Wykład III - 14.11.2011
PODSTAWY GENETYCZNE I MOLEKULARNE MECHANIZMÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA NADWRAŻLIWOŚĆ NA PROMIENIOWANIE
KOMPLEKS MRN I AKTYWADCJA ATM
MRE11-RAD50-NBS1
Powyżej ATM jako sensor
CZY MY, W TYM POMIESZCZENIU JESTEŚMY TAK SAMO WRAŻLIWI NA PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE?
Mamy różną indywidualną radiowrażliwość na promieniowanie jonizujące
Ta radiowrażliwość różni się także pomiędzy gatunkami oraz komórkami z różnych organów
PRZEŻYWALNOŚĆ KOMÓREK (CLONOGENIC SURVIVAL)
Taka sama ilość komórek na płytkę
Napromieniowanie (X-ray)
Inkubacja ~~10 dni
Barwienie i liczenie koloni
METODY POMIARU RADIOWRAŻLIWOŚCI
TESTY BIOLOGICZNE (LIMFOCYTY, FIBROBLASTY)
Przeżywalność komórek po IR
Aberracje chromosomowe indukowane przez IR
Radiooporna synteza DNA (RDS pukt kontrolny fazy S)
Genomowe wide podejście (DNA arrays proteomics)
WYKRYWANIE USZKODZEŃ dna
Początkowy i końcowy poziom uszkodzeń (PFGE, metoda kometowa, Lucja DNA, zastosowanie przeciwciał z fluorochromami)
CHOROBY ZWIĄZANE Z RADIOWRAŻLIWOŚCIĄ
RS syndromy są bardzo rzadkie: 1:40.000 do 1:300.000
RS heterozygoty wys™epują znacznie częściej
Jaka jest ich częstotliwość?
Czy są one bardziej wrażliwe na IR i czy częściej chorują na nowotwory?
SKRAJNE PRZYPADKI (RZADKIE SYNDROMY)Ataksja teleangiektazja ATM
Zespół łamliwości Nijmegen NBS1 rozpoznanie I HR
Zespół podobny to AT MRE11Syndrom ligazy IV LIG4
RS-SCID syndrom (Artemis) NHEJ
Cemunnous
ŁAGHODNIEJSZE PRZYPADKI - częstsze
2-10% pacjentów nowotworowych po radioterapii wykazuje w normalnych tkankach opóźnioną toksyczną reakcję na promieniowanie
RADIOWRAŻLIWOŚĆ I RADIOTERAPIA
EFEKTY UBOCZNE RADIOTERAPII
Nowotwory wtórne
2-10% pacjentów wykazuje późne groźne efekty radioterapii
Wiedza o wrażliwości danego osobnika optymalna radioterapia
ATAKSJA TELEANGIEKTAZJA
AT-pierwszy RS syndrom
Odkryty przez Syllaba and Henner w 1926
Ponownie odkryty przez Louis-Bar w 1941
Dobrze opisany przez E.Boder w 1956 (AT) (radiowrażliwość AT nie była znana do roku 1975
Gottof i WSP. W 1967, Morgan i WSP. W 1968 - nadmierna radiowrażliwość śmierć pacjentów AT
M. Taylor i WSP. W 1975 odkryli radiowrażliwość fibroblastów uzyskanych od pacjentów AT
Pacjenci AT wykazują radiowrażliwość
Jeden z zespołów łamliwości chromosomów
Charakterystycznym objawem neurologicznym jest ataksja móżdżkowa objawiająca się chwiejnym chodem, brakiem koordynacji mięśniowej i postępującym upośledzeniem umysłowym
Teleangiektazja - rozszerzenie niewielkich naczyń krwionośnych
AT dotyka wiele systemów ciała przede wszystkim układ nerwowy i immunologiczny oraz skórę
10% wzrost prawdopodobieństwa zachorowań na nowotwory u pacjentów AT rozwijają się nowotwory złośliwe i mają podwyższone ryzyko rozwoju białaczek i chłoniaków
AT NA POZIOMIE KOMÓRKOWYM
Niestabilność chromosomalna - łamliwość chromosomów
Radiowrażliwość
RDS
PRZEŻYWALNOŚĆ KOMÓREK
Niezdolność do zahamowania syntezy DNA po ekspozycji komórek na promieniowanie jonizujące lub radiomimetyki
Zaburzeni cyklu komórkowego prowadzi do radioopornej syntezy DNA (RDS)
ATAKSJA TELEANGIEKTAZJA (AT)
Zmapowanie geny AT - chromosom # 11q23 w 1988r
Sklonowanie genu ATM (AT-Mutated) w 1995r
Jaka jest funkcja ATM?
ATM - kinaza białkowa należąca do grupy kinaz podobnych do kinaz fosfatydylo-3-inozytolu (PIKK) (#11q23. ~~150kb genomowego DNA; 350 kDabiałko)
ATM fosforylacja wielu różnych białek
Identyfikacja wielu różnych substratów tej kinazy tłumaczy szeroki zakres różnorodnych fizjologicznych nieprawidłowości występujących w przypadku niefunkcjonalnego produktu genu ATM
Jaka jest rola ATM w procesie naprawy DNA i radiowrażliwości?
ZESPÓŁ ŁAMLIWOŚCI NIJMEGEN (NBS) NIJMEGEN BREAKAGE SYNDROME
NBS - autosomalna recesywna choroba związana z chromosomalną niestabilnością
OBJAWY KLINICZNE
Małogłowie
Niskorosłość
Ptasia twarz
Zaburzenia odporności
Predyspozycja do rozwoju nowotworów u pacjentów, głownie chłoniaków i białaczek
Niewielkie od średniego stopnia upośledzenie umysłowe
NOWOTWORY
Guzy lite (medulloblastoma - rdzenia)
Nowotwory limfoidalne
B-cell
T-cell
Ziarnica złośliwa (chłoniak Hodkina)
Anemia
AML, ALL
100 razy większe ryzyko zachorowania na Chłoniami <20 roku życia
POZIOM KOMÓRKOWY
Niestabilność chromosomalna
Radiowrażliwość
RDS
ROZPOZNANIE
Identyfikacja Nijmegen breakage syndrome
Zmapowanie genu na chromosomie 8q21 by przez zespół Sperlinga nieznany gen
Identyfikacja genu NBS1
W 1998 r dwie różne grupy zidentyfikowały odpowiedzialny gen:
Badanie sprzężeń (linkage studiem) (Sperling i wsp.) nieznany gen
Analiza kompleksu białka RAD50 w naprawie DBS przez HR (RAD50/Mre11/p95) (Petrini i WSP.)
Nazwy genu defektywnego w NBS: p95; NBS1 lub Nibrin (#8q21,3)
Gene NBS1
Lokus 8q21.3
Bałko nibryna (=p95; =Nbs1)
Mutacje 657del5 (90%)
mutacja załozcyielska
90% pacjentów jest zarejestrowanych w International Nijmegen Breakage Syndrome Registry
Częstość występowania osobników heterozygotycznych - 1/177 w Polsce Czechach i Ukrainie
BUDOWA GENU NBS1 I BIAŁKA NBS1
NBS! Jest częścią kompleksu Mre11/Rad50 bniorącego udział w odpowiedzi komórki na DBS
Domena BRCT odpowiada za naprawę DNA oraz kontrolę cyklu komórkowego (BRCA1 carboxyl terminus)
Mutacje w NBS1:
657del5 / 698del4(GB) / 835del4(I) / 842insT(Mex) / 900ddel25(I) / 976C>T(NL) / 1142delC(Can)
W ponad 90% przypadkach wystepuje delecja 5pz w eksonie 6 (657del5) - mutacja słowiańska
POZOSTAŁE BIAŁKA KOMPLEKSU MRN, FUNKCJA KOMPLEKSU
Rozpoznanie uszkodzenia DSB
Naprawa DSB
Kontrola cyklu komórkowego
ZESPÓŁ PODOBNY DO AT - ATAXIA TELEANGIECTASIA LIKE DISORDER (ATLD)
Odkryty w 1999r
Objawy podobne do AT (AT-like) - pacjenci nie mają mutacji w genie ATM (teleangiektazja - NIE)
Pacjenci ATLD maja mutacje w genie MRE11 (#11q21)
Kompleks białek RAD50/MRE11/NBS1
KOMPLEKS MRN - CHOROBY
MRE11/RAD50/NBS1
AT-like disorder (ATLD) zmutowany gen MRE11
NBS zmutowany gen NBS1
Wariant NBS zmutowany gen RAD50
MECHANIZMY NAPRAWY DSB
Homologiczna rekombinacja HR - S, G2
Niehomologiczne łączenie końców NHEJ - G1, S, G2
Pojedyncze wydłużanie końców SSA - poboczne
HOMOLOGICZNA REKOMBINACJA (HR)
Rodzina białek Rad51:
Rad51
Xrcc2
Xrcc3
Rad51B
Rad51C
Rad51D
BRCA2 jest związane z HR i oddziałuje z RAD51 centralnym białkiem HR
W odpowiedzi na uszkodzenia DNA w jadrze komórkowym s formowane Rad51 - foci
MUTANTY Z USZKODZONĄ HR
Wrażliwe na czynniki uszkadzające DNA (Cls)
Uszkodzony proces tworzenia RAD51 foci
Zwiększony poziom aberracji chromosomalnych niestabilność chromosomalna
GENE |
KO MOUSE |
X-RAY |
PATIENTS |
NBS1 |
Lethal |
+ |
NBS |
Mre11 |
Lethal |
+ |
ATLD |
BRCA1 |
Lethal |
+ |
? |
BRCA2 |
Lethal |
+ |
FA-D1 |
Rad50 |
Lethal |
+ |
? |
Rad51 |
Lethal |
+ |
? |
Rad51 paralogs |
Lethal |
+ |
? |
XRCC2 |
lethal |
+ |
? |
XRCC3 |
Lethal? |
+ |
? |
Rad54 |
viable |
V midly sensitive |
? |
Rad52 |
viable |
Not sensitive |
? |
ROLA HOMOLOGICZNEJ REKOMBINACJI (HR)
Naprawa uszkodzeń DNA indukowanych przez promieniowanie jonizujące oraz związki sieciujące DNA - wrażliwość na te czynniki
Proliferacja komórek (replikacja)
letalność mutantów
Hypomorficzne mutanty komórek chomika chińskiego (XRCC2, XRCC3, RAD51C I BRCA2; BRCA2 w FA)
GENY SUPRESOROWE BRCA1 I BRCA2
Mutacje nowotwory piersi, jajnika, prostaty i trzustki
U nosicieli - 80% ryzyko zachorowania na raka piersi
Homozygoty BRCA1/2 - niestabilność chromosomalna, uszkodzona naprawa DSB
Heterozygoty - wzrost ryzyka zachorowania na nowotwory. Jeżeli na skutek mutacji zostanie utracony lub zmutowany dziki allel genu nowotwór
GENY BRCA1 I BRCA2 - GENY SUPRESOROWE
BRCA1 - lokalizacja na 17q21, mutacje w genie (ponad 600) wiążą się z dziedzicznymi nowotworami sutka, jajnika, gruczołu krokowego i trzustki
Ryzyko dla nosicielek mutacji BRCA1: 35%-50% dla raka sutka i 15% dla raka jajnika
BRCA2 - lokalizacja na chromosomie 13q, ponad 450 zidentyfikowanych mutacji, białko spełnia podobne funkcje jak BRCA1, dwie zmutowane kopie genu (homozygota) są przyczyną anemii Fanconiego (gen FAND1)
Ryzyko dla nosicielek mutacji BRCA2 20%-35% dla raka sutka i 15%-30% dla raka jajnika
NOWOTWORY PIERSI
Najczęstsze nowotwory wśród kobiet, 22% wszystkich nowotworów
Dominująca przyczyna zgonów u kobiet (po raku płuc), 15% ogółu zgonów
Dwa typy nowotworów piersi
Sporadyczny (90-95%)
Dziedziczny (5-10%: min BRCA1, BRCA2, ATM)
Ponad połowa dziedzicznych przypadków raka sutka jest związana z mutacjami w genach BRCA1 i BRCA2 (geny wysokiej penetracji)
Komórki z mutacjami w genie BRCA1 i BRCA2 (homozygoty) mają upośledzoną naprawę przez hiomologiczna rekombinację HR (są bardzo wrażliwe na mutacje wprowadzane przez te czynniki) niestabilność genomu i niekontrolowana proliferacja
Haploinfusicjencja -
ROLA GENÓW BRCA1 i BRCA2
Naprawa DNA (naprawa DSB - HR) BRCA1/PALB2/BRCA2 i Rad51/CtlP/kompleks MRN;
Regulacja transkrypcji;
Regulacja cyklu komórkowego; największa aktywność w fazie S cyklu komórkowego;
Konieczne w rozwoju organizmu - letalność.
INHIBITORY PARP W LECZENIU RAKA U PACJENTÓW Z MUTACJAMI W BRCA
IN VITRO
Komórki homozygoty z mutacjami w BRCA1 lub BRCA2 100 - 1000 razy bardzie wrażliwe na inhibitory PARP niż heterozygoty i dzikie komórki.
POLI(ADP-RYBOZO)POLIMERAZA (PARP)
PARP - rodzina 18 enzymów katalizujących reakcję przyłączania negatywnie naładowanych cząsteczek poli (ADP-rybozy) do białek, substratem tej reakcji jest NAD+ (mono-, poliADPrybozylacja);
Przyłączanie polimerów PAR uaktywnia białka, zaangażowane w różne procesy, takie jak np.:
Modyfikacja chromatyny;
Naprawa pęknięć DNA;
Apoptoza;
Metabolizm energetyczny;
Regulacja transkrypcji;
Stabilizacja genomu.
INHIBITORY PARP
Pierwsze inhibitory: analogi nikotynamidu; 3-aminobenzamid (3-AB) zwiększenie efektu genotoksycznego czynników metylujących w białaczkach u gryzoni
Te wyniki zasugerowały, że inhibitory PARP mogą być wykożystane w terapii antynowotworowej.;
Inhibitory PARP mogą być wykorzystane w terapii antynowotworowej.
Wyszukiwarka