ZMIANY W UKŁADZIE BIAŁOKRWINKOWYM

1) ILOŚCIOWE

• wzrost liczby krwinek białych

• spadek liczby krwinek białych

2) JAKOŚCIOWE

• przy prawidłowej liczbie krwinek białych

• przy zmniejszonej liczbie krwinek białych

Zmiany ilościowe i jakościowe mogą być ze sobą sprzężone.

Nie w każdej białaczce jest leukocytoza! Znane są białaczki z obniżona liczbą krwinek białych.

Podział chorób układu białokrwinkowego:

• choroby układu białokrwinkowego

• choroby układu limfocytowego

Nie wyróżniamy chorób układy monocytowego, ponieważ przy takim podziale zaliczamy je do chorób układu granulocytowego, ponieważ maja wspólna komórkę macierzystą.

PODZIAŁ ZMIAN W UKŁADZIE BIAŁOKRWINKOWYM ZE WZGLĘDU NA:

1) przyczynę

• wrodzone (pierwotne)

• nabyte (wtórne, objawowe)

2) przebieg kliniczny

• choroby o przebiegu ostrym

• choroby o przebiegu przewlekłym (mogą przyjąć gwałtowny charakter, często na przemian następują poprawy i pogorszenia stanu pacjenta)

3) złośliwość

• choroby nierozrostowe, są to odczyny czyli zespoły odwracalne, po leczeniu chory zdrowieje

• choroby rozrostowe, są to zespoły nieodwracalne, nowotwory, nieleczone postępują

4) ilość i aktywność komórek

• stany zanikowe:

• aplazja (granulocyty,monocyty,limfocyty),

• hipoplazja (spadek liczby poniżej normy w szpiku i krwi obwodowej)

• towarzyszy im leukopenia

• stany rozrostowe

• hiperplazja

• towarzyszy leukocytoza, hiperleukocytoza

STANY ZANIKOWE W UKŁADZIE BIAŁOKRWINKOWYM

HIPOPLAZJA I APLAZJA KRWINEK BIAŁYCH

• hipoplazja to spadek liczby, a aplazja to zanik komórek utkania białokrwinkowego w szpiku

• najczęściej dotyczy komórek układu granulocytowego

• bez cech zwłóknienia

• bez tworzenia ognisk hematopoezy pozaszpikowej - stan, w którym są komórki w narządach wewnętrznych w takiej formie w jakiej występują w szpiku (np. śledziona jako narząd krwiotwórczy, ale u dorosłego człowieka)

W obrazie mikroskopowym przedstawiającym aplazję szpiku obserwujemy dużo tkanki tłuszczowej. Występuje także niedokrwistość, spadek ilości krwinek białych i trombocytów.

Aplazja i hipoplazja są wynikiem upośledzenia funkcji komórek macierzystych, z których wywodzą się granulocyty.

WE KRWI OBWODOWEJ:

• leukopenia

• spadek liczby granulocytów (granulocytopenia), które chronią przed zakażeniami bakteryjnymi więc chory ma obniżoną odporność

• zanik granulocytów-agranulocytoza

AGRANULOCYTOZA (AGRANULOCYTOSIS)

• zanik granulocytów we krwi obwodowej w wyniku:

• uszkodzenia komórek prekursorowych

• niszczenia dojrzałych granulocytów w szpiku i krwi obwodowej

• bezwzględna liczba granulocytów poniżej 5*10⁹/l

• nie zmienia się liczba

• erytrocytów

• płytek krwi

• najczęściej choroba ma tło immunologiczne

• częściej chorują kobiety

• Czynniki mogące wywołać agranulocytozę:

• leki :

• nadwrażliwość na leki,

• mielotoksyczne działanie leku,

• gwałtowna reakcja eliminacji granulocytów

• promieniowanie

• środki chemiczne

• zakażenia wirusowe

OBRAZ KLINICZNY AGRANULOCYTOZY

• objawy pojawiają się nagle i nasilają się szybko

• osłabienia

• dreszcze

• wysoka gorączka

• mogą być powiększone węzły chłonne i szyjne

• może być wstrząs septyczny

Zanim rozpocznie się leczenie, należy ustalić czynnik, który mógł wywołać agranulocytozę i ten czynnik powinno się wyeliminować.

LECZENIE AGRANULOCYTOZY:

• antybiotyki jako leki z wyboru

• masa granulocytarna (po ustaleniu przyczyny)

ROKOWANIE:

• jeżeli leczenie jest nieskuteczne, to w ciągu kilku dni lub tygodni następuje śmierć

• jeżeli chory reaguje na leki, a układ granulocytarny ulega regeneracji, to po 8-10 dniach pojawiają się w krążeniu granulocyty

LIMFOCYTOPENIE

• spadek liczby limfocytów poniżej 25% w leukogramie

• rodzaje:

• wrodzona

• nabyta

CHOROBY W KTÓRYCH WYSTĘPUJE LIMFOCYTOPENIA NABYTA:

• toczeń układowy

• mocznica

• ciężka gruźlica

• wczesna faza wstrząsu

• ziarnica złośliwa

STANY HIPERPLAZJI W UKLADZIE BIAŁOKRWINKOWYM

HIPERPLAZJE UKŁADU GRANULOCYTARNEGO

• wzrost liczby granulocytów - granulocytoza

• charakter hiperplazji

• pierwotny, samoistny - to wynik choroby proliferacyjnej

• wtórny, objawowy - to wynik działania czynnika stymulującego, po odstawieniu czynnika objawy ustępują

KREW OBWODOWA:

• leukocytoza

• najczęściej ma miejsce hiperplazja granulocytów

PRZYCZYNY NEUTROFILII

• wzmożone wytwarzanie w szpiku

• wydłużony czas przeżycia

• przejście z puli szpikowej do krwi

• przejście z puli brzeżnej do puli krążącej

• zmniejszone przechodzenie do tkanek (gdy krwinki są leniwe - retencja - gromadzą się)

STANY, W KTÓRYCH WYSTĘPUJE HIPERGRANULOCYTOZA

• zakażenia ostre i przewlekłe

• stany zapalne nie zakaźne

• oparzenia

• kolagenozy

• nadwrażliwości

• po operacjach

• choroby przemiany materii

• mocznica

• kwasica ketonowa w cukrzycy

• rzucawka w ginekologii

• zatrucia substancjami chemicznymi lub lekami

• ołów

• glikozydy naparstnicy

• insektycydy

• ostre krwotoki wewnętrzne

• ostra hemoliza

• powikłania poprzetoczeniowe

• choroby hemolityczne

• nowotwory złośliwe

• leczenie czynnikami, które pobudzają szpik

• MDS

EOZYNOFILIE

• odczynowe granulocyty kwasochłonne

• powyżej 0,04*10^9/l

• nadwrażliwość w tym alergie

Eozynofilie w:

1) zakażeniach pasożytami:

• robaki (tasiemce, glista)

• pierwotniaki(zarodziec malarii, toxoplasma gondii)

• stawonogi (świerzbowce)

2) chorobach krwi:

• ziarnica złośliwa

• czerwienica prawdziwa

• choroba Hodkina

3) chorobach zakaźnych

• odra

• płonica

• limfocytoza zakaźna

4) chorobach gruczołów dokrewnych

• niewydolność kory nadnerczy

5) niektórych nowotworach

• rak szyjki macicy

• rak tarczycy

• rak oskrzeli

6) zatruciach

• fosforem

• miedzią

7) po użądleniu

• pszczoły

• szerszenia

• niektórych pająków

BAZOFILIA

Bezwzględna liczba bazofilii przekracza 0.09 x10 ⁹/l

Ziarnistości różnej wielkości, inaczej niż u eozynofila.

STANY W KTÓRYCH WYSTĘPUJE BAZOFILIA

• choroby mieloproliferacyjne (ch. rozrostowe)

• alergie, zapalenia

CHOROBY ZAKAŹNE

• ospa wietrzna,

• grypa

• gruźlica

NIEKTÓRE NOWOTWORY

• nowotwory lite

• MDS

• przewlekłą białaczka szpikowa

CHOROBY UKŁADU DOKREWNEGO

• cukrzyca

• niedoczynność tarczycy

• przy leczeniu estrogenami

LIMFOCYTOZA

Wzrost liczby limfocytów ponad 4x 10⁹/l

RODZAJE LIMFOCYTOZY:

1) limfocytoza o prawidłowej morfologii

2) limfocytoza o nieprawidłowej morfologii

1):

• krztusiec

• przewlekłą białaczka limfat.

• makroglobulinemia Waldenstroema

• ostra limfocytoza zakaźna

• zespół dużych ziarnistości limfatycznych

LIMFOCYTOZA Z LIMF. O TYPOWEJ MORFOLOGII (STANY NIEZŁOŚLIWE)

• mononukleoza zakaźna

• zakażenia cytomegalowirusami

• inne choroby wirusowe

• toksoplazmoza

• odczyny alergiczne

LIMFOCYTOZA Z LIMF. O ATYPOWEJ MORFOLOGII (STANY ZŁOŚLIWE)

• chłoniaki ( ch. wywodzi się z ukł. limfatycznego)

• ostra białaczka limfoblastyczna ( popularna u małych dzieci)

• białaczka włochatokomórkowa

MONOCYTOZA

Wzrost liczby monocytów powyżej 0, 8 x 10⁹/l

WYSTĘPOWANIE MONOCYTOZY

• prawie wszystkie stany zapalne

• nowotwory

• gruźlica

• kolagenozy

• MDS

• zespoły mieloproliferacyjne , białaczki.

PLAZMOCYTOZA

• we krwi zdrowego człowieka nie ma plazmocytów.

• jest to stan, w którym plazmocyty pojawiają się we krwi

STANY, W KTÓRYCH POJAWIA SIĘ PLAZMOCYTOZA

• szpiczak plazmocytowy (plazmocytoma)

• białaczka plazmocytowa

• różyczka, ospa, odra

• przewlekłe zapalenia

• kolagenozy

• niektóre choroby wątroby

• mononukleoza zakaźna

ODCZYN BIAŁACZKOWY

Jest to stan, w którym:

• jest leukocytoza 20-50 x 10⁹/l

• we krwi obwodowej obecne są młodsze komórki mielocyty, metamielocyty (przesunięcie obrazu w lewo - odmłodzenie obrazu)

• w cięższych przypadkach mogą być jeszcze młodsze granulocyty.

ZE WZGLĘDU NA RODZAJ KOMÓRKI WYRÓŻNIAMY:

• odczyn szpikowy ( granulocyty, monocyty) zazwyczaj w zakażeniach bakteryjnych.

• odczyn limfocytowy (limfocyty) zazwyczaj w zakażeniach wirusowych.

NAJCZĘSTSZĄ PRZYCZYNĄ ODCZYNU BIAŁACZKOWEGO SĄ:

• ciężkie zakażenia np. gruźlica

• przerzuty nowotworu do szpiku, np. raki, chłoniaki

• choroby o podłożu immunologicznym: toczeń trzewny

INNE SYTUACJE, W KTÓRYCH MOŻE POJAWIĆ SIĘ ODCZYN BIAŁACZKOWY:

• ciąża

• u chorych na cukrzycę

• w nadczynności tarczycy

• reakcja poszczepienna

ODCZYN BIAŁACZKOWY A BIAŁACZKA

• odczyn białaczkowy może być mylony z białaczkami

WAŻNE!!!:

• Odczyn białaczkowy zawsze trzeba rozróżniać z białaczkami (obserwacja pacjenta, powtarzać badania w pewnych przedziałach czasowych)

CECHY ODCZYNU BIAŁACZKOWEGO:

• objawy ustępują po usunięciu przyczyny

• w cytoplazmie komórek:

• jest ziarnistość toksyczna

• obecna są ciałka Dohlego

• są wodniczki

• przesunięcie obrazu krwinek białych w lewo (odmłodzenie) mieszanego stopnia-> pałki i pojedyncze metamielocyty i nie ewoluują dalej

• brak zmian w szpiku

• towarzyszą ostre zakażenia

• leukocytoza umiarkowana 12-20 x 10⁹/l

• śledziona bez zmian wielkości

OBJAWY WSKAZUJĄCE NA BIAŁACZKĘ

• obecność pałeczek Auera ( w mieloblaście) ->przesunięcie obrazu w lewo

• obecność chromosomu Ph (Philadelphia)

• powiększona śledziona

• proces nieodwracalny

• znacznie przesunięcie obrazu w lewo (nawet do mieloblasta)

• wysoka leukocytoza

• zmniejszona lub zerowa aktywność fosfatazy zasadowej granulocytów

• zmiany w szpiku

• pogłębiające się objawy kliniczne

BIAŁACZKI

BIAŁACZKA SZPIKOWA PRZEWLEKŁA

Białaczki

• nieleczone, nieuchronnie prowadzą do śmierci

• choroby nowotworowe ukł. krwiotwórczego, dochodzi do niekontrolowanej proliferacji najczęściej 1 rodzaju krwinek białych z jednoczesnymi zaburzeniami:

• różnicowania

• dojrzewania

• funkcji kom.

BIAŁACZKI TO ZESPOŁY PROLIFERACYJNE

• mieloproliferacyjne

• limfoproliferacyjne

• Nieprawidłowe komórki uwalniane są ze szpiku kostnego oraz z innych tkanek krwiotwórczych do krwi obwodowej.

• Przemiana nowotworu zaczyna się od pojedynczej komórki i może nastąpić na każdym etapie rozwoju danej linii komórkowej

• We krwi obwodowej pojawiają się niedojrzałe komórki tego układu.

• Następuje akumulacja komórek nowotworowych co prowadzi do niewydolności układu

• Pojawiają się nacieki narządowe jako wynik hematopoezy pozaszpikowej (w innych narządach niż szpik kostny, węzły chłonne) śledziona, wątroba, (kiedyś czasowo pełniły tę funkcje)-> wtedy obraz szpiku i krwi obwodowej nie pasują do siebie.

ETIOLOGIA BIAŁACZEK

• nie ma 1 czynnika odpowiedzialnego za rozwój białaczek

CZYNNIKI WIĄZANE Z ROZWOJEM BIAŁACZEK

• promieniowanie jonizujące

• los ofiar w Hiroszimie i Nagasaki

• prześwietlenie kobiet w ciąży

• rentgenolodzy

• pacjenci dostający środki cieniujące

• środki chemiczne

• benzen

• cytostatyki ( stosowane w leczeniu, ale nie działają wybiórczo)

• rozpuszczalniki

• pestydcydy

Zmiany genetyczne

Myleoblastic

Promyelocytic t(15, 17)

Myleomonocytic (MK) mixed granulocytic and monocytic

CZYNNIKI I MECHANIZMY ZWIĄZANE Z BIAŁACZKAMI

• zaburzenie regularnego wzrostu komórek przez czynniki hematopoezy (regulujące ten proces np. EPO)

• wirusy onkogenne

• wirusy transformujące (retrowirusy)

• wirusy z grupy opryszczki

ROLA WIRUSA EPSTEIN-BARR

• w naszej szerokości geograficznej: mononukleoza zakaźna

• w Afryce równikowej ->chłoniak Burkita

• w Hong-Kongu -> rak jamy nosowo-gardłowej

BADANIA CYTOCHEMICZNE I CYTOENZYMATYCZNE W BIAŁACZKACH POMAGAJĄ:

• rozpoznać komórki

• ustalić stopień dojrzałości komórki

PODZIAŁ BIAŁACZEK:

tworzenie podziałów białaczek jest uzasadnione względami:

• dydaktycznymi

• klinicznymi

NAJBARDZIEJ PRZYDATNE PODZIAŁY BIAŁACZEK SĄ OPARTE NA OCENIE CECH MORFOLOGICZNYCH KOM:

• są najstarsze, sprawdzone, akceptowane

• są proste i łatwo dostępne

• wymagają oceny cytomorfologicznej preparatu

• ocena preparatu wymaga dużego doświadczenia

• wada: subiektywizm w ocenianiu

W ZALEŻNOŚCI OD PRZEWAGI OKREŚLONYCH KRWINEK BIAŁYCH WYRÓŻNIA SIĘ:

• białaczki szpikowe -> zespoły mieloproliferacyjne (Myelosis)

• białaczki limfatyczne ->zespoły limfoproliferacyjne (Lymphadenosis)

PODZIAŁ BIAŁACZEK ZE WZGLĘDU NA PRZEBIEG:

1. białaczki ostre (Acuta) - dynamika zmian jest bardzo szybka, nieleczona białaczka prowadzi w krótkim czasie do śmierci.

2. białaczki przewlekłe (Chronica) rozwijają się powoli

Do ostrych zespołów mieloproliferacyjnych należy:

• MLA -białaczka szpikowa ostra (myelosis Leucaemia acuta )

• LLA- białaczka limfoblastyczna ostra (Lymphadenosis leucaemia acuta )

Do przewlekłych zespołów mieloproliferacyjnych należy:

• MLC- białaczka szpikowa przewlekła (Myelosis Leucaemia chronica

• LLC- białaczka przewlekła limfatyczna (Lymphadenosis leucaemia chronica)

BIAŁACZKI DOROSŁYCH

Najszybciej chorują osoby w wieku 35-40 lat.

RODZAJE BIAŁACZEK DOROSŁYCH

• 50% białaczki ostre

• 40% białaczki szpikowe

• 10% białaczki ostre limfatyczne

• 50% białaczki przewlekłe

• 35% białaczki limfatyczne

• 15% białaczki szpikowe

BIAŁACZKI DZIECI- NAJCZĘŚCIEJ MIĘDZY 2-3 R.Ż

RODZAJE BIAŁACZEK U DZIECI:

• 80%ostre białaczki limfoblastyczne i niezróżnicowanokom.

• 10% ostre białaczki mieloblastyczne

• 5% ostre białaczki monocytowe

• 5% przewlekłe białaczki szpikowe

BIAŁACZKA SZPIKOWA PRZEWLEKŁA MLC( myelosis leukaemia chronica ;leukaemia granulocytica chronica)

Wg WHO: Białaczka szpikowa przewlekła należy do przewlekłych zespołów mieloproliferacyjnych

Do przewlekłych zespołów mieloprolif. należy także:

• nadkrwistość samoistna (prawdziwa)

• przewlekłe idiopatie, zwłóknienie szpiku

• nadpłytkowosć samoistna

CECHY MLC

• Niepohamowane hiperplazja ukł. granulocytowego

Stem cell

Myeloid stem cell

Myeloid blast

Ercs płytki monocyt granulocyt

• Spaczenie dojrzewania i różnicowania komórek

• metaplazja pozaszpikowa (wątroba i śledziona)

KONSEKWENCJĄ PROLIFERACJI UKŁ. GRANULOCYTOWEGO JEST STŁUMIENIE POZOSTAŁYCH UKŁADÓW Z WTÓRNĄ

• niedokrwistością

• trombocytopenią

NAJCZĘŚCIEJ CHORUJĄ LUDZIE

• między 45-60 rokiem życia

• częściej mężczyźni niż kobiety

• częściej mieszkańcy miast niż wsi

BIAŁACZKA SZPIKOWA PRZEWLEKŁA MLC

• Ma charakterystyczne zaburzenia chromosomowe - tzw. chromosom Philadelphia (Ph) na poziomie wielopotencjalnej komórki macierzystej

• Od momentu mutacji upływa 6-8 lat zanim pojawią się objawy kliniczne

CHROMOSOM PH

• Połączenie drugiego egzonu BCR na chromosomie 22 z egzonem genu ABL zlokalizowanym na długim ramieniu chromosomu 9

• Na 22 chromosomie powstaje hybryda BCR-ABL

WYSTĘPOWANIE CHROMOSOMU PH U CHORYCH NA MLC

• Ma go 90-95% chorych (Ph+)

• Niewielka grupa pacjentów nie ma chromosomu Ph (Ph-) - ta postać ma ostrzejszy przebieg kliniczny

ANOMALIA PH WYSTĘPUJE W

• Granulocytach

• Monocytach

• Komórkach układu czerwonokrwinkowego

• Komórkach układu płytko twórczego

• Limfocytach B

CHARAKTERYSTYCZNE CECHY MLC

• Zwiększenie masy proliferujących komórek układu granulocytowego

• Przechodzenie do krwi obwodowej niedojrzałych granulocytów

• Te granulocyty mają wydłużony czas przebywania w krążeniu

OBRAZ KLINICZNY MLC

• Ogólne osłabienie będące skutkiem anemizacji

• Stany podgorączkowe

• Poty

• Bóle kostne (mostek, kości długie)

• Skłonność do siniaków

• Podatność na zakażenia

• Bóle brzucha (powiększona śledziona)

WYNIKI BADAŃ LABORATORYJNYCH

• Leukocytoza 20-30x10^9/l

• Może też być leukocytoza 300-500x10^9/l

ROZMAZ KRWI OBWODOWEJ

• Ważne badanie

• Obraz przypomina prawidłowy szpik

• Wzrost liczby granulocytów, najczęściej obojętnochłonnych

• Przesunięcie obrazu granulocytów w lewo

• Morfologiczne zmiany granulocytów dotyczą:

• Jądra

• cytoplazmy

AKTYWNOŚĆ FOSFATAZY ALKALICZNEJ GRANULOCYTÓW FAG W KOMÓRKACH BIAŁACZKOWYCH

• W fazie przewlekłej choroby jest bardzo niska lub nieznaczna

• W fazie akceleracji i przełomu blastycznego obserwuje się wzrost aktywności

• Przełom blastyczny - obraz coraz mocniej przesuwa się w lewo pojawiają się coraz młodsze kom. i coraz więcej - rzut mieloblastyczny

ROZMAZ KRWI C.D.

• Granulocyty są na wszystkich szczeblach dojrzewania

• Blasty + Bazofilia→białaczka

Bazofile różnią się znacznie wielkością

• Mogą pojawić się granulocyty kwasochłonne

• Pojawiają się duże metamielocyty i pałki (tzw. metamielocyty Tempki-Browna)

• Limfopenia

• Mogą pojawić się erytroblasty

• Nadpłytkowość 400-500x10^9/l

• Mogą być płytki olbrzymie

SZPIK KOSTNY

• Potwierdza rozpoznanie

• Bogatokomórkowy

• Dominuje układ białokrwinkowy nad czerwonokrwinkowym 25:1

• Dominuje układ granulocytowy

• Przesunięcie obrazu granulocytów w lewo

• Stłumienie innych układów

• Zaznaczona jest bazofilia i eozynofilia

• Na początku wzrost liczby megakariocytów a potem spadek

• Wzrost liczby form podziałowych (mitoz)

ETAPY CHOROBY

• Faza wstępna - okres przedbiałaczkowy, przypuszczalnie trwa 3-5 lat

• Faza przewlekła - okres pełnoobjawowy, trwa całe lata (3-10?)

• Faza akceleracji - przyspieszenia

• Faza schyłkowa (blastyczna) - zaostrzenie blastyczne, tzw. rzut mieloblastyczny, zazwyczaj trwa kilka miesięcy (obraz przypomina ostrą białaczkę szpikową)

OKRES ZAOSTRZENIA

• Odmłodzenie obrazu

• Liczba komórek blastycznych we krwi i we szpiku >10%

• W okresie schyłkowym pojawia się rzut mieloblastyczny

• Gdy rzut to obraz przypomina:

• MLA(ostra białaczka szpikowa) 70-80% przypadków

• LLA (ostra białaczka limfoblastyczna)20-30% przypadków

PRZEBIEG CHOROBY KOMPLIKUJĄ

• Niedokrwistość

• Skaza małopłytkowa

• Zakażenia

• Oporność na leczenie

RZADZIEJ WYSTĘPUJĄCE BIAŁACZKI SZPIKOWE

• Kwasochłonna

• Zasadochłonna

PRZEWLEKŁA BIAŁACZKA SZPIKOWA KWASOCHŁONNA (MYELOSIS LEUCAEMIA EOSINOPHILICA CHRONICA)

• Występuje bardzo rzadko

• 60-80% stanowią eozynofile we wszystkich stadiach rozwojowych

• Leukocytoza

• Niedokrwistość i małopłytkowość

• Kończyć się może rzutem mieloblastycznym

PRZEWLEKŁA BIAŁACZKA SZPIKOWA ZASADOCHŁONNA (MYELOSIS LEUCAEMIA BASOCYTOPHILICA CHRONICA)

• Bardzo rzadka postać, występuje rzadziej niż kwasochłonna

• Hiperplazja granulocytów zasadochłonnych

• Na koniec rzut mieloblastyczny

BADANIA CYTOCHEMICZNE, IMMUNOLOGICZNE I GENETYCZNE

BADANIA SPECJALISTYCZNE STANOWIĄCE UZUPEŁNIENIE BADAŃ CYTOMORFOLOGICZNYCH

• Cytochemiczne

• Cytoenzymatyczne

• Immunologiczne

• Genetyczne

SŁUŻĄ DO

• Identyfikacji komórek

• Ustalenia stopnia dojrzałości komórek

• Oceny aktywności komórek

• Ustalenia zaburzeń metabolicznych na poziomie komórek

BADANIA CYTOCHEMICZNE

• Tymi metodami najczęściej barwi/bada się blasty w białaczkach

• Wykrywa się we krwi lub szpiku związki, które są w komórce

• Do ich wykonania potrzebne są rozmazy materiału biologicznego przygotowane na szkiełkach podstawowych

• Z każdej próbki badanego materiału należy sporządzić co najmniej 6 preparatów

PREPARATY DO BADAŃ CYTOENZYMATYCZNYCH I CYTOCHEMICZNYCH

• Cienkie rozmazy z krwi lub szpiku kostnego

• Preparat z osadu komórek z płynu mózgowo-rdzeniowego

• Preparat odbitkowy z węzła chłonnego

• Preparat z komórek po biopsji innego narządu, gdy podejrzewa się hematopoezę pozaszpikową

SUDAN CZARNY B BARWI

• Tłuszcze obojętne

• Fosfolipidy

• Cerebrozydy

WYNIKI BARWIENIA SUDANEM CZARNYM B

• w miejscu gdzie są lipidy występują zielonoczarne ziarnistości.

• najwięcej lipidów zawierają neutrofile.

• komórki dodatnie: od promielocyta do segmenta

Mieloblasty:

Są ujemne albo stwierdza się w nich kilka luźnych ziarenek zlokalizowanych koło jądra.

Promielocyty: (+) mają ziarnistości

Mielocyty i pozostałe komórki: mają coraz więcej grubszej ziarnistości. Stężenie lipidów wzrasta w miarę dojrzewania komórek.

Eozynofile: w całym szeregu dojrzewania ziarnistości są na obwodzie cytoplazmy z niezabarwionym centrum.

Bazofile: (+/-) reakcja zmienna od ujemnej do dodatniej

Monocyty: (-) lub zawierają drobną rozproszoną ziarnistość w części komórki

Limfocyty - (-)

Erytroblasty - (-)

Megakariocyty - (-)

REAKCJA Z SUDANEM CZARNYM B JEST POMOCNA W RÓŻNICOWANIU OSTRYCH BIAŁACZEK

• mieloblastycznych

• mielomonocytowych

• limfoblastycznych

W ostrej białaczce szpikowej ok. 5% blastów

W białaczce promielocytowej - ponad 7,5% komórek (+)

Brak reakcji w ostrej białaczce limfatycznej OBL (-)

REAKCJA PAS (Periodic Acid Schiff)

Pozwala wykryć w komórkach obecność glikogenu i kilka innych grup węglowodanów.

W warunkach fizjologicznych komórki krwi i szpiku zawierają głównie glikogen, innych cukrów jest niewiele.

W warunkach patologicznych w komórkach mogą pojawić się :

• glikopolisacharydy

• mukopolisacharydy

Reakcję PAS można wykonać metodą Mac Marusa z użyciem odczynnika Schiffa.

WYNIK REAKCJI PAS

• Czerwone ziarnistości w cytoplazmie w miejscu gdzie jest glikogen.

• W cytoplazmie pojawia się czerwone zabarwienie.

• Im więcej jest glikogenu w komórce tym intensywność zabarwienia większa.

Mieloblasty: mają jednolite czerwone wybarwienie cytoplazmy

Neutrofile: reakcja dyfuzyjna wzrasta wraz z dojrzewaniem od promielocyta (bardzo słaba) do segmenta (najsilniejsza)

Eozynofile: dodatnia dyfuzyjna

Bazofile: dość liczne ziarna

Im więcej jest glikogenu w komórce tym intensywność zabarwienia większa

Monocyty: drobne lub średnie ziarnistości

Limfocyty i komórki siateczki: zawierają niewielką ilość glikogenu

Megakariocyty: dość silna reakcja dyfuzyjna lub drobnoziarnista

REAKCJA PAS BADANIE KONTROLNE

• dodatni wynik reakcji PAS poza glikogenem dają także niektóre polisacharydy

• badanie kontrolne polega na przeprowadzeniu reakcji PAS w preparacie poddanym działaniu amylazy trawiącej wyłącznie glikogen

• jeżeli w preparacie kontrolnym po trawieniu nie stwierdza się obecności substancji PAS (+) można przyjąć, że dodatnia reakcja w badanym preparacie dotyczy tylko glikogenu

• reakcja PAS służy głównie do różnicowania ostrej białaczki limfoblastycznej i mieloblastycznej. W limfoblastach glikogen odkłada się w postaci ziarnistości

• limfoblasty w OBL „nie T, nie B” wykazują obecność dużej ilości materiału PAS (+)…

• limfoblasty w wariancie „T” OBL ziaren jest mało i są drobne, słabo zabarwione

REAKCJA PAS

• Przewlekła białaczka szpikowa (MLC):

W granulocytach reakcja jest osłabiona

• Białaczka limfatyczna (LLC) :

W limfocytach jest zwiększona zawartość glikogenu

Erytroblasty : prawidłowe erytroblasty nie zawierają glikogenu

W erytroleukemii i talasemiach : w erytroblastach stwierdza się obecność glikogenu

WYNIK REAKCJI PAS

• zaznaczyć odsetek blastów PAS (+)

• podać charakter reakcji :

• bloki ziarnistości

• gruba lub drobna ziarnistość

• reakcja dyfuzyjna

REAKCJA LEPEN'A

• pozwala ocenić proces hemoglobinizacji

• wykrywa hemoglobinę w krwinkach układu czerwonokrwinkowego

• kolor zielonkawy cytoplazmy wskazuje na obecność hemoglobiny

BADANIA CYTOENZYMATYCZNE

• ocenia się aktywność na poziomie komórek, a nie wykrywa się enzymu

• aktywność zależy od:

• typu komórki

• stopnia dojrzałości komórki

• aktywność enzymu wyraża się zmianą przyrostu produktów reakcji barwnej określonych substratów

AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW WYRAŻA SIĘ PRZEZ :

1. Podanie odsetka komórek dodatnich

2. Ustalenia stopnia nasilenia reakcji enzymatycznej :

• W skali (-) (+) (++) (+++) (++++)

• Za pomocą wskaźnika „score”

(-)	0 pkt
(+)	1 pkt
(++)	2 pkt
(+++)	3 pkt
(++++)	4 pkt

• Za pomocą skali „score” określa się tzw. total score

• Metoda polega na ustaleniu aktywności enzymu w skali 0-4 oceniając 100 kolejnych komórek

• Total score to suma iloczynów stopnia aktywności enzymu pomnożony przez liczbę komórek o tym samym stopniu aktywności

PRZYKŁAD OCENY AKTYWNOŚCI :

70	x aktywność 0	70 x0	=0
8	x aktywność 1	8 x 1	=8
10	x aktywność 2	10 x2	=20
12	x aktywność 3	12 x 3	=36
			=64

ENZYMY KTÓRYCH AKTYWNOŚĆ JEST BADANA

• Peroksydaza (POX)

• Esteraza nieswoista i swoista

• Fosfataza kwaśna

• Fosfataza alkaliczna granulocytów FAG

• Końcowa Transfera deoksynukleotydowa (TdT)

PEROKSYDAZA (POX)

Peroksydazy są lizosomalnymi enzymami hemoproteinowymi stanowiącymi część kompleksu prostetycznego żelazoporfiryny.

W obecności nadtlenku wodoru katalizuje utlenianie.

Metoda Grahama - Knolla do oceny aktywności POX. Jako substratu używa się benzydyny, która utlenia się. Komórki, które wykazują aktywność POX mają w cytoplazmie żółtobrązowe lub zielono-brunatne ziarnistości. Benzydyna, która jest substratem w reakcji POX ma właściwości potencjalnie rakotwórcze i trzeba z nią pracować ostrożnie.

WYSTĘPOWANIE POX

• Komórki macierzyste na ogół nie mają aktywności POX, wyjątkiem są pałeczki Auera.

W mieloblastach, które są POX (+)

• Neutrofile i Eozynofile - silnie dodatnia reakcja, gruba ziarnistość, od promielocyta do segmenta

• Bazofile - reakcja dodatnia w młodych i dojrzewających postaciach, a potem słabnie

• Monocyty nieliczne, delikatnie rozproszone ziarnistości, w części komórek brak reakcji POX (+/-)

• Limfoblasty, erytroblasty, megakariocyty: reakcja ujemna POX (-)

Badanie aktywności POX ma znaczenie w klasyfikacji ostrych białaczek.

Pomaga w różnicowaniu ostrej białaczki mieloblastycznej (+) i ostrej białaczki limfoblastycznej (-)

ESTERAZY

W diagnostyce hematologicznej najszersze zastosowanie znalazła metoda Lederera z użyciem jako substratów :

• Octanu α- naftylu

• Chloro octanu AS-D naftolu

Badanie przydatne do identyfikacji rozrostów schistiocytów i mieloblastów.

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ESTERAZ

• Esterazy należą do hydrolaz

1. BADANIE AKTYWNOŚCI ESTERAZY Z UŻYCIEM α- Naftylu

Wynik :

• jądra komórek są niebieskie

• aktywność esterazy widoczna jako ciemnobrązowe zabarwienie cytoplazmy

AKTYWNOŚĆ ESTERAZY α-Naftylu W KOMÓRCE

Wszystkie komórki układu czerwonokrwinkowego wykazują aktywność

• monocyty: najsilniejsza reakcja

• granulocyty (neutrofile)

• od promielocyta do segmenta

• pojedyncze mieloblasty czasem mają kilka ziarenek, więcej mogą mieć starsze mieloblasty

• limfocyty: słaba reakcja, pojawiają się ziarenka wokół jądra

• Eozynofile: reakcja (-)

• Bazofile: reakcja (-)

• Erytroblasty: punktowa reakcja (+) w części komórek

• Megakariocyty: reakcja (+) w większości komórek

ESTERAZA α-Naftylu:

Aktywność wykazują:

• Blasty w ostrej białaczce z limfocytów T

• Erytroblasty w zespole di Guglielmo

• Erytroblasty w niedokrwistości megaloblastycznej

2. Oznaczanie aktywności esterazy chloro octanu AS-D Naftolu :

• Barwienie metodą Fast Blue BB

• Wynik reakcji - niebieska ziarnistość

ESTERAZA AS-D Naftolu :

Aktywność enzymatyczną mają tylko niektóre komórki :

• Granulocyty od promielocyta w dół

Słaba lub brak:

• Monocyty

• Eozynofile

• Bazofile

• Plazmocyty

• Erytroblasty

• Megakariocyty

Prawidłowe Mieloblasty są zwykle ujemne, w niektórych przypadkach MLA :

• Mieloblasty są (+)

• Pałeczki Auera są (+)

AKTYWNOŚĆ PODWÓJNEJ ESTERAZY

• W jednym preparacie można jednocześnie oznaczać aktywność esterazy

• α-Naftylu

• AS-D naftolu

• Barwienie :

• Maślanem α-Naftylu

• Fast Blue BB

WYNIK BARWIENIA AKTYWNOŚCI PODWÓJNEJ ESTERAZY :

• Pomarańczowo-brązowe ziarnistości w miejscu występowania esterazy α-Naftylu i niebieskie ziarnistości Esterazy AS-D naftolu

FOSFATAZA KWAŚNA

• Enzym lizosomalny zdolny do działania w środowisku kwaśnym

• Występowanie: większość komórek jądrzastych krwi wykazuje jej aktywność

• Aktywność fosfatazy kwaśnej wykrywa się w komórce - w miejscu hydrolizy substratu przez enzym tworzy się z solą dwuazoniową nierozpuszczalny barwny produkt

AKTYWNOŚĆ MOŻNA BADAĆ NA 2 SPOSOBY

• Bez hamowania kwasem winowym

• Z hamowaniem kwasem winowym

KWAS WINOWY

• Blokuje izoenzymy od 1 do 4 fosfatazy kwaśnej

• Nie blokuje izoenzymu 5 (oporny)

KWAŚNA FOSFATAZA

• Oznaczanie fosfatazy kwaśnej opornej na działanie kwasu winowego jest pomocne w różnicowaniu białaczki włochatokomórkowej (hairy cell leukaemia)

• Struktury wykazujące odczyn oporny na blokowanie barwią się na kolor czerwony

AKTYWNOŚĆ FOSFATAZY KWAŚNEJ W KOMÓRKACH

• Silna :

• osteoklasty,

• makrofagi

• Mierna:

• Plazmocyty

• Megakariocyty

• monocyty

• Słaba :

• neutrofile (silniejsza reakcja (+ )w formach dojrzewających, słabsza w dojrzałych),

• eozyno file,

• bazofile

• Bardzo słaba:

• limfocyty,

• erytroblasty

Zwiększona aktywność fosfatazy kwaśnej

• Limfocyty - makroglobulinemia Waldenströma, mononukleoza zakaźna

• Limfoblasty T w białaczkach

Zmniejszona aktywność fosfatazy kwaśnej

• Limfoblasty B w chłoniakach złośliwych

Nie stwierdza się różnic aktywności enzymatycznej w plazmocytach osób zdrowych i plazmocytach osób ze szpiczakiem plazmocytowym.

FOSFATAZA ALKALICZNA GRANULOCYTÓW FAG

• Należy do enzymów hydrolitycznych związanych z cytoplazmą komórek

• Jest fosfomonoesterazą i ma zdolność rozszczepiania jednego wiązania estrowego

Ważne!

Aktywność FAG w komórkach krwi i szpiku nie pozostaje w żadnej korelacji z aktywnością fosfatazy alkalicznej w surowicy krwi.

METODA DWUFAZOWA OCENY AKTYWNOŚCI FAG

Etap I - hydroliza

• Kwaśny α-naftylofosforan jednosodowy ulega hydrolizie

• W reakcji powstaje wolny α-naftyl, jego ilość zależy od aktywności FAG

Etap II - sprzęganie

• Wolny α-naftyl ulega…

BARWIENIE FAG

Metoda dwufazowa

Wynik

• W cytoplazmie czerwona ziarnistość

FAG jest miarą dojrzałości granulocytów. Maksymalna aktywność FAG przy pH 9-10.

• Aktywność fosfatazy alkalicznej w komórkach

• Neutrofile - silna reakcja dodatnia wzrasta wraz z dojrzałością komórki

• Silna reakcja w granulocytach o jądrze podzielonym

• Czasem jest reakcja w granulocytach o jądrze pałeczkowatym i w meta mielocytach

• Młodsze postacie nie wykazują aktywności

Pozostałe komórki układu krwiotwórczego nie wykazują aktywności FAG.

AKTYWNOŚĆ FAG U OSÓB ZDROWYCH W POSZCZEGÓLNYCH KOMÓRKACH

• Dominuje aktywność 1

• Mniej komórek ma aktywność 2

• Nie spotyka się aktywności 4

Norma Instytutu Hematologii: total score 15-65. Każde laboratorium musi ustalić własną normę.

FOSFATAZA ALKALICZNA:

• 1 punkt - słaba reakcja dyfuzyjna lub pojedyncze ziarnistości

• 2 punkty - reakcja dyfuzyjna i nieliczne ziarnistości

• 3 punkty - silna reakcja z licznymi ziarnistościami

• 4 punkty - bardzo silna reakcja z gęstą ziarnistością zakrywającą jądro

ZASTOSOWANIE FAG

• Różnicowanie zespołów hematologicznych

• Określenie fazy choroby

• Ocena skuteczności leczenia

• Wykrywanie powikłań, głównie zakażeń

WAŻNE!

Wartość diagnostyczna fag jest ograniczona do przypadków przed leczeniem i bez zakażeń.

WZROST AKTYWNOŚCI FAG

• Kobiety w ciąży

• Okresy okołoporodowe

• Zakażenia ostre i przewlekłe (bez wirusowych) - bardzo duże wartości

• Urazy, zabiegi

• Leczenie ACTH i hormonami kory nadnerczy

• Aplazja szpiku

• Czerwienica prawdziwa - ponad 200

• Zwłóknienie szpiku - ponad 200

• Odczyn białaczkowy

• Nowotwory złośliwe

Wzrost aktywności w czerwienicy prawdziwej można wykorzystać do różnicowania z nadkrwistościami odczynowymi/objawowymi, w których aktywność FAG jest prawidłowa.

SPADEK AKTYWNOŚCI FAG

• Przewlekła białaczka szpikowa MLC (często 0)

• Nocna napadowa hemoglobinuria

• Mononukleoza zakaźna

• U osób narażonych na działanie :

• benzenu i

• promieniowania jonizującego

W MLA aktywność FAG może rosnąć lub maleć.

W zespołach rozrostowych układu chłonnego aktywność FAG jest niecharakterystyczna.

AKTYWNOŚĆ KOŃCOWEJ TRANSFERAZY DEOKSYNUKLEOTYDOWEJ TDT

WYSTĘPOWANIE

• Niedojrzałe komórki limfoidalne, głównie tymocyty (kom. bardzo młode/te, które są w grasicy lub niedawno ją opuściły)

• Mało zróżnicowane komórki szpiku bliskie komórce macierzystej

KLASYFIKACJA OSTRYCH BIAŁACZEK Z WYKORZYSTANIEM BADAŃ CYTOCHEMICZNYCH.

• Trudno według kryteriów cytologicznych rozróżnić białaczki ostre.

KLASYFIKACJA OSTRYCH BIAŁACZEK WEDŁUG LÖFFLERA

• Ma duże znaczenie kliniczne:

• Pozwala na dobór odpowiedniej terapii

• Daje możliwość przewidywania przebiegu choroby

• Pomocna przy ustaleniu rokowania

WEDŁUG LÖFFLERA 3 METODY SĄ WYSTARCZAJĄCE

• Reakcja PAS

• Reakcja POX

• Reakcja na esterazę z zastosowaniem α-naftylu jako substratu

STOSUJĄC TRZY METODY CYTOCHEMICZNE MOŻNA PODZIELIĆ BIAŁACZKI NA

1. Typ peroksydazowy POX

2. Typ peroksydazowo - esterazowy

3. Typ esterazowy

4. Typ PAS

5. Typ niezróżnicowany

1. TYP PEROKSYDAZOWY DZIELI SIĘ NA 3 GRUPY

1. Typ peroksydazowy 1 - 3-5% blastów POX (+)

2. Typ peroksydazowy 2 - 5-65% blastów POX (+)

3. Typ peroksydazowy 3 - >65% blastów POX (+)

2. TYP PEROKSYDAZOWO - ESTERAZOWY

• Obok blastów z dodatnią reakcją POX spotyka się od 25% do 49% blastów z dodatnią reakcją esterazową wykazujących aktywność (+++) lub (++++)

3. TYP ESTERAZOWY

• Ponad 50% blastów wykazuje aktywność esterazy (+++) lub (++++)

4. TYP PAS

• W komórkach blastycznych glikogen występuje w postaci ziarnistości

• Jednocześnie:

• POX (-)

• Esteraza nie może mieć (+++) lub (++++)

5. TYP NIEZRÓŻNICOWANY

• Nie stwierdza się dodatniej reakcji POX

• W komórkach macierzystych nie ma typowych ziaren glikogenu PAS

• Esteraza (+) lub (++)

PODZIAŁ CYTOCHEMICZNY BIAŁACZEK OSTRYCH ODPOWIADA NASTĘPUJĄCYM RODZAJOM CYTOMORFOLOGICZNYM

1. Białaczka mieloblastyczna - typ POX 1 i częściowo 2

2. Białaczka promielocytowa - typ POX 2 i 3

3. Białaczka mielomonocytowa - typ POX - esterazowy

4. Białaczka monocytowa - typ esterazowy

5. Białaczka limfoblastyczna - typ PAS

6. Białaczka niezróżnicowanokomórkowa

BADANIA GENETYCZNE

• U około 90-95% osób z MLC stwierdza się obecność chromosomu Ph w

• neutrofilach,

• erytroblastach i

• megakariocytach

BADANIA IMMUNOLOGICZNE W HEMATOLOGII. IMMUNOFENOTYP KOMÓRKI.

• Komórki układu krwiotwórczego mają na:

• błonie komórkowej

• w cytoplazmie

cząsteczki różnicowania CD (Cluster Diffirentiation)

• CD są charakterystyczne

• dla każdego szeregu komórek

• dla stopnia dojrzałości krwinek

Immunofenotyp komórek oznacza się metodą cystometrii przepływowej za pomocą przeciwciał monoklonalnych.

CHARAKTERYSTYCZNE MARKERY

• Komórki macierzyste CD34

• Granulocyty CD 13, CD15, CD17 HLA-DR

• Monocyty CD 14, CD 11a,b,c

• Erytroblasty CD 235, CD 236

• Megakariocyty CD41, CD42, CD62P

• Limfocyty T CD2, CD3, CD4, CD7, CD8

• Limfocyty B CD 10, CD19, CD20, CD22, CD79a

BIAŁACZKI OSTRE

CHARAKTERYSTYKA OGÓLNA BIAŁACZEK OSTRYCH

• Stanowią około 60% wszystkich białaczek

• Ostra białaczka jest chorobą nowotworową komórek bardzo młodych układu krwiotwórczego

KOMÓRKI BIAŁACZKOWE

• Zyskują zdolność niekontrolowanego namnażania się

• Równocześnie tracą zdolność dalszego różnicowania

• Zatrzymują się na szczeblu komórek niedojrzałych

• Następuje akumulacja komórek białaczkowych, co prowadzi do niewydolności układu krwiotwórczego

• Pojawiają się nacieki narządowe jako wynik hematopoezy pozaszpikowej

• Zarówno we krwi obwodowej jak i w szpiku dominują komórki bardzo młode - blasty.

• Mogą wyglądać jak krwinki prawidłowe

• Mogą być mocno zmienione (postacie para)

TYPOWA DLA BIAŁACZEK OSTRYCH JEST TZW. PRZERWA LEUKEMICZNA (HIATUS LEUCAEMICUS).

• W rozmazach krwi i szpiku:

• dominują komórki młode

• Brak stadiów pośrednich

• Niewiele jest komórek dojrzałych

PROCES NOWOTWOROWY DOPROWADZA DO

• Niewydolności układu krwiotwórczego

• Powstania objawów klinicznych

• Dynamika zmian jest bardzo szybka

• Białaczki, które nie są leczone w krótkim czasie mogą doprowadzić do śmierci

OBJAWY KLINICZNE

• Osłabienie, głównie z powodu rozwijającej się niedokrwistości

• Skaza krwotoczna małopłytkowa jako wynik upośledzenia funkcji układu płytkotwórczego

• Zdarzają się infekcje o ciężkim przebiegu z powodu spadku odporności w wyniku upośledzenia funkcji układu biało krwinkowego

• Około 50% chorych ma podwyższoną liczbę krwinek białych (leukocytoza)

• Około 25% chorych ma obniżoną liczbę krwinek białych - postać aleukemiczna

WAŻNE!

Ustalenie, która linia komórkowa uległa rozrostowi nowotworowemu i jaki jest stopień dojrzałości komórek białaczkowych.

NOWOTWOROWO ZMIENIONE KOMÓRKI

• Naciekają szpik kostny

• Pojawiają się we krwi obwodowej

• Naciekają także inne narządy (hematopoeza pozaszpikowa)

• Początek choroby jest skryty, może przebiegać bezobjawowo.

• Ważna rola leukogramu we wczesnej diagnostyce białaczek.

---