na przekształceniu aminokwasu do kwasu nasyconego. Deaminacja desaturacyjna to rozkład aminokwasu z wytworzeniem kwasu organicznego nienasyconego. Kwas asparginowy przekształcany jest na tej drodze do kwasu fumarowego. Deaminacja hydrolityczna to np. rozkład mocznika - przez bakterie wytwarzające enzym ureazę. Reakcja Sticklanda to reakcja red-oks, jej przykładami są rozkład alaniny i glicyny do kwasu octowego, amoniaku i CO₂ oraz alaniny i proliny do kwasu δ-aminowalerianowego, kwasu octowego, CO₂ i NH₃. Procesy te zachodzą w warunkach beztlenowych, są charakterystyczne dla Clostridium. Przekształcanie aminokwasów zachodzące również w warunkach beztlenowych to dekarboksylacja prowadząca do wytworzenia amin biogennych oraz CO₂. Dekarboksylacja może mieć charakter pierwotny lub wtórny, kiedy zachodzi po uprzednim przekształceniu aminokwasu. W wyniku dekarboksylacji z aminokwasów obojętnych powstają monoaminy pierwszorzędowe, przykładami takich reakcji są rozkład histydyny do histaminy, fenyloalaniny do fenyloetyloaminy, tryptofanu do serotoniny, seryny do etanoloaminy. Dekarboksylację aminokwasów kwaśnych katalizują dwie karboksylazy- jedna działa na grupę karboksylową położoną w sąsiedztwie grupy aminowej, druga zaś na końcową grupę COOH. Aminokwasy mogą podlegać transami nacji. Niektóre drobnoustroje mogą przekształcać aminokwasy zarówno na drodze deaminacji jak i dekarboksylacji. Należą do nich E.coli przetwarzające tryptofan do skatolu i indolu oraz inne przetwarzające tyrozyną do p-krezolu i fenolu. Drobnoustroje mogą również wykorzystywać aminokwasy siarkowe. Te które mają enzym sulfhydrazę mogą również z tych aminokwasów odłączać H₂S.

Rozkład wielocukrów (skrobi i celulozy)

Drobnoustroje mogą wykorzystywać zarówno cukry złożone jak i disacharydy, czy cukry proste. Pierwsze degradowane są na zewnątrz komórki za pomocą enzymów hydrolitycznych do cukrów prostych ze względu na dużą masę cząsteczkową. Najpopularniejszymi węglowodanami wykorzystywanymi przez bakterie są: skrobia, celuloza i glikogen.

Skrobia składa się z dwóch polimerów amylozy i amylopektyny. Degradowana jest ona za pomocą następujących enzymów: α-amylaza, β-amylaza, amylo-1,6-glukozydaza, oraz glukoamylaza. Skrobię wykorzystują przede wszystkim grzyby, Bacillus, Clostridium, niektóre Saccharomyces-drożdże.

Celuloza to polimer glukozy, połączonej wiązaniami β1,4, jest rozkładana przez drobnoustroje wytwarzające enzymy celulolityczne (endo- egzoglukanaza, celobiohydrolaza, oraz celobioza- β-glikozydaza). Wśród drobnoustrojów celulolitycznych wymienić należy grzyby, oraz Celvibrio, Celulomonas, oraz Clostridium.

We wszystkich trzech typach metabolizmu szlaki rozkładu cukrów prostych są:

-glikoliza (szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa EMP),

-cykl pentozowy (szlak heksozomonofosforanowy HMP),

-szlak Entnera-Doudoroffa (ED)

Glikoliza w której na drodze fosforylacji substratowej powstają 2 ATP oraz 2 NADH+H⁺, prowadzi do wytworzenia z jednej reszty glukozy dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego. Jego dalsze przemiany zachodzą inaczej u bakterii tlenowych inaczej u beztlenowych.

Cykl pentozowy spełnia dwie funkcje: jest to szlak dysymilacyjny pozwalający na spalenie glukozy z wytworzeniem 12 moli NADPH+H⁺ co dopowiada 36 cząsteczkom ATP. Jest to szlak amfiboliczny, dostarczający reszty NADPH+H⁺ które podobnie jak metabolity pośrednie potrzebnie są do biosyntezy polisacharydów, nukleotydów, oraz aminokwasów aromatycznych.

Szlak Entnera-Doudoroffa funkcjonuje u: Pseudomonas, Acetobacter, Xantomonas, Gluconobacter. Może on dostarczyć pośredników do biosyntezy nukleotydów, może on spełniać funkcję procesów prowadzących do degradacji glukozy z niewielkim zyskiem energetycznym (powstaje po 1 molu NADPH+H⁺, oraz NADH+H⁺).

Oddychanie tlenowe

Tlenowce (aeroby, oksybionty) to bakterie wykorzystujące tlen jako ostateczny akceptor elektronów i protonów w reakcjach utleniania biologicznego. Ze względu na rodzaj związków chemicznych stanowiących dla nich źródła energii oraz donatory elektronów i protonów drobnoustroje dzielimy na chemoorganotrofy-związki organiczne oraz chemolitotrofy- związki nieorganiczne.

Chemoorganotrofy

Szlaki metaboliczne cukrów przebiegają z wytworzeniem aldehydu 3-fosfoglicerynowego, który może być utleniony do kwasu pirogronowego. W warunkach tlenowych kwas pirogronowy przekształcany jest w acetylo-koenzym A, który wchodzi w skład cyklu Krebsa (cykl kwasów trój karboksylowych). Reakcje tego cyklu obejmują utlenianie przez odwodorowanie oraz dekarboksylację. Ostatecznymi produktami tego cyklu są: woda i dwutlenek węgla, oraz NADH+H⁺ i FADH+H⁺ . Ich reoksydacja zachodzi w łańcuchu tlenowym, gdzie ostatecznym akceptorem protonów i elektronów jest tlen. Transport elektronów i protonów w tym łańcuchu jest procesem wieloetapowym, warunkują go przenośniki: flawoproteidy (dehydrogenazy- NADH i bursztynianowi z FAD), ubichinon, cytochromy (oksydaza cytochromowa) przenoszące elektrony na akceptor. Sprzęganie przenoszenia elektronów z syntezą ATP nazywane jest fosforylacją oksydacyjną. Bilans utlenienia glukozy w cyklu Krebsa jest wysoki i wynosi 38 cząsteczek ATP. W cyklu pentozowym- 36 cząsteczek, a w szlaku Entnera-Doudoroffa 25 mili ATP.

Chemolitotrofy

Zaliczamy do ich bakterie zdobywające energię poprzez utlenienie prostych związków nieorganicznych, które są również donatorami elektronów i protonów do redukcji NAD⁺ lub NADP⁺ podczas biosyntezy. Nie występuje u nich cykl Krebsa, chociaż wykorzystują one tlen jako końcowy akceptor wodoru w procesach oddychania. Wyróżniamy wśród nich auto i heterotrofy oraz drobnoustroje które w zależności od środowiska wykorzystują utlenione bądź zredukowane związki węgla. Wyróżniamy tu bakterie utleniające amoniak, azotany (bakterie nitryfikacyjne), bakterie utleniające nieorganiczne związki siarki (bakterie siarkowe), bakterie wodorowe i żelazowe oraz bakterie utleniające CO do CO₂. Pełnią one ważną funkcję podczas obiegu pierwiastków w przyrodzie.

Oddychanie beztlenowe

Końcowym akceptorem elektronów i protonów jest tu związek nieorganiczny. Najlepiej poznane są: oddychanie siarczanowe (dysymilacyjna redukcja siarczanów), oraz oddychanie azotanowe (redukcja azotanów do amoniaku- amonifikacja, lub azotu- denitryfikacja). Substratami oddechowymi są tu związki organiczne, akceptorami zaś azotany, azotyny, lub hydroksyloamina w oddychaniu azotowym, oraz siarczany w oddychaniu siarczanowym. Bakterie zdolne do oddychania azotowego to: E.coli, A.aerogenes, Pseudominas sp. oraz Micrococcus sp. Bakterie zdolne do oddychania siarczanowego to z kolei Desulfovibrio sp. oraz Desulfotomaculum sp.

Fermentacja

Jest to proces utleniania biologicznego, w którym ostatecznym akceptorem elektronów i protonów jest związek organiczny. Proces ten zachodzi w warunkach beztlenowych (chociaż może mieć miejsce w warunkach tlenowych). W większości przypadków przebiega według szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa. Powstały w trakcie tej drogi NADH+H⁺ jest utleniany do NAD⁺ w procesie fermentacji. Nazwa fermentacja wzięła się od nazwy końcowego akceptora H⁺. Wyróżniamy dwa typy fermentacji:

-homofermentację,

-heterofermentację.

Powstają w nich odpowiednio jeden lub kilka produktów końcowych. Przykładem homofermentacji jest fermentacja alkoholowa (etanolowa) prowadzony przez Saccharomyces cerevisiae, oraz fermentacja mlekowa prowadzona przez Lactococcus lactis. Oba te procesy przebiegają z wykorzystaniem glikolizy. Znane są również bakterie mlekowe prowadzące heterofermentację z wytworzeniem produktu głównego- kwasu mlekowego oraz np. kwasu octowego czy etanolu. Bakterie heterofermentacji mlekowej wykorzystują EMP oraz HMP. Glukoza jest tu substratem do fermentacji. Galaktoza wchodząca w skład laktozy jest przekształcana w glukozo-1-fosforan w szlaku Leloira lub trioz w tzw. szlaku tagatozofosforanowym (nazwa pochodzi od cukru). Przykładem hetero fermentacji jest również „fermentacja Enterobacteriaceae”, wykrywanie jej jest jednym z procesów diagnostyki biochemicznej tych bakterii. Fermentacja nie jest tak wydajna pod względem energetycznym jak cykl Krebsa i towarzysząca mu fosforylacja na poziomie łańcucha oddechowego. Wydajność fermentacji to:

-homofermentacja mlekowa (szlak EMP)- 2 mole ATP w przeliczeniu na 1 mil substratu,

-fermentacja alkoholowa (EMP-drożdże)- 2 mole ATP; ED-1 (bakterie Zymomonas mobilis).

Działanie i wykrywanie dehydrogenaz

Dehydrogenaza jest to białkowy enzym który katalizuje wiele reakcji w organizmie (odwodornienie, redoks, przeniesienie elektronów). Enzymy katalizujące utlenianie substratu w procesach oddechowych nazywamy dehydrogenazami. Odłączają one od substratu naraz po dwa elektrony, a łącznie z nimi dwa protony. Są to enzymy wysoce specyficzne. Istnieją odrębne dehydrogenazy dla glukozy, glukozo fosforanu, kwasu bursztynowego itd. Dla każdego utlenionego substratu w komórce istnieje właściwa dla niego dehydrogenaza. Odrywa ona protony i elektrony od substratu musi przyłączyć je dawcy, ponieważ wkrótce w komórce byłyby tylko zredukowane formy dehydrogenaz, niezdolne już do utleniania substratu. Nieliczne dehydrogenazy (oksydazy) oddają oderwane od substratu elektrony i protony wprost na tlen atmosferyczny, powstaje tu również woda utleniona. Większość dehydrogenaz oddaje elektrony nie bezpośrednio na tlen, ale pośrednim przenośnikom protonów i elektronów, przy czym końcowym produktem jest tu woda. Właściwym skutkiem utlenienia jest powstanie wody. Oddychanie tlenowe jest procesem utleniania wodoru. Utlenianie wodoru do wody w procesach biologicznych wyzwala tyle energii ile wytwarza się przy jego bezpośrednim spalaniu. Nagłe wyzwolenie takiej ilości energii mogłoby zniszczyć strukturę komórki. Bakterie wyzwalają energię w mniejszych porcjach, dających się zmagazynować lub użyć w endoergicznych procesach komórkowych.

Działanie i wykrywanie katalazy

Enzym z grupy oksydoreduktaz.

Właściwości proteolityczne i amylolityczne drobnoustrojów

Proteoliza to rozkład cząsteczki białka za pomocą odpowiedniego enzymu.

Amyloliza to rozkład skrobi i innych węglowodanów na cukry proste.

Szereg cukrowy

Badanie zdolności drobnoustrojów do rozkładania węglowodanów wykonywane jest na tzw. szeregach cukrowych małych które zawierają kilka cukrów, oraz na dużych zawierających większą część cukrów używanych podczas badań. Mały szereg cukrowy składa się z: glukozy, laktozy, sacharozy, maltozy i mannitolu które w stężeniu 1% dodaje się do wody peptonowej zawierającej wskaźnik-indykator Andrade (fuksyna kwaśna) lub błękit bromotymolowy. Do probówek z podłożem i cukrami wkłada się dnem do góry małe probóweczki- rurki Durhama które służą do wykrywania gazu wytworzonego w trakcie wzrostu, i rozkładu substratów węglowodanowych (gaz zbiera się w rurce i jest widoczny w postaci pęcherzyków). Powstałe podczas rozkładu cukrów kwasy organiczne zmieniają pH środowiska co przejawia się w postaci zmiany barwy indykatora ze słomkowej na różową w przypadku wskaźnika Andrade oraz z niebieskiej na żółtą w obecności błękitu bromotymolowego. Dla poprawienia warunków wzrostu drobnoustrojów słabo rosnących na wodzie peptonowej wzbogaca się ją dodając 5% zinaktywowanej przez ogrzanie surowicy końskiej (podłoże Robesona dla maczugowców).

Rozkład alkoholi

Fermentację alkoholową przeprowadzają głównie grzyby, jak również niektóre grzyby z rodzaju Zymomonas. Drożdże wykorzystują do tego celu glikolizę, natomiast Zymomonas sp. wykorzystuje szlak Entnera-Doudoroffa. Powstający pirogronian jest przekształcany w aldehyd octowy z wykorzystaniem dekarboksylazy pirogronianowej. Aldehyd octowy stanowi akceptor elektronów i jest redukowany do etanolu przez dehydrogenazę alkoholową zależną od NAD.

Tłuszcze jako substraty oddechowe

Lipidy są składnikami błon komórkowych, oraz materiałem zapasowym. Są to estry glicerolu, i kwasów tłuszczowych hydrolizowane przez drobnoustroje wytwarzające enzymy- esterazy / lipazy. Enzymy te wydzielane są na zewnątrz drobnoustrojów, gdzie katalizują rozkład tłuszczów do glicerolu i kwasów tłuszczowych. Glicerol metabolizowany jest na drodze glikolizy, kwasy tłuszczowe zaś rozkładane są w procesie β-oksydacji. Produkty obu szlaków włączane są do cyklu Krebsa. Bakterie rozkładające tłuszcze to np. S.aureus, niektóre Bacillus sp., Clostridium sp., Pseudomonas sp., Geotrichum sp. Bakterie metanogenne mogą wykorzystywać jako akceptor elektronów CO₂ i węglany. Bakterie te to Archeabacteriae, wykorzystują one jako donator protonów wolny wodór i redukują CO₂ do metanu. Zysk energetyczny tego procesu jest duży i wynosi 1 mol ATP w przeliczeniu na 1 powstałą cząsteczkę metanu.

Fotosynteza

Fototrofy to mikroorganizmy, które wykorzystują fotosyntezę do uzyskiwania energii. Gdy jest ich dużo, mogą tworzyć skupiska o charakterystycznym zabarwieniu z powodu zawartego w nich chlorofilu i innych barwników. Zielone szumowiny w stawie czy zielone wstęgi przyczepione do kamieni w potoku, to najprawdopodobniej kombinacja glonów i sinic. Różowy nalot na piasku słonych bagien (ang. salt marsh) to purpurowe bakterie fototroficzne. Szczególnie piękny obraz fototrofów i istniejących między nimi zależności zobaczyć można robiąc przekrój właśnie przez piasek słonych bagien w strefie pływów w Great Sippiwisset (koło Woods Hole, Massachusetts), w miejscu znajdującym się między linią brzegową a początkiem terenu porośnię­tego roślinnością. W przekroju tym widać serię warstw o różnych kolo­rach. Są to skupiska drobnoustrojów połączonych polisacharydowym śluzem, który nadaje całości pewną zwartość, wsku­tek czego są one zwane matami mikroorganizmów (ang. microbial mats). Jeżeli złapie się koniec takiej maty, to można wyciągnąć z piasku mniejszy bądź większy kawałek tego tworu.

Maty mikroorganizmów tworzone przez fototrofy: następny przykład życia w gradiencie

Omówienie obiegu siarki, w którym bakterie fototroficzne mają swój udział, będzie dobrym początkiem rozdziału opisującego tę grupę drobnoustrojów. Jeśli dokładniej spojrzymy na matę mikroorganizmów pobraną ze słonego bagna w strefie pływów, to zobaczymy kilka barw­nych warstw leżących ponad warstwą koloru czarnego. Górna, zielona warstwa maty składa się z sinic i okrzemek. Przeprowadzają one fotosyntezę oksygenową, w której woda jest rozszczepiana do wodór (H₂) i tlenu (O₂). Tlen jest uwalniany, natomiast wodór jest wykorzystywany jako źródło elektronów. Jeżeli kawałek takiej maty zabierzemy do laboratorium, zanurzymy w akwarium i silnie naświetlimy, to kilku godzinach pojawią się pęcherzyki tlenu. Jest on wytwarzany prze mikroorganizmy znajdujące się w górnych warstwach maty. Fototrofy oksygenowe mają taki sam chlorofil jak rośliny zielone, i to z pewność z nich powstały roślinne chloroplasty.

Następna z barwnych warstw ma kolor różowy. Składa się ona z bakterii przeprowadzających fotosyntezę innego typu, w przebiegu której nie powstaje tlen (fotosynteza anoksygenowa). Zwane są one bakteriami purpurowymi z powodu obecności barwników różowopurpurowych Wykorzystują one siarczek jako źródło elektronów, co zostanie pokrótce opisane. Niekiedy w przekroju widać dwie warstwy bakterii purpurowych, ale dla uproszczenia będziemy je traktować tak, jakby stanowił jedną warstwę. Poniżej warstwy różowej widać drugą warstwę zieloną złożoną z innego typu fototrofów anoksygenowych — bakterii zielonych które również utleniają siarczki. Mikroorganizmy z warstwy różowe i niższej zielonej zawierają bakteriochlorofil. Chociaż spełnia on tę samą funkcję co chlorofil, a więc przekształca energię światła w energię chemiczną, ma nieco odmienne właściwości. Najniższa warstwa ma kok szaroczarny. Jest ona dziełem nie fototrofów, lecz bakterii redukujących siarczany, które wytwarzają siarczek, wykorzystywany przez anoksygenowe fototrofy z wyższych warstw. Część siarczku reaguje z żelazem tworząc szaroczarne osady, które nadają tej warstwie kolor. Dlaczego warstwy maty tworzą się w tak uporządkowany sposobi Dzieje się tak wskutek powstawania chemicznych gradientów w te części bagien: gradientu siarczanu (z wody morskiej, która dwa raz dziennie zalewa ten obszar), gradientu siarczku (wytwarzanego prze bakterie redukujące siarczany), gradientu tlenu (pochodzącego z atmos­fery i wytwarzanego przez fototrofy oksygenowe) i wreszcie gradientu światła słonecznego. Chlorofil fototrofów oksygenowych absorbuje światło o dłu­gości fali 500-550 nm, natomiast bakteriochlorofil — światło, które zostanie przefiltrowane przez mikroorganizmy z górnej warstwy (powyżej 800 nm). Bakteriochlorofil występujący w następnej warstwie bakterii zielonych, które też są fototrofami anoksygenowymi, absorbuje

światło o długości fali 550-580 nm. Purpurowe i zielone bakterie siar­kowe także wyszukują sobie optymalne miejsce w gradiencie siarczku i tlenu, przeprowadzając tam reakcję utleniania siarki i siarczku. Fototro­fy oksygenowe w górnej warstwie wytwarzają tlen w ciągu dnia, ale w czasie nocy są nieaktywne. W ciemności, fototrofy anoksygenowe stają się heterotrofami oddychającymi tlenowo (a więc zużywającymi tlen), co

powoduje, że niższe warstwy stają się beztlenowe. W ciągu dnia, z powodu ograniczonej dyfuzji tlenu, ten stan się utrzymuje, jest więc to idealne miejsce dla bakterii redukujących siarczany (czarna warstwa), które redukują siarczany z wody morskiej, uzyskując energię z siły protonomotoryczne.

W środowiskach słodkowodnych, gdzie stężenie siarczanu i siarczku jest małe, dominuje inny typ fototrofów anoksygenowych. Niegdyś nazywano je purpurowymi lub zielonymi fototrofami „niesiarkowymi", je aby odróżnić od purpurowych i zielonych fototrofów utleniających siarkę bądź siarczki. Wyniki nowszych badań wskazują, że wiele z tych „niesiarkowych" fototrofów w rzeczywistości utlenia związki siarki, ale przy niższych stężeniach niż fototrofy siarkowe. Dla uproszczenia, aby odróżnić obie grupy, będziemy używali dwóch terminów: bakterie purpurowe i zielone lub purpurowe i zielone fototrofy. Bakterie purpurowe można znaleźć w stawach i jeziorach, zaś zielone są szeroko rozpowszechnione i znaleziono je nawet w gorących źródłach alka­licznych.

Hodowanie fototrofów

Zanim zajmiemy się fizjologią bakterii fotosyntetyzujących, poznajmy pewne ich cechy. Kiedy naukowcy zaczynają badać jakiś mikroorganizm, próbują go najpierw wyhodować. Co należy zrobić, by wyhodować fototrofa? Oczywistą różnicą między fototrofami a innymi organizmami jest to, iż wymagają one źródła światła. Jednak fototrofy różnią się między sobą pewnymi cechami. Niektóre dobrze rosną na powierzchni płytek agarowych, inne zaś — we wnętrzu pożywki zestalonej agarem, z którego uprzednio usunięto wszystkie związki rozpuszczalne. Aby wyizolować mikroorganizmy drugiego typu, naukowcy mieszają pobra­ną ze środowiska próbkę z podłożem zawierającym upłynniony agar. Następnie agar krzepnie i tworzy zestalony słupek, w którym zawie­szone są drobnoustroje. Umieszcza się go w pobliżu źródła światła. Podłoże jest bardzo ubogie w składniki odżywcze, aby heterotrofy nie urosły szybciej od fototrofów, które rozwijają się powoli.

Jeżeli spodziewamy się w próbce fototrofów wymagających związ­ków siarki, na dnie probówki umieszczamy kroplę siarczku (po zmieszaniu podłoża agarowego z próbką), aby powstał jego gradient. Po około tygodniu, w agarze zaczynają się pojawiać różnobarwne kolonie: zielone, czerwone, żółte, różowe i brązowe. Te kolory świadczą o wytwarzaniu pigmentów. Niektóre z nich to chloro­file, będące składnikami aparatu fotosyntetyzującego. Inne absorbują światło ultrafioletowe, które mogłoby być szkodliwe dla komd Oznacza to, że barwniki te stanowią rodzaj ekranu przeciwsłoneczni dla organizmów wymagających światła, który chroni ich białka i Dl przed szkodliwym działaniem promieniowania krótkofalowego, występującego również w świetle słonecznym.

Izolowanie sinic, fototrofów oksygenowych, wymaga zastosowania innej strategii, w której wykorzystuje się zdolność tych bakterii do ruchu ślizgowego. Można po prostu wyhodować je na płytkach agarowych, istnieje pewien inny, sprytny sposób, aby je wywabić z próbki pobranej ze środowiska, wykorzystując ich tendencję do przemieszczania f w kierunku światła. Próbkę umie cza się w jednym miejscu płytki Petriego i tę część płytki zakrywa folią. Płytkę umieszcza się koło źródła światła. Po jednym lub dwóch dniach sinice będą migrowały z ciemnej strefy w kierunku świat Cyjanobakterie tworzące wielokomórkowe filamenty na tyle duże że widać je gołym okiem, można następnie złapać szczypczykami i przenieść do innej pożywki.

Fotosynteza anoksygenowa

Uważa się, że fotosynteza anoksygenowa jest bardziej prymitywną formą fotosyntezy, gdyż jest prostsza od procesu oksygenowego. Ponadto fototrofy anoksygenowe wymagają warunków beztlenowych, mogły się pojawić w okresie, zanim jeszcze sinice zaczęły wprowadzać tlen do atmosfery Ziemi. Argumentem przeciw tej uproszczonej ewolucyjnej jest to, że często te same fototrofy w ciemności wykorzystują tlen, rosnąc heterotroficznie. Niezależnie od ich pozycji ewolucyjnej od nich właśnie zaczniemy, gdyż system fotosyntetyzujący tych bakterii jest prostszy,

Purpurowe bakterie fotosyntetyzujące

Przykładem purpurowej niesiarkowej bakterii fotosyntetyzującej jest Rhodopseudomonas sphaeroides. Można go zwykle znaleźć w jeziorach i stawach o małej zawartości siarczku. Jest bakterią poddawaną intensywnym badaniom z powodu niezwykłej plastyczności metabolicznej. Przy dobrym oświetleniu i w warunkach beztlenowych R. sphaeroides rośnie syntetycznie. Wykorzystuje przy tym wodór jako źródło elektronów tlenek węgla (CO2) lub związki organiczne jako źródło węgla. W ciemności, w obecności tlenu, rośnie on heterotroficznie na związkach licznych, wykorzystując tlen jako akceptor elektronów. Tak więc bakteria ta może być fotoautotrofem bądź heterotrofem. Zarówno R. sphaeroides, jak i blisko z nim spokrewniony R. capsulatus, są ważnymi organizmami modelowymi do badania sposobu, w jaki bakterie mogą przestawiać się z jednej strategii metabolicznej na inną. Łatwiej będzie zrozumieć ten proces, zakładając, że składa się on z dwóch elementów: systemu transportu elektronów, i fotosystemu (zwanego centrum reakcji). System transportu elektronów pompuje protony przyczynia się do powstania PMF, która może zostać wykorzystana do fezy ATP. Fotosynteza przekształca energię światła w energię chemiczną, w formie wzbudzonego elektronu, który może zostać dostarczony do systemu transportu elektronów. W przypadku fototrofów purpurowych system transportu elektronów zwany jest kompleksem bc. Proces fotosyntezy zaczyna się w fotosystemie. Bakterie purpurowe zielone różnią się od fototrofów oksygenowych tym, że mają bakteriochlorofil, podczas gdy fototrofy oksygenowe posiadają ten sam rodzaj chlorofilu, co rośliny zielone. Funkcje obu chlorofili są takie same. Wykorzystując foton światła, dwie cząsteczki bakteriochlorofilu (zwa-70, gdyż absorbuje fotony o długości fali 870 nm), wzbudzają elektron do stanu bardziej elektroujemnego. To znaczy wartość E_o' elektronu zmienia się z około +0,4 wolta do około -0,8 wolta. Im bardziej ujemna jest wartość e_o', tym bardziej związek niosący ten elektron jest skłonny do redukowania innych związków. Gdy w cząsteczce bakteriochlorofilu pojawi się wzbudzony elektron, jest przenoszony poprzez kolejne związki na chinony zwane ubichinonami. Te chinony przemieszczają się z centrum zbierającego światło zawierającego cząsteczki chlorofilu i obudowujące go białka, do kompleksu bc, który pompuje protony na zewnątrz komórki. Elektrony mające w tym momencie znacznie bardziej dodatnią wartość e_o', są przenoszone na cytochrom c, który przesyła je z powrotem do fotosystemi Elektrony przepływają ze zredukowanego fosforany dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH) na końcowej akceptor elektronów (taki jak tlen), przepływ elektronów u bakterii purpurowych jest cykliczny. Donorem elektronów jest wzbudzony P*₈₇₀ a akceptorem niewzbudzony P ₈₇₀.

Bakterie przeprowadzające fotosyntezę tego typu mają jednak pewien problem. Ich systemy fotosyntetyzujące dostarczają energii w postaci PMF (dzięki której może powstać ATP), ale muszą też mieć jakiś sposób wytwarzania NADPH, który jest niezbędny w wielu komórkowych pro­cesach biosyntezy. NADPH powstaje tu z udziałem enzymu NADPH--ubichinon oksydoreduktazy, która przenosi elektrony i protony z ubichinonu na NADP⁺, z wytworzeniem NADPH. Tak więc, chociaż prze-1 ważą cykliczny przepływ elektronów, niektóre z nich wychodzą z obiegu j cyklicznego, by doszło do powstania NADPH. Te brakujące elektrony i muszą być oczywiście uzupełniane, co zachodzi z wykorzystaniem związków nieorganicznych (np. siarczków) lub organicznych.

Ponieważ wartość e_o' zredukowanego ubichinonu jest wyższa niż eo' NADP⁺, to reakcja redukcji wymaga dostarczenia energii, najprawdo­podobniej w postaci PMF. Tak więc część energii uzyskanej w czasie fotosyntezy jest wykorzystywana do syntezy NADPH. Bakterie zielone i fototrofy oksygenowe uzyskują NADPH bezpośrednio w czasie procesu fotosyntezy.

Bakterie zielone

Podobnie jak bakterie purpurowe, bakterie zielone wykorzystują bak­teriochlorofil do przekształcania energii światła w energię chemiczną w postaci elektronu o ujemnym e_o'. Jest on wykorzystywany do redukcji serii związków, z których ostatnim jest ferredoksyna, białko o e_o' na tyle ujemnym, że może zredukować NADP⁺ do NADPH bez wydatkowania energii. Alternatywnie, zredukowana ferredoksyna może prze­nieść elektrony na łańcuch transportu elektronów (chinony-cytochromy), w którym kompleks bc, podobny do tego u bakterii purpurowych, pom­puje protony i zawraca elektrony (już o dodatniej wartości eo') na nie-wzbudzoną cząsteczkę bakteriochłorofilu. Ponieważ przepływ elektro­nów może być albo cykliczny (powstaje PMF), albo niecykliczny (wytwa­rzany jest NADPH), elektrony muszą być uzupełniane z jakiegoś innego źródła, aby kompensować utratę tych, które zostały wykorzystane do syntezy NADPH.Elektrony te pochodzą z utleniania związków siarki albo związków organicznych.

Fotosynteza oksygenowa

Strategia fotosyntetyczna fototrofów oksygenowych (których przykła­dem są sinice) jest kombinacją strategii wykorzystywanych przez purpurowe i zielone fototrofy anoksygenowe, z tym że woda jest tu źródłem elektronów. Nie do końca jest jasne, w jaki sposób energia atla jest wykorzystywana do usunięcia wodoru z wody, aby mógł on ;się źródłem elektronów o bardziej ujemnej wartości e_o'. Ta część procesu fotosyntezy zachodzi w fotosystemie II (zwanym też centrum reakcji), w którym cząsteczka chlorofilu absorbuje światło o długości i nm. Ten chlorofil (Peso) może wytworzyć elektron o wartości e_o' starczające ujemnej, by doszło do redukcji chinonów, ale nie do redukcji NADP⁺ (do NADPH). Fotosystem II jest wykorzystywany głównie do uzyskiwania energii, jako że chinony przenoszą elektrony na chromy i pompują protony z wytworzeniem siły protonomotorycznej (PMF). Zamiast oddawać elektron z powrotem na pćso fotosystemu II, foto trofy oksygenowe korzystają z tego, że elektron wciąż ma e_o' o wartość: bardziej ujemnej niż na początku tego procesu. Białko, zwane plastocyjaniną (Pc), przenosi elektrony na chlorofil następnego fotosystemu zwanego fotosystemem I. Ten chlorofil (P_7oo) absorbuje światło o nieco większej długości fali niż p₆₈₀- Elektron przeniesiony na ptoo zostaje wzbudzony i osiąga e_o' o wartości -1,0 wolta, a więc wystarczająco ujem­ny, by doszło do redukcji ferredoksyny, która może z kolei zredukować NADP⁺ do NADPH. Elektrony nie biorące udziału w tej reakcji mogą powrócić poprzez plastocyjaninę do niewzbudzonego P7oo, dostarczają; PMF. Tak wiec fototrofy oksygenowe, podobnie jak bakterie zielone wytwarzają zarówno NADPH, jak i PMF bezpośrednio w czasie foto­syntezy, i nie muszą wykorzystywać FMF do syntezy NADPH.

Lokalizacja aparatu fotosyntetyzującego w komórce

Składniki systemów fotosyntetyzujących nie znajdują się w błonie cyto-plazmatycznej. Są one umiejscowione w błonach wewnątrzcytoplazma-tycznych, będących przedłużeniem błony cytoplazmatycznej, lut związanymi z nią pęcherzykami. Tak więc PMF tworzy się w poprzek błon tych pęcherzyków, nie zaś błony cytoplazmatycznej, jak to ma miejsce w systemie transportu elektronów opisanym w rozdziale S W ten sposób komórka znacząco zwiększa powierzchnię błon, w których zachodzi zarówno uzyskiwanie energii, jak i NADPH. Światło swobod­nie przechodzi przez błony, wiec jego dostęp do wewnątrzkomórkowych przedziałów nie stwarza problemów. Dzięki umiejscowieniu aparatu fotosyntetycznego w pęcherzykach błona komórkowa może bez prze­szkód spełniać swoje funkcje, a więc transportować składniki pokar­mowe, uczestniczyć w sekrecji białek, odpowiadać na sygnały środowis­kowe poprzez systemy dwuskładnikowe.

Węglowodany- związki organiczne, składające się z C, H, O, np. cukrowce, sacharydy.

Węglowodory- związki organiczne, składające się z C, H.

Związki organiczne- w ich skład wchodzi C, np. cukry.

Związki nieorganiczne- są to wszystkie związki oprócz organicznych, np. tlenki, kwasy, wodorotlenki, sole, wodorki, nadtlenki, ponadtlenki.

Chemosynteza- czerpanie CO₂ - samożywność, przyswajanie tlenku węgla IV z atmosfery i przetwarzaniem go na związki organiczne, bez udziału światła, z udziałem energii chemicznej z utleniania prostych substancji nieorganicznych.

Sinice, cyjanofity, cyjanobakterie, cyjanoprokariota (Cyanobacteria, Cyanophyta, Schizophyta) - gromada organizmów samożywnych, dawniej uznawanych za rośliny, według nowszej taksonomii zaliczanych do Procaryota (prokarioty, królestwo bakterii). Nazwa zwyczajowa Cyanophyta (końcówka -phyta - roślina), stosowana w taksonomii wcześniejszej, kładzie nacisk na te właściwości, które upodabniają sinice do organizmów roślinnych - zdolność do tlenowej fotosyntezy oraz obecność chlorofilu. To podobieństwo jest o tyle naturalne, że chloroplasty roślin powstały w wyniku endosymbiozy z sinicami - są po prostu uwstecznionymi sinicami. Sinice to w większości organizmy samożywne, mające zdolność wytwarzania związków organicznych na drodze fotosyntezy. Niektóre sinice mają zdolność asymilacji azotu atmosferycznego. Asymilacja jest możliwa dzięki tzw. heterocystom, tj. komórkom otoczonym grubą ścianą komórkową i posiadającym uwsteczniony aparat fotosyntetyczny (brak produkcji tlenu). W takich warunkach nitrogenaza (enzym asymilujący azot) może działać poprawnie. Związany azot przesyłany jest przez tzw. plasmodesmy (łączenie heterocysty z protoplastami sąsiadujących komórek).

1

---