LABORATORIUM Z BIOTECHNOLOGII

Ćwiczenie nr. 4

Biosynteza proteinaz bakteryjnych w fermentorach

Biotechnologia grupa V

Piątek 8¹⁵-12^oo

Data oddania sprawozdania 03.04.2009r

Paweł Mróz

Karolina Kominiak

Sylwia Szymczak

Łukasz Pietrakiewicz

1. Wstęp teoretyczny.

Drobnoustroje, które stosowane są do produkcji enzymów mogą być hodowane dwoma metodami:

• powierzchniową- na pożywkach stałych lub płynnych w cienkiej warstwie

• wgłębną w dużych zamkniętych fermentorach przy intensywnym napowietrzaniu i mieszaniu.

Produkcję dzieli się na 2 etapy:

• proces biosyntezy enzymu

• proces jego wyodrębniania.

Biosyntezę prowadzi się przeważnie w oparciu o wgłębną, okresową hodowlę bakterii w klasycznych fermentorach w ciekłych pożywkach o ściśle określonym składzie i przy zastosowaniu specyficznych dla każdego szczepu warunków fizycznych i chemicznych. Skład pożywki dobiera się indywidualnie dla każdego gatunku, musi uwzględniać mechanizmy regulacji biosyntezy (represję) oraz być ekonomiczny.

Proteinazy - stanowią grupę enzymów proteolitycznych, która katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych oraz estrowych. Proteinazy są nierozerwalnie związane z całym życiem białek. Przetwarzanie białek przez proteinazy powoduje w rezultacie włączenie lub wyłączenie ich aktywności biologicznej. Najlepiej scharakteryzowaną grupą enzymów stanowią proteinazy serynowe. Powodem tego może być ich rola biologiczna oraz fakt, że stanowią one najliczniejszą grupę enzymów proteolitycznych występującą w przyrodzie. Oprócz pożytecznej funkcji proteolizy istnieją również związane z nią niebezpieczeństwa. W związku z powyższym, procesy te muszą być ściśle kontrolowane w określonym czasie i miejscu, tak, aby były pożądane i skuteczne. Jednym z mechanizmów kontroli proteolitycznej jest działanie inhibitorów proteinaz, obecnych we wszystkich znanych organizmach oraz w różnych tkankach tych organizmów.

Subtilizyny - alkaliczne proteinazy pozakomórkowe wytwarzane przez bakterie Bacillus

subtilis.

Bioreaktor (fermentor) - jest to urządzenie umożliwiające prowadzenie procesów mikrobiologicznych, enzymatycznych jak również hodowle komórek organizmów wielokomórkowych, skonstruowane w sposób umożliwiający, poprzez pomiar i regulację parametrów, kontrolę procesu produkcyjnego i jego optymalny przebieg, w warunkach maksymalnego ograniczenia lub całkowitego wyeliminowania możliwości zakażeń

W warunkach laboratoryjnych stosuje się bioreaktory o różnych pojemności roboczej.

Popularne są bioreaktory do hodowli wgłębnych, które zapewniają optymalne warunki mieszania i napowietrzania. Możemy w nim wyróżnić dwa typy mieszania: mikro mieszanie i makro mieszanie. Ważnym parametrem związanym z mieszaniem jest szybkość obrotu mieszadła. Mieszanie musi zapewniać dobre warunki wymiany gazowej. Jeżeli są te warunki spełnione, pozostałe parametry mieszania jak rozkład stężenia substratów, produktów oraz dyfuzja w podłożu nie stanowią czynników ograniczających szybkość procesu biologicznego lub zakłócających ich przebieg.

Poważnym problemem podczas hodowli drobnoustrojów jest tworzenie się piany. Piana jest heterogenicznym układem pęcherzyków gazu rozproszonych w malej ilości cieczy. Powstawanie i utrzymywanie się piany uzależnione są od składu i właściwości fizykochemicznych środowiska oraz od intensywności mieszania dwóch faz: gazowej i ciekłej. Substancje pianotwórcze wprowadzane są do środowiska fermentacyjnego w składzie surowców kompleksowych używanych do przygotowania podłoży. W czasie fermentacji skład chemiczny podłoża i jego właściwości fizykochemiczne ulegają zmianie, co w istotny sposób wpływa na pienienie się środowiska. Degradacja i asymilacja składników podłoża, zmiana pH, obniżenie się lepkości i wzrost napięcia powierzchniowego dają w efekcie redukcję pienistości, która po osiągnięciu trwającego krócej lub dłużej minimum, zazwyczaj ponownie wzrasta w końcowej fazie procesu. Przyczyną tego mogą być zarówno ulegające stopniowo rozkładowi składniki podłoża, wydzielane pozakomórkowo produkty metabolizmu użytego drobnoustroju, jak i degradacja składników biomasy zachodząca podczas autolizy komórek. Powstawanie piany i konieczność stosowania środków zapobiegających temu bywa przyczyną szeregu poważnych kłopotów natury technicznej, biologicznej i ekonomicznej:

• wzrost heterogeniczności środowiska

• utrudnienie lub wręcz uniemożliwienie kontroli stężenia składników podłoża oraz objętości hodowli

• zagrożenie wypienienia hodowli z bioreaktora oraz możliwość jego zainfekowania obcą mikroflorą

• obniżenie pojemności użytkowej bioreaktora o 30 — 50%,

• konieczność stosowania odpowiedniego oprzyrządowania przeciwdziałającego pienieniu się hodowli

• przechodzenie śladowych ilości substancji przeciwpianowych do produktów,

• pogorszenie się warunków natlenienia środowiska na skutek wprowadzenia środków przeciwpianowych,

• niekorzystny ich wpływu na morfologię i fizjologię drobnoustrojów.

Efektywność odpieniania zależy od właściwości fizykochemicznych, zarówno

środka przeciwpianowego, jak i substancji pianotwórczych oraz od wzajemnego stosunku ilościowego w układzie. Wprowadzenie środka odpieniającego do hodowli powoduje okresowe pogarszanie się rozpuszczalności tlenu, warunków jego transportu z fazy gazowej do podłoża oraz blokowanie powierzchni komórek drobnoustrojów. Dobór środka przeciwpianowego uzależniony jest od składu podłoża, użytego drobnoustroju i produkowanego metabolitu. Jest on dokonywany doświadczalnie, metodą prób. Oprócz chemicznych mamy również szereg rozwiązań pozwalających na mechaniczne niszczenie piany.

Przykładowy bioreaktor

Hodowla w fermentorze

Przed rozpoczęciem pracy należy wysterylizować fermentor i wszystkie elementy potrzebne nam do pracy, sterylizacja przebiega w temperaturze 121^oC, pod ciśnieniem 1 atm przez określony czas. Po ochłodzeniu do temperatury hodowli, pH pożywki koryguje się do wskazanej wartości i wprowadzamy inokulum (10-20% objętości fermentora)-luzujemy króciec wlotowy, opalamy zwojem waty nasyconej spirytusem i otwieramy, opalamy szyjkę kolby z inokulum nad palnikiem, wlewamy inokulum do fermentora i natychmiast zamykamy króciec wlotowy (do dużych fermentorów produkcyjnych otrzymanie koniecznej ilości inokulum wymaga kilkuetapowego namnażania: probówka kolbamały fermentor (15dm³)duży fermentor(3m³)główny fermentor produkcyjny ).

Fermentory wyposażone są w układ zapobiegający nadmiernemu powstawaniu piany

• odpieniacze chemiczne - zmniejszają napięcie powierzchniowe cieczy; działają one na powierzchni cieczy, rozpuszczając się w niej. Tak wiec ich działanie nie jest długie

• odpieniacze mechaniczne (zbijacz mechaniczny)- w postaci dwóch stożków, które mają na swoim obwodzie płytki, piana jest zbijana, tworzy się ciecz, która zrasza pianę i ta jest zbijana. Przeważnie są montowane w górnej części fermentora.

W fermentorach są czujniki, które informują o wysokim poziomie piany i zostaje uruchomiony wtedy mechaniczny odpieniacz. Jeśli on nie pomoże to zostaje uruchomiony chemiczny odpieniacz.

Fermentor po określonym czasie hodowli opróżnia się ,ciecz pohodowlaną poddaje określonej obróbce, fermentor czyści się i proces zaczyna się od nowa.

2. Cel ćwiczenia

Badanie dynamiki biosyntezy proteinaz przez szczep Bacillus subtilis oraz poznanie ogólnych zasad prowadzenia hodowli drobnoustrojów w fermentorach.

3. Materiały i metody

W ćwiczeniu stosowaliśmy szczep Bacillus subtilis. Szczep przechowywany jest na podłożu stałym w temperaturze 4^oC. Materiał posiewowy do zaszczepienia inokulum stanowi biomasa bakteryjna uaktywniona w 24-godzinnej hodowli statystycznej w temperaturze 37⁰C. Inokulum otrzymuje się prze 21-24-godzinną hodowle wstrząsaną bakterii na pod…łożu N w kolbach kulistych, płaskodennych o poj. 500 ml zawierających 100 ml pożywki w temperaturze 30^oC.

Oznaczanie zmętnienia

Pomiar zmętnienia umożliwia monitorowanie wzrostu w fermentorze.

Wykonanie ćwiczenia:

Do wykonania oznaczenia posiadaliśmy 6 probówek, z których każda była pobrana po określonym czasie hodowli wgłębnej ( 24h, 36h, 48h, 54h, 62h, 72h). Wszystkie próby rozcieńczyliśmy 20-krotnie. Pobieraliśmy 0,5 ml cieczy i dodaliśmy 9,5 ml wody destylowanej i mierzyliśmy absorbancję na „spekolu” przy długości fali 660 nm; próbą kontrolną była woda.

Na podstawie otrzymanych wyników wyznaczonej absorbancji obliczyliśmy zmętnienie dla poszczególnych próbek ze wzoru.

OD₆₆₀=A₆₆₀×R

R - rozcieńczenie próby

A₆₆₀ - absorbancja

OD₆₆₀ - gęstość optyczna (zmętnienie)

Tabela 1.Wyniki przedstawione są w tabeli poniżej (wyniki te dotyczą jedynie mojej grupy).

Próby pobrane po określonych godz. hodowli	Przyrost biomasy A660	Rozcieńczenie R	Zmętnienie OD660
24h	0,087	x 20	1,74
36h	0,425	x 20	8,5
48h	0,470	x 20	9,4

Oznaczanie aktywności proteinaz metodą Ansona

Do oznaczenia korzystaliśmy z tych samych prób, pobranych po określonym czasie hodowli wgłębnej ( 24h, 36h, 48h, 54h, 62h, 72h). Na każdą próbę robiliśmy jedna próbę badaną i jedną kontrolną.

• Próba właściwa:

Do probówki wprowadziliśmy 1ml substratu- hemoglobiny, której pH wynosiło 10,2 i 0,2 ml enzymu( jest to ciecz hodowlana po rozcieńczeniu 20-krotnym) i pozostawiliśmy na 10min (aby zaszła reakcja enzymatyczna) Po tym czasie dodaliśmy 2 ml kwasu trójchlorooctowego (TCA, który zatrzymuje reakcje i powoduje denaturacje białka). Następnie mieszaninę dokładnie wymieszaliśmy i odstawiliśmy na 30 min w temperaturze pokojowej. Po upływie tego czasu każda próba została przesączona

• Próba kontrolna:

Do probówki wprowadziliśmy 1 ml hemoglobiny o pH=10,2 i 2 ml kwasu trójchlorooctowego (TCA). Próbkę dokładnie wymieszaliśmy i pozostawiliśmy na 3 min w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dodaliśmy 0,2 ml enzymu, całość została dokładnie wymieszana i odstawiona na 30 min a następnie przesączona.

Otrzymane filtraty (próby właściwej i kontrolnej) użyliśmy do reakcji z odczynnikiem Folina.

• Próba właściwa:

Do 1ml filtratu dodaliśmy 2ml NaOH i dokładnie wymieszaliśmy a następnie 0,6ml odczynnika Folina i ponownie wymieszaliśmy i odstawiliśmy na 10 min. Ostatnią czynnością było zmierzenie absorbancji na „spekolu” każdej z prób właściwych wobec odpowiadającej jej próbie kontrolnej przy długości fali 690nm.

• Próba kontrolna:

Analogicznie jak próba właściwa.

Na podstawie otrzymanych wyników absorbancji obliczyliśmy aktywność proteinaz A_10,2 dla każdej z prób ze wzoru:

A_10,2=K×ΔE₆₉₀×R

gdzie:

A - jest to taka ilość enzymu która w standardowych warunkach uwalnia z tyrozyny w ciągu 1 minuty taką ilość produktów rozpuszczalnych w TCA.

R- rozcieńczenie

K- współczynnik, który pozwala na przeliczenie absorbancji na µmol_tyrozyny/(min×ml) =0,75

E₆₉₀ - różnica ekstynkcji próby właściwej i kontrolnej

Moja grupa zajmowała się hodowlą 24h, 36h, 48h. Oto jedno z przykładowych obliczeń

24h hodowla

E₆₉₀=0,090

R=20

K=0,75

A_10,2= 0,75× 0,090× 20 = 1,35

Tabela 2.Wyniki przedstawione są w tabeli poniżej (wyniki te dotyczą jedynie mojej grupy).

Próby pobrane po określonych godz. hodowli	Absorbancja E690	Współczynnik K	Rozcieńczenie R	Aktywność A10,2
24h	0,090	0,75	x 20	1,35
36h	0,120	0,75	x 20	1,80
48h	0,190	0,75	x 20	2,85

Tabela 3.Wyniki całej grupy zamieszczam w tabeli poniżej.

Próby pobrane po określonych godz. hodowli	Absorbancja A660		R	Biomasa OD660= A660×R	Absorbancja E690		R	Aktywność A10,2
24h	0,080 0,087	Średnia 0,0835	20	1,67 odrzucam	0,090 0,075 0,145	Średnia 0,103	20	2,06
		0,120 0,106		Średnia 0,113						2,26
	36h	0,420 0,425		Średnia 0,4225					20	8,45	0,120	Średnia 0,120	20	2,4
		0,510 0,490		Średnia 0,500						10 odrzucam
	48h	0,500 0,470		Średnia 0,485					20	9,7	0,130 0,132 0,175	Średnia 0,145	20	2,9
		0,650 0,590		Średnia 0,620						12,4 odrzucam
	54h	0,480 0,480		Średnia 0,480					20	9,6	0,160 0,160 0,140	Średnia 0,153	20	3,06
		0,580 0,590		Średnia 0,585						11,7 odrzucam
	62h	0,450 0,600		Średnia 0,525					20	10,5	0,150 0,220	Średnia 0,240	20	3,7
		0,580 0,670		Średnia 0,625						12,5 odrzucam
	72h	0,430 0,650		Średnia 0,540					20	10,8 odrzucam	0,190 0,210 0,150	Średnia 0,183	20	3,66
		0,590 0,610		Średnia 0,600						12

OD₆₆₀ - Zmętnienie

A_10,2 - Aktywność proteolityczna

W kolumnie pt Absorbancja E₆₉₀ znajduje się różna ilość wyników, wynika to z tego ze były duże rozbieżności i część z nich odrzuciłem. Wyniki pogrubione posłużą mi do sporządzenia wykresów

Wykres 1. Zależność zmętnienia (OD₆₆₀) i aktywności proteolitycznej (A_10,2) od czasu hodowli (t)

4. Wnioski

W naszym doświadczeniu możemy zaobserwować wzrost zmętnienia. Oznaczenie zmętnienia dało nam możliwość określenia wzrostu biomasy. Największy jej przyrost przypada na hodowle w przedziale 24h - 36h.

Hemoglobina użyta w oznaczeniu aktywności metodą Ansona była już zneutralizowana mocznikiem, ponieważ taka hemoglobina jest bardziej podatna na degradacje proteolityczną. Hemoglobina odczepia produkty rozpuszczalne w kawasie trójchlorooctowym, w których zawartość tyrozyny oznacza się fenolowym odczynnikiem Folina-Ciocalteu. Kwas trójchlorooctowy denaturuje hemoglobinę (jak można było zauważyć podczas doświadczenia) W próbie kontrolnej od razu do hemoglobiny dodajemy kwasu trójchlorooctowego, żeby całkowicie zdenaturować ją przed dodaniem enzymu.

Z naszego doświadczenia wynika, że największy przyrost aktywności proteinazy jest w godzinach od 54 do 62, natomiast w pozostałych godzinach jest bardzo podobny i dość niski. Uważam ze wynik ten nie jest do końca prawidłowy, ponieważ uważam ze największy przyrost aktywności proteolitycznej powinien przypadać na hodowle nieco młodsze.

9

---