LABORATORIUM Z BIOCHEMII

ćwiczenie nr 4

Temat: KWASY NUKLEINOWE

Wtorek 8¹⁵-12⁰⁰

Opiekun grupy :

Dr inż. A. Bujacz Marta Wujek

Aleksandra Kosiorek

Przemysław Woiński

Wstęp

Kwasy nukleinowe to wielocząsteczkowe polimery nukleotydów.

Wyróżniamy dwa kwasy: rybonukleinowe (RNA) oraz deoksyrybonukleinowe (DNA).

DNA ma postać podwójnej helisy. Zbudowany jest z dwóch łańcuchów nukleotydów, które biegną w przeciwnych kierunkach. Nukleotydy w DNA zawierają cukier deoksyrybozę i jedną z czterech zasad: adeninę(A), tyminę (T), cytozynę(C) oraz guaninę (G). Łańcuchy polinukleotydowe połączone są ze sobą wiązaniami wodorowymi między parami komplementarnych zasad (ilościowo: A = T i C ≡ G) i skręcone spiralnie.

RNA zbudowany jest zwykle z jednego łańcucha nukleotydów, ale w jego obrębie mogą występować odcinki podwójnej helisy, powstałe także dzięki wiązaniom wodorowym między parami komplementarnych zasad, z tym że zamiast tyminy występuje w RNA uracyl (U). Istnieje kilka rodzajów RNA, z których najważniejsze to: mRNA (informacyjny), tRNA (transportujący), rRNA (rybosomalny).

Kwasy nukleinowe odpowiadają za przechowywanie i przekazywanie informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów.

Nukleotyd jest podstawową jednostką strukturalną kwasów nukleinowych.Zbudowany jest z trzech podstawowych składników:

> pentozy (cukier zbudowany z 5 atomów C) - D-ryboza lub 2-deoksy-D-ryboza

>zasady azotowej - purynowej lub pirymidynowej

> reszty kwasu fosforowego.

1.Cukier występujący w kwasach nukleinowych jest pentozą należącą do aldoz. Wśród aldo-pentoz istnieje szereg izomerów przestrzennych. Pentoza występująca w kwasach nukleinowych jest rybozą.

W RNA ryboza występuje w formie niezmienionej, natomiast w DNA składnikiem cukrowym jest ryboza pozbawiona atomu tlenu przy węglu drugim cząsteczki, czyli deoksyryboza. Przykłady przedstawiam poniżej:

2.Zasada azotowa to związek organiczny posiadający skomplikowaną budowę cykliczną, zawierający w swoim składzie atomy azotu. Wymienia się 5 rodzajów zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych.

Dzieli się je na 2 grupy:

• zasady purynowe (pochodne heterocyklicznego związku puryny)

• zasady pirymidynowe (pochodne heterocyklicznego związku pirymidyny)

Przeprowadzone doświadczenia

1.Rozpuszczalnosć kwasów nukleinowych.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było badanie rozpuszczalności kwasów nukleinowych.

Opis wykonywanych czynności:

a)Do probówki zawierającej 0,5 ml 0,1% roztworu DNA dodawaliśmy kroplami 1M kwasu solnego, aż do momentu wytrącenia się osadu. Następnie dodawaliśmy również kroplami roztwór NaOH, który rozpuścił wcześniej wytrącony osad. Próbę wykonaliśmy także dla 0,1% roztwory RNA.

b)Do probówki zawierającej 1ml 0,1% roztworu DNA dodaliśmy 2ml 96% etanolu. Próbę wykonaliśmy również dla 0,1% roztworu RNA.

Obserwacje:

a)Podczas doświadczenia w probówce wytworzył się biały osad, który rozpuścił się po zalkalizowaniu.

b)Podczas doświadczenia w probówce z DNA i RNA wytrącił się biały osad.

Wnioski:

a) DNA i RNA jako kwasy nukleinowe nie rozpuszczają się w kwasach o czym świadczy powstanie osadu po dodaniu do probówek kwasu solnego, natomiast rozpuszczają się w środowisku alkalicznym - o czym świadczy rozpuszczenie się osadu po dodaniu NaOH.

b) W próbie z etanolem powstanie białego osadu dowodzi, iż kwasy nukleinowe dobrze wytrącają się w obecności alkoholi.

2.Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było uzyskanie hydrolizatów DNA i RNA, które służyły nam do dalszych doświadczeń.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki wlaliśmy 2,5 ml 1% roztworu DNA oraz 2,5 ml 10% H₂SO₄, a następnie ogrzewaliśmy mieszaninę we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę. Doświadczenie wykonaliśmy także dla 1% roztworu RNA.

Wnioski: Kwasy nukleinowe: DNA i RNA pod wpływem ogrzewania z kwasem siarkowym (VI) ulegają hydrolizie do wolnych zasad purynowych i nukleotydów pirymidynowych.

Po godzinie ogrzewania mogliśmy wykonywać następujące doświadczenia.

2.1. Reakcja orcynolowa.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było wykrycie pentoz w hydrolizatach kwasowych.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 1ml hydrolizatu RNA dodaliśmy 1ml odczynnika orcynolowego (zawierającego orcynę, stężony HCl oraz FeCl₃), a następnie ogrzewaliśmy przez 15 minut. Po upływie danego czasu ostudziliśmy mieszaninę i dodaliśmy 5 ml wody destylowanej.

Reakcje przeprowadziliśmy również dla hydrolizatu DNA, 0,1% roztworu DNA, 01,% roztworu RNA, 1% roztworu rybozy oraz 1% roztwory deoksyrybozy.

Obserwacje:

Po wykonaniu doświadczenia we wszystkich próbach powstały kompleksy o różnym odcieniu barwy zielonej.

Wnioski: Pentozy wolne (ryboza i deoksyryboza) oraz związane w nukleozydach (RNA i DNA) pod wpływem ogrzewania ze stężonym HCl przechodzą w furfural, który wraz z orcyną, katalizowany jonami Fe3+, tworzy trwały kompleks o zielonym zabarwieniu.

2.2.Reakcja Dischego.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było odróżnienie DNA od RNA.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 1 ml hydrolizatu RNA dodaliśmy 2 ml odczynnika difenyloaminowego , a następnie ogrzewaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut.Reakcje przeprowadziliśmy również dla hydrolizatu DNA, 0,1% roztworu DNA, 0,1% roztworu RNA, 1% roztworu rybozy oraz 1% roztwory deoksyrybozy.

Obserwacje:

W probówce z roztworem DNA i roztworem deoksyrybozy pojawiła się niebieski osad. W przypadku roztworu RNA i rybozy zabarwienia nie było.

Wnioski: Deoksyryboza i DNA w którym jest ona związana uległo barwnej reakcji z difenyloaminą dając niebieskie zabarwienie co odróżnia ją od rybozy. Ta barwna reakcja jest konsekwencją powstania aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem działania kwasu siarkowego i octowego (zawartych obok difenyloaminy w odczynniku difenyloaminowym).

2.3.Wykrywanie kwasu fosforowego.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było wykrycie kwasu fosforowego obecnego w kwasach nukleinowych.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 0,5 ml hydrolizatu DNA dodaliśmy 3 krople stężonego amoniaku w celu zobojętnienia. Następnie dodaliśmy 0,5 ml stężonego HNO₃ i 2 ml molibdenianu amonowego. Mieszaninę ogrzewaliśmy do wrzenia. Próbę wykonaliśmy dodatkowo dla hydrolizatu RNA.

Obserwacje:

Po wykonaniu doświadczenia w probówkach z roztworem RNA i DNA wytrącił się żółty osad.

Wnioski: Wytrącił się żółty osad fosfomolibdenianu amonowego co świadczy o obecności fosforanów w badanej próbie.

3.Wykrywanie zasad purynowych.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było wykrycie zasad purynowych obecnych w kwasach nukleinowych, tworzących sole z metalami ciężkimi takimi jak Ag⁺, lub Cu⁺.

Opis wykonywanych czynności:

Do probówki zawierającej 1 ml hydrolizaty DNA dodaliśmy 6 kropli stężonego amoniaku i 3 ml azotanu srebra. Po wytraceniu osadu dodaliśmy amoniaku w celu rozpuszczenia.

Obserwacje:

Po wykonaniu doświadczenia powstał biały osad, który się nie rozpuszczał w amoniaku.

Wnioski: Zasady azotowe reagują z jonami Ag⁺ tworząc nierozpuszczalne w amoniaku sole srebrowe puryn co świadczy o ich obecności w DNA.

4.Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia było oznaczenie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Opis wykonywanych czynności:

Do kolby odważyliśmy 5 g kostki bulionowej i dodaliśmy 75 ml wody. Mieszaninę gotowaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Po przestudzeniu roztwór przesączyliśmy przez gazę młyńską do 100 mililitrowej kolby i dopełniliśmy wodą destylowaną do kreski. Po dokładnym wymieszaniu mieszaninę ponownie sączyliśmy , ale przez sączek bibułowy. Przed wykonaniem pomiaru badany roztwór rozcieńczyliśmy 20-krotnie 0,1M kwasem solnym. Następnie za pomocą spektrometru wykonaliśmy pomiar absorbancji dla adeniny przy 262 nm i 290 nm, a dla guaniny przy 249 nm i 290 nm.

Produkt	ΔE262-290	ΔE249-290	adenina (μg/g)	guanina (μg/g)
1) Rosół warzywny Culineo	0,108	0,129	0,48	1,13
2) Rosół wołowy Kucharek	0,186	0,191	0,83	1,67
3) Rosół z kury Kucharek	0,167	0,198	0,74	1,73
4) Rosół z kury Knorr	0,179	0,156	0,80	1,37
5) Rosół wołowy Knorr	0,075	0,100	0,33	0,88
6) Bulion cielęcy Knorr	0,220	0,187	0,98	1,64
7) Rosół drobiowy Culineo	0,234	0,267	1,04	2,34
8) Rosół drobiowy Winiary	0,163	0,174	0,72	1,52

Obliczenia:

Dla adeniny:

ΔE_262-290 = 0,234

10µg/ml - 0,900

x - 0,234

Dla guaniny:

ΔE_249-292 = 0,267

10µg/ml - 0,457

x - 0,267

Wnioski:

Największą zawartość zasad purynowych (adeniny i guaniny) posiadają kostki rosołowe drobiowe Culineo, natomiast najmniejszą rosół wołowy Knorr.

Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową.

Ekstrakcja kwasów nukleinowych.

1. 10g tkanki zwierzęcej (wątroba),

2. 1g mleczu z ryb,

homogenizowaliśmy z 50ml zimnego 10% kwasu trójchlorooctowego. Homogenat odwirowaliśmy. W osadzie pozostają białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Superntant (ciecz nadosadowa) usunęliśmy, a do osadu dodaliśmy 30ml 0,6M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewaliśmy mieszaninę w ciągu 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 90^oC stale mieszając.. Po ostudzeniu odwirowaliśmy osad zawierający białko, a supernatant przenieśliśmy ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50ml. Zawartość kolby uzupełniliśmy kwasem nadchlorowym do kreski i dokładnie wymieszaliśmy.

1. 1ml ekstraktu kwasów nukleinowych i 1ml wody destylowanej (próba badana)

2. 1ml wzorcowego DNA (o stężeniu 200µg/ml) i 1ml wody destylowanej (próba wzorcowa)

3. 2ml wody destylowanej (próba odczynnikowa)

do każdej dodaliśmy po 4ml odczynnika difenyloaminowego. Wszystkie próby jednocześnie wstawiliśmy do wrzącej łaźni wodnej i inkubowaliśmy w ciągu 10 minut. Ochłodziliśmy próby i zmierzyliśmy absorbancję prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej na spektrokolorymetrze przy długości fali 600nm.

Wzorcowa próba kwasu DNA

Wątroba:

odczytana absorbancja - 0,183 (wartość średnia z 0,169, 0,167, 0,212)

Śledź:

Odczytana absorbancja: 0,462 (średnia wyliczona z wartości 0,466, 0,458)

Wnioski: Zawartość zasad purynowych w śledziu jest dużo większa niż w wątrobie.

5'

---