Postęp w biotechnologii, pozwalający na pozyskiwanie biologicznie aktywnych składników żywych organizmów oraz ich wiązanie ze sta­łym nośnikiem, pozwolił na opracowanie nowych metod analitycz­nych, które mogą zastępować niektóre fizykochemiczne metody instru­mentalne. Do nich należą metody enzymatyczne i ich rozwinięcie, tj. metody z zastosowaniem biosensorów.

Klasyczne metody analizy chemicznej mimo wielu zalet, jak: dokładność, czułość i duża precyzja, stają się mało przydatne w tych zastosowaniach gdzie pożądane są szybkie oznaczenia, możliwość pracy w trybie monitorowania oraz automatyzacja pomiarów.

Wymienione wymogi spełniają biosensory (rys.1.1), łączące czułość i selektywność klasycznych metod analizy z szerokim wachlarzem rozwiązań konstrukcyjnych, dostosowanych do określonego zastosowania takiego urządzenia.

Termin biosensor pojawił się w literaturze analitycznej w 1977 roku dla opisania jonoselektywnej elektrody modyfikowanej enzymem. Początków należy jednak szukać w roku 1962, kiedy to Clark i Lyons zbudowali pierwszy bioczujnik, w którym jonoselektywna elektroda tlenowa została wyposażona w enzym jako membranę do detekcji glukozy [Brzózka Z., 1999].

Bioczujniki (biosensory) to sensory chemiczne składające się z dwóch zasadniczych elementów:

   warstwy receptorowej w postaci materiału biologicznego

   przetwornika elektrycznego lub optycznego

 

Rysunek 1.1 Schemat ideowy biosensora.

 

Należy zaznaczyć, że przedrostek „-bio” odnosi się do czujnika (sensora), a nie do oznaczanej substancji, a zastosowanie biosensorów nie ogranicza się do analizowania związków biologicznych [Przybyt M., 1999].

Warstwa receptorowa służy do “rozpoznawania" oznaczanego związku, a przetwornik do “przetłumaczenia" sygnału biologicznego na parametr mierzalny fizycznie oraz do obróbki tego parametru. W części receptorowej sensora informacja chemiczna jest przekształcana w formę energii, która może być mierzona przez przetwornik. Reakcja analitu z częścią biologiczną przetwornika generuje w nim sygnał, który może być łatwo zmierzony, wzmocniony i zanotowany. Receptorem mogą być enzymy, najczęściej w postaci unieruchomionej, mikroorganizmy lub przeciwciała, organelle tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Przetworniki to zwykle potencjometryczne lub amperometryczne elektrody jonoselektywne, tranzystory, termistory, piezokryształy, systemy optyczne.

Głównym zadaniem przetwornika jest konwersja mierzonego parametru na sygnał: elektryczny, optyczny lub akustyczny.

Biosensory wykorzystują podstawową cechę materiału biologicz­nego jako warstwy detekcyjnej - selektywność, to znaczy zdolność do reagowania na jeden określony związek w obecności innych. Selektywność biosensora zależy ściśle od użytego materiału biologicznego. Połączenie chemicznie selektywnej warstwy z fizyczną częścią sensora jest bardzo ważne i ma znaczący wpływ na selektywność całego sensora. Jego sygnał może być przetwarzany na wiele sposobów z różnym stopniem skomplikowania, przedstawiany w formie analogowej, odejmowany od sygnału odniesienia, przetwarzany na sygnał cyfrowy i następnie przetwarzany metodami statystycznymi.

Atrakcyjność stosowania bioczujników wynika głównie z tego, że pozwalają one w sposób prosty i szybki oznaczyć interesujący nas składnik najczęściej bardzo złożonej, kompleksowej mieszaniny, jaką jest np. produkt spożywczy czy substancja biologicznie aktywna.

Pomiar za pomocą bioczujnika najczęściej nie wymaga pracochłonnego przygotowania próby. Poza tym bioczujnik może być stosowany zwykle przez kilka tygodni, a nawet miesięcy wykonując w tym czasie setki pomiarów, co sprawia, że koszt analizy jest bardzo mały [Filipiak M., 1993].

Opracowanie metod unieruchamiania enzymów, a następnie innych bioaktywnych elementów, pozwalające na wielokrotne ich stosowanie, dało podstawy do budowy układów pomiarowych, które nazwano biosensorami.

Bioczujniki stanowią w pewnym sensie krok naprzód w dziedzinie analizy składu chemicznego w stosunku do czujników chemicznych, ponieważ na ogół charakteryzują się lepszymi od nich parametrami metrologicznymi (większą selektywnością i większą czułością).

 

Sensor chemiczny, jako urządzenie, jest określany wieloma parametrami użytkowymi. Obok podstawowych jak: dokładność, powtarzalność, definiowanych jak dla każdego pomiaru, występują parametry analityczne:

        czułość - nachylenie krzywej odpowiedzi sensora, wyrażonej jako wartość sygnału na jednostkę stężenia, np. mV/j.pH,

        zakres dynamiczny - zakres stężeń, w których czułość jest większa od zera,

        selektywność - zdolność sensora do pomiaru stężenia jednego chemicznego składnika w obecności innych,

        czas odpowiedzi - czas, w którym wyjściowy sygnał sensora osiąga 63% wartości końcowej w odpowiedzi na skokową zmianę stężenia oznaczanej substancji (w praktyce częściej używa się wartości t_95%, tj. czasu odpowiedzi kiedy sygnał osiągnie 95% wartości końcowej,

        czas życia - okres czasu poprawnie działającego sensora z zaznaczeniem trybu stosowania (przechowywanie, w użyciu), [ Brzózka Z., 1999].

 

Wszelkie próbki są w swo­jej istocie produktami złożonymi i oznaczanie w nich określonych składników jest często trudne, wymaga skomplikowanego przygotowania, jest czaso­chłonne i kosztowne. Ponadto wszelkie substancje zawie­rają wiele składników, które mogą przeszkadzać w oznaczaniu określonego analitu. Dlatego stale po­szukuje się nowych, lepszych metod analizy. Krokiem naprzód w tej dziedzinie są wlaśnie biosensory.

CZĘŚĆ RECEPTOROWA

Enzymy są białkami o masie cząsteczkowej od 6 do 400 kdaltonów

(dalton jest jednostką masy atomowej równą masie atomu wodoru tj. 1,66*10^-24 ), spełniającymi w żywych organizmach rolę katalizatorów. Ich wyjątkowa rola w przyrodzie to obniżanie bariery energii aktywacji określonej reakcji w wysoce selektywny sposób - działają więc jak regulatory. Wyróżniają się wysoką selektywnością względem substratu oraz łączą w sobie rozpoznanie i wzmocnienie, co jest niezwykle ważne przy konstrukcji sensorów enzymatycznych.

Enzymatyczne reakcje łączą specyficzność względem substratów z wysokim współczynnikiem wzmocnienia sygnału analitycznego. Z tego punktu widzenia są idealnymi, selektywnymi procesami dla opracowań sensorów chemicznych

Podstawowym celem każdej procedury immobilizacyjnej jest utrzymanie wysokiej aktywności biokatalizatora na powierzchni sensora. Dwie podstawowe metody immobilizacji enzymów na końcówce sensora, to fizyczne lub chemiczne związanie na powierzchni przetwornika i unieruchomienie w inertnej matrycy białkowej. Nowe metody opierają się na kowalencyjnym doczepianiu enzymu do membrany polimerowej, jego zaadsorbowaniu na mambranie z PCW, pułapkowaniu w strukturze włóknistego trójoctanu celulozy, czy sieciowaniu z syntetycznym prepolimerem.

Najczęściej stosowane metody immobilizacji enzymów to:

-         fizyczna immobilizacja w membranie do dializ

-         immobilizacja w materiale żelowym

-         kowalencyjne związanie z matrycą żelową

-         bezpośrednie związanie kowalencyjne z powierzchnią np. sensora

Wybór metody immobilizacji jest podyktowany konkretnymi zastosowaniami, ale niezmiennym warunkiem jest zachowanie wyjściowej aktywności enzmatycznej końcowej warstwy.

Użyteczny czas życia warstwy enzymatycznej zależy od odporności enzymu i matrycy, w której jest immobilizowany [Brzózka Z., 1999].

Przykłady zastosowań enzymów w czujnikach przedstawia poniższa tabela (tabela1.1).

Związek, na który elektroda jest czuła	Enzym	Elektroda potencjometryczna na jon	Zakres stężeń nmol/1
Mocznik	Ureaza	Me^+ H^+ NH4^+	0,05 - 1 0,05 - 5 0,05 - 50
Glukoza	Oksydaza glukozy	H^+ I^-	1 - 100 0,1 - 1
L-aminokwasy	Ksydaza L-aminokwasowa	Me^- NH4^+	0, 1 - 10 0,1 - 1
L-tyrozyna	Dekarboksylaza L-tyrozyny	CO2	0,1 - 100
L-asparagina	Asparaginaza	M^+	0,05 - 10
Penicylina	Penicylinaza	H^+	0,1 - 10
Amygdalina	B-Glukozydaza	CN^-	0,01-10

 

Tabela1.1 Niektóre enzymatyczne elektrody potencjometryczne [Hulanicki A., 1990].

Wykorzystanie mikroorganizmów jako biologicznych elementów biosensorów nie jest obecnie tak zaawansowane jak zastosowania biokatalizatorów w biosensorach enzymatycznych. Stabilność nienaruszonych komórek i olbrzymia różnorodność mikroorganizmów stwarzają szerokie możliwości biosensorom mikrobiologicznym w analizie złożonych mieszanin, kontroli procesowej, monitorowaniu środowiska, szacowaniu toksyczności i wykrywaniu mutagenów. Sensory mikrobiologiczne wykazują lepszą czułość, ale gorszą selektywność w porównaniu do biosensorów enzymatycznych. Wydaje się więc, że najszersze zastosowanie znajdą generalnie, w monitorowaniu lub innych przypadkach, gdzie specyficzność nie będzie wymagana.

Biosensory z zastosowaniem bakterii wykonuje się przez fizyczne związanie wymazu komórek bakterii na powierzchni elementu detekcyjnego. Zazwyczaj komórki bakterii są unieruchomione membraną do dializ lub innymi typami membran mikroporowatych, przez które może penetrować analizowana substancja. Komórka bakterii jest po prostu pomieszczeniem enzymów, które katalizują pożądane (analityczne) reakcje.

Głównymi zaletami komórek bakterii, jako materiału biokatalitycznego, jest możliwość wykorzystania naturalnej aktywności biokatalitycznej, wykorzystania naturalnie zoptymalizowanej procedury działania enzymu oraz nieograniczony dostęp do surowców. Mankamentem tego typu biosensorów jest ich selektywność. Obecność wielu enzymów w komórce bakterii może prowadzić do dodatkowych interferencji. Dodatkowe problemy z selektywnością są wynikiem obecności związków, które zmieniają szybkość metabolizmu immobilizowanych komórek. Niekiedy jest to przydatne do monitorowania trucizn i mutagenów.

Przykłady zastosowania materiałów bakteryjnych w czujnikach przedstawia tabela 1.2.

Substrat	Mikroorganizm	Przetwornik	Czas odpowiedzi [min]	Zakres odpowiedzi [mg/l]
cukry przyswajalne (glukoza, fruktoza)	Brevibacterium lactofermentum	O2	10	10-200
Glukoza	Pseudomonas fluorescens	O2	10	2 - 20
kwas octowy	Trichosporon	O2	10	3 - 60
Etanol	Trichosporon brassicae	O2	10	2-25
Metanol	niezidentyfikowana bakteria	O2	10	5-200
Metan	Methylomoas flagellata	O2	2	(0 -6,6 mmol/1)
kwas glutaminowy	Escherichia coli	CO2	5	8-800
cefalosporyna	Citrobacter freundi	pH	10	10^2 -5*10^2
BZT (Biologiczne Zapotrzebowanie O2)	Trichosporon cutaneum	O2	15	3-60
Lizyna	Escherichia coli	CO2	5	10-100
Amoniak	bakterie nitrifikujące	O2	10	0.05 - 1
dwutlenek azotu	bakterie nitryfikujące	O2	3	(0,51 - 255 ppm)
kwas nikotynowy	Lactobacillus arabinosis	pH	60	10^-5 - 5
substancja mutagenna	Bacillus subtilis	O2	60	1,6 - 2,8*10^3

 

Tabela 1.2 Biosensory wykorzystujące materiał bakteryjny [Brzózka Z., 1999].

 

Biosensory wykorzystujące tkanki roślin i zwierząt wykonuje się, umieszczając cienki plaster tkanki na końcówce sensora i zabezpieczając porowatą membraną. W porównaniu do biosensorów bakteryjnych, te wykorzystujące tkanki wykazują lepszą selektywność, ponieważ mniej przeszkadzających enzymów jest w matrycy tkankowej.

Zastosowanie kultur bakterii, preparatów tkankowych lub całych organów, jako warstwy receptorowej sensora, może być argumentowane naturalnym, ochronnym środowiskiem enzymu, ale istotną wadą tego typu sensorów są zazwyczaj bardzo długie czasy odpowiedzi. - od minut do godzin.

Biosensory oparte na tkankach roślin i zwierząt wykonuje się umieszczając cienki plaster tkanki na końcówce sensora i zabezpieczając porowatą membraną. Przykładem może być glutaminowy sensor, gdzie cienki wycinek nerki umocowano na końcówce amoniakalnej elektrody gazowej i zabezpieczono nylonową membraną. Tkanka nerki zawiera glutaminazę, która katalizuje deaminację glutaminy do glutaminianu i amoniaku. Czas życia takiego biosensora wynosi 30 dni, podczas gdy sensora opartego na wyizolowanym enzymie tylko 1 dzień (tabela 1.3).

 

	Rodzaj	Enzymatyczny	Mitochondrialny	Bakteryjny	Tkankowy
Parametr
Czułość [mV/dekadę]		33 - 41	53	49	50
Dolny limit detekcji [mmol*1^-1]		6.0 * 10^-5	2,2 * 10^-5.	5,6 * 10^-5	2,0 * 10^-5
Zakres liniowy [mmol*1^-1]		0,15 - 3,3	0,1 - 5,5	0,1 - 10	0,06 - 5,2
Czas odpowiedzi [min]		4 - 5	6 - 7	5	5 - 7
Czas życia [dni]		1	10	20	30

 

Tabela 1.3 Porównanie parametrów biosensorów glutaminy wykorzystujących różne materiały biologiczne w membranie [Brzózka Z., 1999].

 

Biosensory wykorzystujące jako materiał biologiczny tkanki roślin i zwierząt prezentuje tabela 1.4.

 

Substrat	Materiał biologiczny	Oznaczany analit
Arginina	wątroba bydlęca	mocznik (NH3, CO2)
Glutamina	komórki nerkowe świni	NH3
Glutamina	mitochondria z nerki świni	NH3
Adenozyna	komórki śluzówkowe cienkiego jelita myszy	NH3
kwas adenozyno-5'-monofosforowy AMP	mięśnie królika	NH3
Guanina	wątroba królika	NH3
nadtlenek wodoru	wątroba bydlęca	O2
Glutaminian	żółta dynia	CO2
Pirogronian	ziarna kukurydzy	C O2
Mocznik	mączka z fasoli jaś	NH3
Fosforan	bulwy ziemniaków	O2
Dopamina	miąższ banana	O2
Tyrozyna	burak cukrowy	O2
Cysteina	liść ogórka	NH3

 

Tabela1.3 Biosensory wykorzystujące wycinki tkanek i innych preparatów biologicznych [Brzózka Z., 1999].

Biosensory wykorzystujące receptory uzyskują swoją selektywność w wyniku naturalnego powinowactwa właściwych białek lub fragmentów protein do specyficznych substancji, zwanych ligandami dopełniającymi (jony ujemne lub cząsteczki związane z jonem centralnym w związkach kompleksowych). W przeciwieństwie do sensorów z zastosowaniem biokatalizatorów, w biosensorach wykorzystujących receptory jako materiał biologiczny po etapie cząstkowego rozpoznania nie zachodzi reakcja chemiczna. W ogólnym ujęciu, receptor oddziałuje selektywnie z danym ligandem, tworząc termodynamicznie stabilny kompleks.

Jednym z przykładów idealnych receptorów do konstrukcji warstwy selektywnej są przeciwciała. Przeciwciała należą do grupy białek surowicy nazywanych immunoglobulinami, o masie cząsteczkowej od 140 kD do 970 kD. Ich główną funkcją jest unieszkodliwianie obcych immunogenów wysokomolekularnych, jak: białka, kwasy nukleinowe, wirusy, które wnikają do organizmu. Przeciwciała powstają w organizmie pod wpływem immunogenu (antygenu) i są specyficzne tylko wobec niego. Z tego punktu widzenia można przeciwciała traktować jako wysoce specyficzne czynniki kompleksujące, spełniające funkcje obronne organizmu.

Kiedy receptor jest immobilizowany, przyrząd jest konstruowany pod kątem detekcji ligandu dopełniającego. Kiedy ligand lub jego analog jest immobilizowany, przyrząd reaguje na zmiany stężenia receptora. Stosowane są dwa podstawowe sposoby detekcji: bezpośredni i pośredni.

Bezpośredni typ detekcji odnosi się do tych biosensorów, gdzie oddziaływania receptora i jego dopełniającego ligandu prowadzą wprost do wykrywalnego sygnału fizycznego lub chemicznego, bez wprowadzania dodatkowych odczynników. Większość biosensorów wykorzystuje receptory z zastosowaniem pośredniego typu detekcji. Dzieli ona się na dwie kategorie: te, które stosują specyficzne znaczniki (enzymatyczne, elektrochemiczne, fluoroscencyjne) do śledzenia reakcji wiązania oraz te oparte na modulacji sygnałów (zazwyczaj elektrochemicznych) pochodzących od podstawowych, jonowych składników próbki [Brzózka Z., 1999].

CZĘŚĆ PRZETWORNIKOWA

Wśród kilku reguł dotyczących sensorów elektrochemicznych podstawą jest wymóg zamkniętego obwodu elektrycznego, a więc przynajmniej dwóch elektrod tworzących ogniwo elektrochemiczne. Podczas procesu elektrochemicznego następują zmiany chemiczne na elektrodach, a ładunek jest przenoszony przez fazę międzyelektrodową (np. elektrolit).

Ważne dla sensorów elektrochemicznych jest to, że przeniesienie ładunku w części przetwornikowej sensora i wewnątrz układu pomiarowego, który jest częścią całego obwodu, jest zawsze elektryczne. Natomiast przeniesienie ładunku w próbce może być elektronowe, jonowe lub mieszane.

Jak wiadomo metal (lub niemetal) zanurzony w roztworze, zawierającym jego jony otrzymuje w stosunku do roztworu pewien potencjał, który w określony sposób zależy od stężenia (aktywności) jonów tego metalu. Tak np. jeśli zanurzymy srebrny drut w wodzie to pewna ilość srebra przejdzie do roztworu, tworząc jony Ag⁺, a metal otrzyma ładunek ujemny i powstanie w ten sposób różnica potencjałów. Gdy zaś do wody z zanurzonym drutem srebrnym doda się soli srebrowej, wtedy powstanie ciśnienie osmotyczne skierowane w przeciwną stronę i zależne od stężenia jonów srebrowych. Gdy stężenie to jest niewielkie , przeważa prężność roztwórcza i różnica potencjałów pozostanie, chociaż będzie mniejsze niż w przypadku zanurzenia drutu srebrnego w wodzie.

Gdy będziemy zwiększać stężenie jonów srebrowych , doprowadzimy do zrównoważenia potencjałów, wówczas nie będzie żadnego ładunku na metalu. Kiedy zwiększymy je jeszcze bardziej stężenie jonów srebrowych i ciśnienie osmotyczne przewyższy prężność roztwórczą srebra, część jonów rozładuje się na metalu i naładuje go dodatnio. Jak wynika z powyższych rozważań, różnica potencjałów może być miarą stężenia jonów danej substancji w roztworze [Leyko W., 1987].

Najbardziej popularnymi sensorami tego typu są membranowe elektrody jonoselektywne (ang. Ion Selective Electrodes, ISE). W przypadku elektrod membranowych mamy do czynienia z przeniesieniem jonu z fazy roztworu do fazy membrany.

Ze względu na rodzaj zastosowanego materiału membrany, można je podzielić na następujące typy:

        z membranami stałymi wykonanymi z różnych materiałów krystalicznych soli metali;

        z membranami szklanymi, głównie krzemianowymi lub glinokrzemianowymi (np. elektrody odwracalne względem H⁺, K⁺, Na⁺, Li⁺);

        z ciekłymi membranami typu jonitowego, będącymi organicznymi, nie mieszającymi się z wodą fazami ciekłymi, zawierającymi związki jonowe lub jonogenne, jak kwasy hydrofobowe, zasady lub sole (np. elektrody odwracalne względem Na⁺, K⁺, Li⁺, Ca²⁺, Cu²⁺);

        z membranami stanowiącymi pośredni element przetwarzania informacji biochemicznej na sygnał analityczny, gdyż podstawowym elementem detekcji potencjometrycznej są elektrody wymienionych typów (np. elektrody gazowe).

 

Analityczna informacja w potencjometrycznej metodzie jest otrzymywana przez pomiar napięcia ogniwa złożonego z elektrod: wskaźnikowej i odniesienia (rys 2.1).

W pomiarach potencjometrycznych konieczne jest stosowanie elektrody odniesienia, która powinna spełniać trzy główne wymagania: stabilność, odwracalność, odtwarzalność.

Stabilność oznacza niezmienność potencjału, mimo zmiany składu próbki.

Odwracalność potencjału definiowana jest jako szybki powrót do wartości równowagowej po niewielkim, przejściowym zaburzeniu.

Odtwarzalność zapewnia otrzymywanie takiego samego potencjału elektrody dla jej kolejnych, identycznych egzemplarzy. Przykładem elektrody, która spełnia powyższe warunki jest elektroda chlorosrebrowa (elektroda srebrowa pokryta cienką warstwą chlorku srebra). Kompletna elektroda odniesienia składa się z trzech części: wewnętrznej elektrody odniesienia (Ag/AgCl), zbiornika roztworu odniesienia (KCl) i styku cieczy (otwarty kanał o wypływie wewnętrznego elektrolitu odniesienia rzędu 2 nl*h^-1 [Brzózka Z., 1999].

 

 

Rysunek 2.1 Schemat elektrody: jonoselektywnej i odniesienia [Dybko A., 2000].

 

 

W praktyce każda elektroda jonoselektywna może być zastosowana jako elektroda odniesienia, pod warunkiem, że zanurzona do danego roztworu wykazuje stały potencjał.

ELEKTORDA PH

Składa się ona z małej banieczki ze szkła glinokrzemianowego wrażliwego na działanie jonów wodorowych, zawierającej zbuforowany roztwór chlorkowy oraz wewnętrzną elektrodę porównawczą, zwykle chlorosrebrową lub kalomelową. Szkło stanowi częściowo uwodniony glinokrzemian zawierający jony sodowe, litowe lub wapniowe oraz małe ilości jednego z jonów: baru, ołowiu, lantanu, tytanu, cyny.

Źródłem powstawania potencjału na membranie banieczki szklanej zanurzonej do roztworu jonów wodorowych jest żelowa struktura warstwy szkła.

Termodynamiczna równowaga jonów wodorowych ustala się na granicy faz między roztworem próbki a zewnętrzną warstwą żelową banieczki szklane. Jeżeli aktywność jonów wodorowych jest różna w obu fazach, następuje transport tych jonów. Prowadzi to do powstania ładunku na powierzchni fazowej, co przeciwdziała dalszemu transportowi jonów H⁺. Wypadkowy potencjał jest funkcją aktywności jonów wodorowych w roztworze próbki i w warstwie żelowej szkła. Liczba jonów wodorowych w żelowej warstwie jest określona strukturą SiO₂ w szkle i może być rozpatrywana jako stała i niezależna od mierzonej próbki. Potencjał zewnętrznej warstwy żelowej jest przekazywany za pomocą jonów Li⁺, obecnych w strukturze szkła do wnętrza szklanej membrany. Na wewnętrznej powierzchni banieczki szklanej, kontaktującej się ze zbuforowanym (o stałym pH) roztworem KCl generowany jest potencjał według mechanizmu opisanego dla zewnętrznej warstwy. Całkowity potencjał szklanej membrany jest równy różnicy dwóch potencjałów międzyfazowych [Brzózka Z.,1999].

ROZWIĄZANIA PRAKTYCZNE

Biosensory z zastosowaniem potencjometrycznych elementów detekcyjnych rozwinięto, wykorzystując szklaną elektrodę pH i gazowe elektrody membranowe. Wiele reakcji enzymatycznych generuje lub konsumuje jon wodorowy. Immobilizując taki enzym na powierzchni szklanej elektrody pH, otrzymujemy biosensor, gdzie mierzone zmiany pH są proporcjonalne do stężenia analizowanej substancji. Przykładem może być biosensor do oznaczania penicyliny wykorzystujący reakcję:

 

[Torbicz W., 1995]

ELEKTRODA AMPEROMETRYCZNA

Sensory amperometryczne są grupą sensorów elektrochemicznych, wykorzystujących zależność mierzonego prądu od stężenia oznaczanej substancji. W amperometrii wykorzystuje się własności charakterystyki prądowo-napięciowej odpowiednio wykonanej elektrody, w której dla pewnego zakresu przyłożonych napięć prąd jest praktycznie niezależny od wartości napięcia. Wartość prądu elektrody amperometrycznej jest zdetermino­wana reakcjami zachodzącymi na elektrodzie roboczej najczęściej katodzie, zwią­zanymi z wymianą elektronów, w których biorą udział oznaczane substancje. Am­perometria znalazła szerokie zastosowanie w pomiarach stężeń tlenu, gazów to­ksycznych i wielu substancji organicznych, głównie glukozy. Umożliwia pomiar stężeń rzędu 10^-8 - 10^-9 mol/l.

ELEKTRODA TLENOWA

Elektroda tlenowa Clarka jest sensorem do oznaczania tlenu, jakkolwiek wprowadzenie niezbędnych modyfikacji w jej konstrukcji umożliwia opracowanie sensorów do oznaczania innych gazów o własnościach utleniająco - redukujących, jak: H­₂S, NO, NO₂, Cl₂, CO.

Klasyczna elektroda Clarka jest elektrodą z ciekłym elektrolitem, najczęściej w postaci wodnego roztworu chlorku potasowego. Anoda jest wykonana ze srebra, a katoda z metalu szlachetnego: platyny lub złota (rys.2.2).

 

Rysunek 2.2 Ideowy schemat amperometrycznej elektrody tlenowej Clarka [Brzózka Z., 1999].

 

Sygnałem wyjściowym elektrody jest natężenie prądu, które jest proporcjonalne do ciśnienia parcjalnego tlenu lub stężenia w elektrolicie. Stabilizowane napięcie przyłożone do elektrody jest rzędu 0,5 - 1V [Torbicz W., 1995].

Na rysunku poniżej (rys.2.3) przedstawiam przekrój czujnika tlenu oraz charakterystykę prądowo - napięciową. Poszczególne przebiegi grupy charakterystyk obrazują zawartość tlenu w próbce od 0 % do 70 %.

 

Rysunek 2.3 Przekrój elektrody Clarka i jej charakterystyka prądowo - napięciowa

[Torbicz W., 1995].

 

Jako materiały membran w takich czujnikach stosuje się różne polimery (teflon, polietylen, polimery silikonowe) przez które tlen łatwo przenika, w przeciwieństwie do innych gazowych składników próbki.

Jako przykład może posłużyć amperometryczny czujnik enzymatyczny do pomiaru stężenia glukozy (elektroda tlenowa z enzymem w części receptorowej).

Czujniki te charakteryzują się przede wszystkim wysoką selektywnością dla glukozy. Prace nad nimi prowadzone są od wielu lat, początkowo do zastosowań medycznych, a od pewnego czasu również na potrzeby biotechnologii i przemysłu spożywczego.

Wykorzystują one elektrodę tlenową w połączeniu z membraną zawierającą oksydazę glukozy - enzym utleniający glukozę (rys 2.4).

Na powierzchni elektrody tlenowej umieszcza się warstwę unieruchomionego enzymu. Elektrodę taką zanurza się w roztworze nasyconym tlenem z powietrza i rejestruje prąd początkowy. Po dodaniu glukozy część tlenu dyfundującego do katody jest zużywana w reakcji w warstwie immobilizowanego enzymu, co zmniejsza jego strumień dyfuzji do powierzchni katody. Po pewnym czasie procesy na elektrodzie osiągają stan ustalony i re­jestruje się prąd końcowy. Spadek natężenia prądu jest wprost propor­cjonalny do stężenia glukozy. Pomiar spadku natężenia prądu dla róż­nych stężeń glukozy pozwala wyznaczyć krzywą kalibracyjną, na pod­stawie której oznaczamy zawartość glukozy w badanej próbce, zwykle po odpowiednim jej rozcieńczeniu.

 

 

Rysunek 2.4 Zasada działania enzymatycznego czujnika glukozy [Zawicki I., 1993].

Eo - elektroda odniesienia

Ew - elektrolit wewnętrzny

P1, P2 - produkty reakcji

 

Do pomiaru wykorzystuje się reakcję utleniania glukozy zawartej w próbce, pod wpływem oksydazy glukozowej znajdującej się w membranie przepuszczalnej dla glukozy i tlenu, a stanowiącej barierę dla innych substancji, które mogłyby wpływać negatywnie na wyniki. W wyniku reakcji enzymatycznej tlen rozpuszczony w próbce zostaje częściowo zużyty zgodnie z poniższą reakcją:

 

[Przybyt M., 1999]

 

Pozostała część tlenu (zależna od stężenia glukozy w próbce)dyfunduje w kierunku ujemnie spolaryzowanej elektrody El^-, gdzie ma miejsce wymiana ładunków elektrycznych, co jest równoznaczne z przepływem prądu I w obwodzie zewnętrznym składającym się ze źródła napięcia E i rezystora R. Prąd ten - przy ustalonej wartości napięcia między elektrodami (0,6...0,8 V) - jest w pewnym zakresie liniowo zależny od strumienia tlenu docierającego do elektrody El^- i jego wartość jest określana przez pomiar spadku napięcia Ud. A zatem spadek napięcia na Rd jest pośrednio zależny od stężenia glukozy w próbce [Zawicki I., 1994].

Możliwe są różne sposoby pomiaru glukozy w próbce i odpowiednio do tego wymagane są odmienne konstrukcje czujników glukozy.

W szczególności, najprostszy i najtańszy pomiar odbywa się wtedy, gdy próbka płynu w postaci pojedynczej kropli zostanie umiejscowiona na czujniku (czujnik “kroplowy"), lub też czujnik zanurzony zostanie w naczyńku zawierającym próbkę (rys 2.5 a i b).

Do pomiaru wymagany jest w tym przypadku tylko czujnik glukozy i stosunkowo prosty miernik sygnału wyjściowego.

 

 

 

Rysunek 2.5 Schematy glukozomierzy: a) z czujnikiem kroplowym, b) z czujnikiem zanurzeniowym 1- elektroda robocza, 2- elektroda odniesienia, 3- membrany, 4- próbka [Zawicki I., 1993].

 

Znacznie bardziej skomplikowane i droższe jest wykonanie układu użytkowego do pomiarów ciągłych metodą przepływową (tzw. FIA-Flow Injection Analysis). Oprócz czujnika glukozy konieczna jest tu pompa perystaltyczna, “zawór próbkujący", procesor i rejestrator sygnału wyjściowego (rys 2.6). W każdym z podanych układów do pomiarów można wykorzystać wartość sygnału w stanie ustalonym lub jego parametry w stanie przejściowym. W pierwszym wypadku pomiar może być prostszy, w drugim — można uzyskać szerszy zakres pracy liniowej, przy czym w układzie przepływowym zakres ten można niemal dowolnie roz­szerzać. Każdy z wymienionych sposobów pomiaru wymaga odpowied­niej konstrukcji czujnika.

Układy w których jedna lub więcej operacji musi być wykonanych przed otrzymaniem punktu pomiarowego w odróżnieniu od bezpośrednio działających sensorów nazywane są systemami sensorowymi. Do takich systemów zalicza się metodę FIA.

 

 

 

 

Rysunek 2.6 Schemat układu przepływowego do oznaczania glukozy: 1- zbiornik z wodą, 2- zawór, 3- pompa perystaltyczna, 4- komora z czujnikiem, 5- tlenomierz, 6- rejestrator, 7- zbiornik do zlewek [Zawicki I., 1993].

 

Na podkreślenie zasługuje to, że koszt pojedynczego oznaczenia jest stosunkowo niewielki, gdyż zużywająca się część czujnika to wymienna wkładka (końcówka) zawierająca zestaw membran, pozwalająca na wykonanie 50 - 100 oznaczeń. Jednocześnie koszt takiej wkładki jest niewiele wyższy niż pojedynczego paska - stosowanego w metodzie tzw. suchych testów paskowych-przydatnego do jednokrotnego oznaczenia glukozy [Zawicki I., 1993].

Przykłady zastosowań elektrod amperometrycznych przedstawia tabela 2.2.

 

Elektrody amperometryczne
Elektrody oparte na rejestracji powstającego H2O2		Elektrody oparte na rejestracji zużywanego tlenu
analit	materiał biologiczny	analit	materiał biologiczny
Siarczyny	oksydaza siarczynowa	Kwas mlekowy	oksydaza mleczanowa
Ksantyna	oksydaza ksantynowa	Glukoza	Pseudosomonas fluorescences
Cholesterol	oksydaza cholesterolowa	Kwas octowy	Trichosporon brassicae
Glutaminian	oksydaza glutaminowa	Etanol	Trichosporon brassicae
Galaktoza	oksydaza galaktozowa	Nadtlenek wodoru	wątroba wołowa
Alkohol	oksydaza alkoholowa	Tyrozyna	burak cukrowy
L-aminokwasy	oksydaza L-aminokwasów	Kwas glutaminowy	oksydaza glutaminowa
Sacharoza	inwertaza, mutarotaza, oksydaza glukozowa	Lizyna	Trichoederma viride
Fosforan inozyny	fosforylaza nukleozydów, oksydaza ksantynowa	Siarczyn	oksydaza siarczynowa
Aspartam	peptydaza, aminotransferaza asparginowa. oksydaza glutaminowa,	Szczawian	oksydaza szczawianowa
Glutamina	glutaminaza, oksydaza glutaminowa.	L-aminokwasy	oksydaza L-aminokwasów

 

Tabela 2.2 Enzymatyczne elektrody amperometryczne przydatne w analizie żywności [Przybyt M., 1999].

 

Ciągły rozwój techniki światłowodowej stymulowany głównie potrzebami telekomunikacji stwarza nowe możliwości wykorzystania światłowodów. Jedną ze szczególnie intensywnie rozwijanych w ostatnich latach gałęzi optoelektroniki są sensory światłowodowe wielkości fizycznych i chemicznych. Z punktu widzenia systematyki pomiarów badana wielkość podlega przetwarzaniu w warstwie receptorowej na skorelowany ze stężeniem sygnał optyczny. Zadaniem warstwy przetwornikowej jest natomiast przetworzenie takiego sygnału na końcowy sygnał elektryczny.

Optyczny sensor chemiczny (optroda) jest urządzeniem, które przetwarza chemiczną informację o próbce (np. stężenie określonego składnika w próbce) na sygnał użyteczny analitycznie

Wiązka światła przenoszona jest między elementami sensora za pomocą włókien światłowodowych. W ten sposób wiązka oddziałuje przez całą drogę z granicą między ośrodkami o różnej gęstości optycznej, które to oddziaływanie zachodzi bez strat dzięki zjawisku całkowitego wewnętrznego odbicia.

Kiedy światło dociera z optycznie gęstszego ośrodka o współczynniku załamania n₁ do graniczącego z nim optycznie rzadszego ośrodka o współczynniku załamania n₂, to może zostać albo odbite z powrotem do fazy 1, albo załamane do fazy 2. O tym, które z tych zjawisk zajdzie decyduje kąt padania wiązki ၑ₁ do granicy faz. Dla wartości ၑ_1>ၑ_c wiązka światła zostaje całkowicie odbita do gęstszej fazy (rys.2.7). Kąt wiązki odbitej ၑ_r równy jest kątowi wiązki padającej.

 

 

Rysunek 2.7 Odbicie i załamanie światła na granicy faz.

 

Rdzeń optyczny o współczynniku załamania światła n₁ (typowym materiałem jest krzemionka, dla której n₁=1,6) otoczony jest izolatorem optycznym, nazywanym płaszczem, o niższym współczynniku n₂ (o wartości ok. 1,5). Zewnętrzna osłona zabezpiecza całość i nie ma innej specjalnej funkcji (rys 2.8).

Rysunek 2.8 Przekrój włókna światłowodowego.

 

Aby wiązka światła ulegała całkowitemu odbiciu musi wchodzić do końcówki światłowodu wewnątrz określonego stożka, którego kąt związany jest ściśle z krytycznym kątem załamania na granicy faz rdzeń - płaszcz. Podobnie, światło opuszczając koniec włókna rozchodzi się jedynie pod tym samym stałym kątem. Istotne jest więc ustalenie kształtu owego stożka, przy projektowaniu sensorów optycznych. Kąt ၑ₀ określa tzw. stożek akceptacji (rys.2.9).

 

Rysunek 2.9 Stożek akceptacji światłowodu.

 

Światło, które dochodzi do granicy faz rdzeń - płaszcz światłowodu pod kątem większym od kąta krytycznego, ulega całkowitemu odbiciu wewnętrznemu. Mimo to niewielka część promieniowania penetruje na małą głębokość płaszcz, tworząc pole elektromagnetyczne, zwane falą zanikającą (rys.2.10). Fala zanikająca rozprzestrzenia się równolegle do granicy faz rdzeń - płaszcz i może oddziaływać z cząsteczkami znajdującymi się w płaszczu blisko tej granicy.

 

Rysunek 2.10 Powstawanie fali zanikającej we włóknie światłowodowym

[Brzózka Z., 1999].

 

Fala zanikająca jest bardzo ważnym zjawiskiem w sensorach optycznych. Można ją wykorzystać w sensorze, w którym płaszcz zastąpiony jest fazą zawierającą odczynnik, którego własności optyczne zmieniają się przy oddziaływaniu z próbką. Zaletą tego rozwiązania jest to, że oddziaływania mają miejsce w cienkiej warstwie odczynnika. Możliwe jest więc opracowanie sensora, w którym warstwa odczynnika jest na tyle cienka, że pozwala na szybkie ustalenie stanu równowagi z próbką. Warstwa ta jest jednocześnie na tyle gruba, że zapobiega jakimkolwiek oddziaływaniom między falą zanikającą a próbką, co doprowadziłoby do powstania błędów.

Konstrukcje sensorów optycznych można podzielić według sposobu wykorzystania światłowodów:

-         sensory jednoświatłowodowe

-         sensory dwuświatłowodowe

lub według sposobu oddziaływania na światłowód:

-         sensory z modyfikowaną strukturą światłowodu

-         sensory z nie modyfikowanym włóknem światłowodowym.

 

Do konstrukcji jednoświtłowodowego sensora może być użyty pojedynczy światłowód jako włókno jednocześnie doprowadzające i transmitujące światło do układu detekcyjnego. Tę grupę można podzielić na:

- układy transmisyjne - zbudowane ze światłowodu z usuniętym płaszczem i zamiast niego naniesioną warstwą czułą na badaną wielkość. Zmiana absorpcji lub współczynnika załamania "nowego płaszcza", spowodowana zmianą stężenia badanej wielkości, wpływa na własności transmisyjne światłowodu. Wykorzystuje się tu zjawisko częściowego wnikania pola elektromagnetycznego do obszaru płaszcza światłowodu, tzw. fali zanikającej (rys. 2.11a);

- układy reflektancyjne (odbiciowe) - promieniowanie ze źródła światła dociera do optrody i powraca do układu detekcyjnego tym samym światłowodem (rys.2.11b).

 

Rys.2.11 Schemat sensorów jednoswiatłowodowych: a) układ transmisyjny, b) układ reflektancyjny [Brzózka Z., 1999].

 

W konstrukcjach sensorów dwuświatłowodowych lub wykorzystujących wiązkę światłowodów promieniowanie dociera do optrody jednym światłowodem, ulega modyfikacji w stopniu zależnym od stężenia badanej substancji i jest transmitowane do detektora drugim włóknem. Wykorzystanie wiązki światłowodów, zamiast pojedynczego włókna, prowadzi do uzyskania większej mocy docierającej do optrody i w konsekwencji większego sygnału detekcyjnego (kosztem jednak większych wymiarów geometrycznych sensora).

W zależności od typu konstrukcji sensora, możemy stosować różne układy pomiarowe. Rozwiązaniem układu pomiarowego dla nie modyfikowanego jednoświatłowodowego (lub wiązki) sensora jest stosowanie rozgałęziacza światła, a w szczególności dwubarwnego zwierciadła półprzeźroczystego. Zwierciadło takie charakteryzuje się wysokim współczynnikiem odbicia dla wiązki pierwotnej (wzbudzającej) i wysoką przepuszczalnością dla wiązki wtórnej. Pomaga to w oddzieleniu wiązki wtórnej od powracającej, w nie zmienionej formie, wiązki pierwotnej do detektora. Źródłem światła może być np. dioda półprzewodnikowa LED, detektorem zaś fototranzystor lub fotodioda (rys.2.12)

 

Rysunek 2.12 Układ pomiarowy z jednoświatłowodowym sensorem optycznym

[Brzózka Z., 1999].

 

Układ pomiarowy upraszcza się, jeżeli mamy do czynienia z modyfikowanym (transmisyjnym) sensorem jednoświatłowodowym, wykorzystującym zjawisko fali zanikającej. Dioda LED umieszczona jest wtedy na jednym końcu włókna, natomiast fotodetektor na drugim. Taki zestaw nie wymaga dodatkowych elementów optycznych (rys.2.13)

 

 

Rysunek 2.13 Układ pomiarowy z transmisyjnym sensorem światłowodowym

[Brzozka Z., 1999]

 

Innym rozwiązaniem układu pomiarowego jest użycie oddzielnego włókna (lub wiązki światłowodów) do doprowadzenia promieniowania do i z fazy odczynnika, tzn. użycie rozwidlonego układu włókien (rys.2.14).

 

Rysunek 2.14 Układ pomiarowy z rozwidlonym układem włókien [Brzozka Z., 1999].

 

W takim przypadku system detekcji nie jest narażony na promieniowanie przez wiązkę odbitą od granicy faz w miejscu wejścia i wyjścia wiązki do włókna wzbudzającego. Zastosowanie wiązki rozwidlonej ma jednak pewne wady:

1)     wymiary optrody zwiększają się i wymaga dwóch lub wiązki światłowodów

2) część fazy odczynnika nie mieści się w stożku akceptacji włókna wzbudzającego, a także emisyjnego i dlatego nie jest rejestrowana przez detektor [Brzózka Z., 1999].

Biosensory wykorzystujące optyczne metody detekcji wykonuje się, immobilizując materiał biologiczny, np. enzym na powierzchni końcówki włókna światłowodowego. Można wyróżnić dwie kategorie biosensorów z zastosowaniem detekcji optycznej. Pierwsza kategoria, to biosensory wykorzystujące reakcję chemiczną jako etap pośredni między reakcją enzymatyczną i właściwym pomiarem optycznym. W drugiej kategorii, enzymatyczna reakcja zużywa lub generuje optycznie czynne substancje, które mogą być monitorowane optoelektronicznym przez włókno światłowodowe.

Przykładem biosensora optycznego wykorzystującego reakcję immunochemiczną jest sensor do pomiaru stężenia glukozy.

W detekcji analitu wykorzystuje się immunochemiczną reakcję wypierania dekstranu z konkanawiliny A przez glukozę. Aby otrzymać mierzalny sygnał optyczny, dekstran znaczony jest fluoresceiną, a konkanawilina A immobilizowana jest do wewnętrznej powierzchni membrany dializyjnej, przepuszczającej selektywnie glukozę do wnętrza przestrzeni pomiarowej. W ten sposób konkanawilina znajduje się poza strefą oświetlenia z rdzenia. Wzrastające stężenie glukozy powoduje wypieranie dekstranu, który dyfunduje do ścieżki optycznej, gdzie wzbudzana jest fluoresceina. Tak więc wzrostowi stężenia glukozy towarzyszy wzrost intensywności emisji fluorescencji (rys.2.15).

 

Rysunek 2.15 Schemat optycznego sensora glukozy [Brzózka Z., 1999].

 

 

Innym rozwiązaniem w sensorach czułych na glukozę jest użycie fazy zawierającej oksydazę glukozy i fluorofor czuły na wygaszanie tlenu. Utlenianie glukozy, katalizowane przez oksydazę, wymaga udziału tlenu, którego zawartość redukowana jest proporcjonalnie do stężenia analitu.

PÓŁPRZEWODNIKOWA

Jedną z szeroko badanych i opracowywanych w ostatnim dwudziestoleciu grup czujników elektrochemicznych są sensory półprzewodnikowe, wykorzystujące tranzystory polowe jako przetworniki. Tranzystory polowe FET (field effect transistor) stały się interesującymi elementami przetwornikowymi ze względu na ich zdolność zbierania i wzmacniania sygnału, niosącego chemiczną informację o próbce, pochodzącego z warstwy receptorowej.

Przyczyną wyboru takiego przetwornika są przede wszystkim korzystne parametry metrologiczne (szybki czas odpowiedzi) oraz możliwość jego miniaturyzacji, przy zastosowaniu nowoczesnych technologii krzemowych układów scalonych, związanych z niskimi kosztami masowej produkcji.

Oprócz wymienionych cech, mają istotną korzystną właściwość, jaką jest duża rezystancja wejściowa rzędu 10¹⁰...10¹⁴ ၗ oraz mała rezystancja wyjściowa rzędu kilku - kilkunastu kiloomów, co zmniejsza wrażliwość na zakłócenia układów elektronicznych współpracujących z czujnikiem.

Również sterylizacja tych czujników jako elementów nie zawierających elektrolitów ciekłych jest łatwiejsza niż klasycznych elektrod jonoselektywnych. Ma to istotne znaczenie w zastosowaniach biomedycznych.

W ISFET-ach głównym elementem pomiarowym jest membrana jonowymienna, naniesiona na obszar bramkowy tranzystora (rys. 2.16).

 

Rysunek 2.16 Schemat tranzystorowego sensora pH. 1- elektroda odniesienia, 2- bramka, 3- izolator, 4- kanał, 5- membrana jonowymienna, S- źródło, D- dren, B- podłoże.

W tranzystorze polowym napięciowy sygnał sterujący jest przyłożony bezpośrednio do bramki. Do sterowania tranzystora typu ISFET za pomocą zewnętrznego napięcia konieczne jest zastosowanie elektrody odniesienia umieszczonej w tym samym co on roztworze. Jest ona tak zbudowana, że zapewnia utrzymanie stałej różnicy potencjałów między końcówką elektrody a elektrolitem.

Proces wymiany jonów między powierzchnią membrany a elektrolitem, będącym z nią w kontakcie, daje w wyniku skok potencjału na granicy faz membrana-roztwór. Selektywny pomiar aktywności określonych jonów, uzyskuje się dzięki doborowi materiału membrany zapewniającego wymianę tylko jednego rodzaju jonów, zwanych jonami głównymi lub determinującymi potencjał membrany. Wartość skokowa tego potencjału zależy od wielu czynników. Najważniejszym z nich są własności jonowymienne membrany. Ponadto wartość ta zależy od parametrów elektrycznych membrany i obecności w roztworze innych cząstek zarówno zjonizowanych jak i obojętnych.

Wartość potencjału na granicy roztwór - membrana można zmierzyć jak wspominałem stosując elektrodę odniesienia, która zapewnia stalą wartość skoku potencjału między tą elektrodą i elektrolitem. W układach z ISFET-em utrzymuje się w czasie pomiaru stałą wartość prądu drenu poprzez kompensowanie zmian napięcia roztwór - membrana, zmianą napięcia bramkowego Ugs. Sygnałem wyjściowym w ISFET-cie jest więc zmiana napięcia bramkowego Ugs jako funkcja aktywności mierzonych jonów.

Układ, którym można zrealizować ten pomiar to układ o wspólnym źródle (rys.2.17).

 

 

Rysunek 2.17 Schemat włączenia ISFET-a w układzie o wspólnym źródle [Torbicz W., 1991].

 

Przy pomiarach aktywności jonów za pomocą ISFET-ów stosuje się podobnie jak dla klasycznych elektrod jonoselektywnych, metodę porównania między sygnałem wyjściowym przy znanym pH (bufor) i tym sygnałem dla roztworu mierzonego. Oprócz rozważonego układu pomiarowego o wspólnym źródle istnieją inne układy zapewniające stałą wartość prądu drenu. Są to: układ wtórnika źródłowego i układ o oporze sterowanym (rys.2.18 a i b) [Torbicz W., 1991].

 

 

 

Rysunek 2.18 Schematy włączenia ISFET-a a) wtórnik źródłowy b) układ o rezystancji sterowanej napięciowo [Torbicz W., 1991].

 

Opracowano ISFET-y czułe na stężenia (aktywność) jonów wodorowych, potasowych, sodowych, wapniowych, chlorkowych, jodkowych, cyjankowych.

Mocznik jest końcowym produktem degradacji białek w organizmie człowieka. Oznaczenie stężenia mocznika we krwi ma znaczenie diagnostyczne między innymi przy ocenie wydolności nerek. Stężenie mocznika we krwi może być również wskaźnikiem kontrolnym przy pozanerkowym oczyszczaniu krwi w procesach dializy.

Metody oznaczenia mocznika można podzielić na dwie grupy: nieenzymatyczne i enzymatyczne. Nieenzymatyczne oznaczanie mocznika odbywa się najczęściej metodami spektrofotometrycznymi. Stosowanie tego typu pomiarów wymaga odpowiedniego przygotowania próbki, jak również stosunkowo drogiej aparatury pomiarowej.

Metody enzymatyczne polegają na pomiarze stężeń produktów reakcji hydrolizy mocznika, katalizowanej przez ureazę. Reakcja ta przebiega zgodnie z równaniem:

 

[Pijanowska D., 1999]

 

Wywołane reakcją enzymatyczną zmiany stężeń amoniaku i dwutlenku węgla, jak również pozostających z nimi w równowadze jonów amonowych, wodorowęglanowych i węglanowych oraz zmian pH są proporcjonalne do stężenia mocznika w roztworze próbki. Daje to możliwość zastosowania różnego typu czujników do detekcji produktów hydrolizy mocznika.

Jednym ze sposobów jest zastosowanie pH-ISFET-u. Polega on na związaniu w membranie ureazy, a następnie umieszczanie jej na bramce ISFET-u. Czujnik opracowany na bazie tranzystora FET w powiązaniu z enzymem jest nazywany ENFET-em.

Zastosowanie biosensorów do monitorowania procesów przemysłowych jest ważną i ekspansyjną dziedziną rozwoju. Biosensory można stosować jako ciągłe monitory do kontroli danego procesu, zarówno bezpośrednio przez układ samoregulujący się, jak i przez interwencję operatora. Takie monitory można stosować do ciągłej kontroli jakości wzdłuż strumienia procesowego. Korzyściami takich monitorów procesowych są: większa efektywność, lepsza jakość i konsystencja produktu oraz niższe koszty operacyjne.

Monitory in-line do bioreaktorów z bakteriami i komórkami zwierzęcymi wymagają sensorów, które są pozbawione zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Rozwój sterylizacji biosensorów napotyka na trudności ze względu na zbyt małą odporność immobilizowanych biokatalizatorów na warunki sterylizacji.

Alternatywą jest zastosowanie biosensora w wersji on-line, gdzie próbka jest:

1) automatycznie pobierana ze strumienia procesowego,

2) przygotowywana do analizy,

3) poddawana pomiarowi za pomocą sensora.

Rozwiązanie on-line można zaprojektować zarówno z enzymem immobili­zowanym na elemencie detekcyjnym, jak i na kolumnie, przez którą przepły­wa próbka. W tym drugim rozwiązaniu, generowany produkt lub inny substrat zużywany w trakcie przechodzenia przez kolumnę jest mierzony niemodyfiko­wanym sensorem. To rozwiązanie wydaje się mieć zaletę w możliwości od­dzielnego optymalizowania warunków reakcji biokatalitycznej i detekcji oraz wymiany materiału biologicznego.

Elektroda do oznaczania glukozy była pierwszą elektrodą enzymatycz­ną, którą szczegółowo opisano. Nadal jest najczęstszym przed­miotem publikacji naukowych. Jednak mimo wprowadzenia na rynek kilku elektrod tego typu oczekiwania zarówno przemysłu, jak i diagnos­tyki lekarskiej nie są w dalszym ciągu zaspokojone. Poza glukozą szczególne zainteresowanie wzbudzają prace na temat możliwości otrzymywania bioczujników do pomiaru stężenia takich cukrowców jak fruktoza, maltoza, sacharoza, laktoza.

Oznaczanie mono- i disachary­dów za pomocą metod chemicznych nie gwarantuje uzyskania dokład­nych danych. Nie są to bowiem metody specyficzne, a na wynik wpływa obecność wielu substancji redukujących. Sacharozy metodami chemicz­nymi w ogóle nie można oznaczyć, trzeba dokonać inwersji i to w taki sposób, aby na wynik nie wpłynęła obecność maltozy. Poszczególne cukry można oznaczyć za pomocą metod chromatograficznych, które jednak wymagają przeprowadzenia badanych cukrów w pochodne. Podobnie selektywne są metody mikrobiologiczne. Jednak wadą zarów­no metod chromatograficznych, jak i mikrobiologicznych jest ich praco-i czasochłonność.

Zastosowanie biosensorów w chemii klinicznej grupuje się wokół rozwoju urządzeń do analiz in vitro oraz do pomiarów stanów krytycznych. Systemy do pomiarów analitycznych są projektowane do użytku w miejscach takich, jak: izby przyjęć, sale operacyjne, ambulatoria, ambulanse i domy pacjentów. Urządzenia do pomiarów stanów krytycznych są projektowane do ciągłego monitorowania chemii krwi pacjentów w tym stanie i pozwalają na szybką odpowiedź co do nagłych zmian stanu pacjenta. Coraz częściej obserwuje się wykorzystywanie prostych elementów detekcyjnych (tj. amperometrycznych, potencjometrycznych lub światłowodowych) do konstruowania oprzyrządowa­nia chemii klinicznej. Wiele substancji, ważnych z punktu widzenia chemii klinicznej, jak: glukoza, mleczan, czy etanol, może być oznaczana amperomet­rycznie za pomocą biosensorów wykorzystujących tlenowe elektrody jako przetworniki i enzymy typu oksydaz immobilizowane w membranie. Niestety, nie są dostępne oksydazy dla wszystkich, ważnych klinicznie substancji, jak: moczan czy kreatynina. Tę lukę zapełniają biosensory z enzymami typu dea­minaza, jakkolwiek podjęto dopiero pierwsze próby opracowania amperomet­rycznego biosensora czułego na amoniak.

Znaczący postęp dokonał się w dziedzinie biosensorów implantowanych. Przykładem jest biosensor glukozowy, który zastosowany w sztucznej trzustce może być niezbędny w hospitalizacji diabetyków. Na razie istnieje jednak kilka istotnych barier, utrudniających rozwój biosensorów implantowanych, np.: biokompatybilność, stabilność biokatalityczna, czy problemy ciągłej kali­bracji in vivo. Wyraźne postępy osiągnięto w dziedzinie systemów monito­rowania „przyłóżkowego”, np. ex vivo sztucznej trzustki i w terapii diabe­tyków. Mało uwagi poświęcono zastosowaniu biosensorów w badaniach biomedy­cznych. W wielu przypadkach, małe selektywne sensory mogłyby być używane do ciągłego monitorowania stężenia biocząsteczek w czasie podstawowych badań. Wewnątrzkomórkowe i specyficzno-zewnątrzkomórkowe pomiary­ waż­nych biocząsteczek można przeprowadzić z pomocą mikrobiosensorów. Zasto­sowanie mikrobiosensorów do pomiaru przyswajalnych aminokwasów (neuro­transmiterów) jest jednym z przykładów tego typu.

W ochronie środowiska biosensory mogą być używane do detekcji i identyfikacji substancji toksycz­nych i mutagennych w otaczającym środowisku. Spadek aktywności immobili­zowanego biokatalizatora może być mierzony jako zmniejszenie się szybkości reakcji biokatalitycznej. Wielkość tego spadku jest proporcjonalna do stężenia właściwej trucizny. Ogólnie, izolowany biokatalizator enzymatyczny może być użyty jako wskaźnik klasy związków. Przykładem jest wykrywanie fosfora­nów organicznych, wykorzystujących inhibitowanie acetylocholinosterazy. Reakcję enzymatyczną można monitorować elektrodą pH, a szybkość reakcji jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia związków fosforoorganicznych.

Zjawisko inhibicji enzymu przez zanieczyszczenia środowiskowe zostało wykorzystane w licznych biosensorach elektrochemicznych, gdzie aktywna warstwa (membrana, film) immobilizowanego enzymu jest naniesiona na powierzchnię przetworników, jak np. elektrody pH, gazowe elektrody tlenowe lub dwutlenku węgla oraz inne elektrody jonoselektywne. Enzymy moż­na immobilizować przez proste zabezpieczenie membraną do dializy lub ko­walencyjne związanie z powierzchnią elektrody za pomocą np. aldehydu glutarowego. Krzywe odpowiedzi sensora w określonym zakresie stężenia substratu są porównywane z krzywymi odpowiedzi dla analogicznych próbek, ale zawierających również zanieczyszczenie.

Do oznaczania ogólnej toksyczności roztworu zastosowano biosensory bakte­ryjne. W tym przypadku, szybkość metabolizmu żyjących komórek bakterii jest monitorowana elektrodą tlenową. Kiedy poziom toksyczności rośnie, szybkość respiracji tych immobilizowanych komórek spada i mniej tlenu jest zużywane. Tak więc wzrost poziomu tlenu jest oznaką wzrostu toksyczności, a stopień spadku metabolizmu jest miarą tego wzrostu. Sensory tego typu nie są selektywne na określoną truciznę lub ich klasę, ale umożliwiają określenie ogólnego stopnia toksyczności badanej próbki.

Podstawową zaletą biosensorów czułych na mutageny, w porównaniu z me­todami konwencjonalnymi jest krótki czas analizy. Pomiar z użyciem biosenso­rów wymaga mniej czasu, ponieważ mikrobiologiczna respiracja jest kontrolo­wana w cienkiej warstwie komórek na końcówce elektrody, w przeciwieństwie do kontroli wzrostu komórek. Pomiary można wykonać w ciągu kilku godzin z użyciem biosensora, podczas gdy konwencjonalne metody (np. mikrobiolo­giczny test Amesa, stosowany powszechnie do oceny mutagenności lub kance­rogenności danej substancji lub czynnika) wymagają kilku dni. Dodatkowo, biosensory mogą określić znacznie niższy poziom stężeń mutagenów.

Przykładowe dolne granice wykrywalności to 0.001 i 10 ၭg/ml, odpowied­nio: dla biosensora i testu Amesa. Trzeba dodać, że działanie tych sensorów jest nieodwracalne i każdy pomiar wymaga nowego biosensora.

Toksyczność jest zjawiskiem biologicznym, a więc jej wykrywanie wymaga stosowania organizmów bezpośrednio kontaktujących się z nią. Śledzenie ogólnej aktywności metabolicznej lub zjawisk stanowiących integralną część procesów metabolicznych w komórce, ma wiele zalet w monitorowaniu trucizn. Zastosowanie amperometrycznych biosensorów z elektrodą tlenową do monito­rowania respiracji umożliwiło wykrywanie obecności trucizn w środowisku.

Badania biologiczne mają ugruntowaną pozycję w monitorowaniu środowi­ska i w określaniu toksyczności, jakkolwiek dobór organizmów i kryteria oceny wyników są ciągle dyskutowane. Mimo bezdyskusyjnej potrzeby pro­wadzenia takich badań stale uwzględnia się ich koszt, wymagany czas i po­trzeby laboratoryjne. Te czynniki są główną przeszkodą w szerszym stosowa­niu badań biologicznych w testowaniu nowych materiałów przenikających do środowiska.

Wzrastające potrzeby podniesienia ochrony środowiska wymuszają niejako konieczność opracowywania tanich, łatwych do użycia systemów testów eko­toksykologicznych, umożliwiających ich wykonanie zarówno w laboratorium, jak i w warunkach polowych.

Monitorowanie środowiska, zwłaszcza określanie toksyczności, wymaga szerokozakresowych urządzeń, w przeciwieństwie do systemów stosowanych w ochronie zdrowotnej. Ponadto istotny jest dobór składnika biologicznego i wykorzystywanie biologicznej organizacji na poziomie komórkowym. Takie rozwiązania stosowane są również w ekotoksykologii, wykorzystującej częś­ciej całe organizmy - od komórek bakterii do kręgowców niż biochemiczne testy in vivo.

Wykorzystanie chemicznych technik analitycznych do kontroli zanieczysz­czeń w środowisku jest kosztowne i ograniczone do testów laboratoryjnych. Koszt jest mniejszy kiedy wymagane jest ilościowe określenie znanego zanie­czyszczenia, jednak znacznie rośnie przy analizach jakościowych i ilościowych próbek wieloskładnikowych. Ciągłe monitorowanie środowiska, np. obecności zanieczyszczenia w wodach powierzchniowych lub powietrzu jest ograniczane do sytuacji, gdzie jest to znane zagrożenie, a zestawy kontrolno-pomiarowe są dostosowane do jego monitorowania.

Z kolei w testach toksyczności, analiza chemiczna jest mało pomocna, ponieważ szczegółowa informacja o składzie chemicznym może być tylko interpretowana przez toksykologa, a jeszcze mniej jest przydatna dla komplek­sowych próbek środowiskowych, mimo postępów metod specjacji. Toksycz­ność jest zjawiskiem biologicznym i ciągle jesteśmy na etapie korelowania wyników testów biologicznych z toksycznością związków chemicznych i ich mieszanin.

Biosensory mogące specyficznie oznaczać wybraną substancję są wykorzy­stywane jako diagnostyczne testy do kontroli określonego zanieczyszczenia, a biosensory szerokozakresowe są zdolne określać ogólne zmiany chemiczne w środowisku, głównie wywołujące zaburzenia w systemach biologicznych. Wyzwaniem dla technologów w rozwoju biosensorów będzie wprowadzanie stosownych układów biologicznych do systemów sensorowych, które pozwolą na monitorowanie efektu toksykologicznego względem składnika biologicznego.

Wszystkie systemy wy­korzystują katalityczne własności lub powinowactwo elementów biologicz­nych. Połączenie biologii z przetwornikiem jest najczęściej dyktowane danym zastosowaniem, jakkolwiek dla niektórych można wykorzystać kilka rozwią­zań. Stosowanie przetworników w biosensorach wybiegło technologicznie poza proste zanurzeniowe testery, wykorzystujące zmianę barwy w punkcie końcowym. Obecne opracowania pozwalają na akwizycję pomiaro­wą, przetwarzanie danych i przekazanie końcowej informacji do użytkownika wieloma sposobami, (np. proste alarmy wieloprogowe, numeryczne wartości, czasowo ważone średnie, czy graficzne prezentacje).

Obok relacji sygnał-szum i łatwości kalibracji, również niski koszt, przenośność, możliwość wkompono­wania w podręczny zestaw z elementami jednorazowego użytku, są głównymi kryteriami określającymi dobór przetwornika. Mimo iż przetworniki elektro­chemiczne lepiej spełniają te wymagania, to oczekuje się, że systemy optycz­ne staną się coraz bardziej konkurencyjne, z uwagi na możliwość miniaturyza­cji i niski koszt.

Rozwój biosensorów o potencjalnych zastosowaniach w monitorowaniu środowiska jest jeszcze głównie na etapie prac laboratoryjnych, ale tylko kwe­stią czasu jest ich przetworzenie w handlowo dostępne produkty. Dotyczy to zwłaszcza dwóch kierunków zastosowań biosensorów:

1) wykrywania specyficznych zanieczyszczeń w próbkach, zwykle za pomocą biosensorów enzymatycznych lub biopowinowactwa,

2) wykrywania nieoczekiwanych zmian w chemii środowiska, często w sytua­cjach on-line, zwykle za pomocą szerokozakresowych biosensorów z zasto­sowaniem preparatów komórkowych.

Dotychczas większość badań nad wykorzystaniem biosensorów w ochronie środowiska skupiała się nad przystosowaniem ich do monitorowania wód powierzchniowych. Wysoka specyficzność i czułość biosensorów enzymatycz­nych lub biopowinowactwa uzasadniała ich stosowanie do monitorowania znanych poziomów zanieczyszczeń. Z kolei biosensory wykorzystujące prepa­raty komórkowe z szerokozakresową czułością, umożliwiające wykrywanie nagłego, wypadkowego skażenia środowiska, będą mieć zastosowania w syste­mach on-line i ciągłego monitorowania. Znane są również opracowania, gdzie biosensor enzymatyczny służy do wykrywania ogólnej toksyczności zanie­czyszczenia, a biosensor wykorzystujący preparat komórkowy - do specyficz­nej detekcji wybranego zanieczyszczenia.

Przez ostatnie dziesięć lat można zaobserwować wiele kierunków badawczych, obejmujacych:

- zastosowanie przetworników on-line do monitorowania próbek biologicznych,

- wzrost zastosowań systemów mikrobiologicznych w określaniu toksyczności,

- wprowadzenie do sensorów mikrobiologicznych komórek,

- rozwój biosensorów mikrobiologicznych z dobrym czasem przechowywania i elementami jednorazowego użytku.

Rosnące zapotrzebowanie na szybkie oraz tanie procedury testowania tok­syczności i mutagenności mediów o różnym charakterze spowoduje komercja­lizację opracowanych już biosensorów. Przewiduje się wzrost zainteresowania innymi typami materiałów biologicznych do opracowania i konstrukcji senso­rów chemicznych, zwłaszcza w toksykologii, ekotoksykologii i farmakologii. Biosensory wykorzystujące enzymy i mikroorganizmy znajdują nowe zastosowania w analizie wody, monitorowaniu atmosfery, osadów i gleby, nazywanych kompleksowo monitorowaniem środowiska. Wiele badań dotyczy zasto­sowań tego typu biosensorów w monitorowaniu wdychanego powietrza, okreś­laniu stopnia zanieczyszczenia środowiska lub jakości gleby rolniczej (tabela 3.2) [Brzózka Z. 1999].

 

 

Oznaczana substancja	Element biologiczny	Przetwornik sensora/metoda
2,4-dinitrofenol	monoklonowe przeciwciała	elektroda potencjometryczna
Fenole	oksydaza polifenolowa	elektroda amperometryczna
azotany (III)	reduktaza azotynowi	sensor gazowy NH3
Naftalen	Pseudomonas + lux plasmid	fotowzmacniacz
Herbicydy triazynowe	mieszanina enzymów	spektrofotometr UV
formaldehyd	dehydrogenaza formaldehydowa	element piezoelektryczny
rtęć (II)	ureaza	elektroda gazowa COZ
fosforany organiczne	acetylocholinoesteraza	elektroda pH
metale ciężkie	ureaza	mikrokalorymetr
insektycydy karbamin.	acetylocholinoesteraza	światłowodowy sensor pH
herbicydy	Synechococcus	amperometria pośrednia
chlorofenole	Escherichia coli	amperometru pośrednia

 

Tabela 3.2 Biosensory do monitorowania środowiska [Brzózka Z., 1999].

---