Biologia Molekularna dla studentów III roku Farmacji

Zagadnienia wymagane do zaliczenia seminariów.

• Enzymy stosowane w technologii rekombinacji DNA (TR DNA); sondy molekularne.

Technologia rekombinacyjna DNA

1. Wytwarzanie fragmentów DNA przy pomocy specyficznych sekwencyjnie endonukleaz

2. Wbudowanie fragmentów DNA do odpowiednich wektorów takich jak plazmidy, fagi, sztuczne chromosomy

3. Wprowadzenie wektora do komórki (zwykle E.coli) umożliwia produkcję klonów z licznymi kopiami zrekombinowanych fragmentów DNA

4. Identyfikacja, selekcja i charakterystyka zrekombinów klonów - Southern blotting, hybrydyzacja ze znakowanymi sondami specyficznymi dla danego genu

5. Enzymatyczna amplifikacja In vitro zastępuje klonowanie umożliwiające produkcję dużej ilości specyficznych sekwencji DNA w krótkim czasie.

BAM HI	GGATCC CCTAGG	Baccilus amyloliquae faciens H
Eco RI	GAATTC CTTAAG	E.coli RY13
HpaI	GTTAAC CAATTG	Haemophilus parainfluenca
Taq	TCGA AGCT

6. Mikropromotory genetyczne umożliwiają analizę porównawczą ekspresji wielu genów równocześnie

7. Nowe geny wprowadzone do komórki eukariotycznej mogą ulegać ekspresji

Wybrane endonukleazy restrykcyjne:

Nacinają określone sekwencje,

generując lepkie końce.

ENZYM		ZASTOSOWANIE
Fosfataza alkoholowa	Defosforylacja końca 5`DNA i RNA	Usuwanie grup 5`P przed znakow dla uniknięcia samospecyficzności
Nukleaza BAL3	Degradacja końca 3`, 5`	Progresywne skracanie cząsteczki DNA
Polimeraza DNAI(fragment Klebnowa)	Synteza dwuniciowego DNA

Inne enzymy stosowane w technologii rekombinacyjnej DNA:

Nick translation

Technika znakowania DNA oparta na zastosowaniu zdolności polimerazy z E.coli do degradowania nici DNA, która została nacięta i do jej resyntezy; zastosowanie radioaktywności trifosforanów nukleotydów spowoduje wyznakowanie nowo syntetyzowanej nici.

Sondy molekularne

• Sonda molekularna - segment 1-niciowego DNA lub RNA uprzednio wyznakowany znacznikiem radioaktywnym (³²P-nick translation) lub biochemicznym (biotyna).

• Sonda wykrywa sekwencje komplementarne w obecności dużej ilości niekomplementarnego DNA.

2. Wektory w TR DNA, zastosowanie, przykłady.

1. Wektorem może być zdolna do autonomicznej replikacji, niewielka cząsteczka dobrze scharakteryzowana fizycznie i genetycznie.

2. Wektor powinien zawierać markery pozwalające na wyróżnienie komórek, w których się znajduje.

3. Cząsteczka DNA stanowiąca wektor powinna mieć miejsce rozpoznania i nacinania przez co najmniej 1 z enzymów restrykcyjnych.

4. Wektory replikujące się niezależnie od organizmu gospodarza nazywane są replikonami.

Zrekombinowane wektory DNA

WEKTOR	POCHODZENIE	WIELKOŚĆ INSERTU [kpz]
Plazmid wielokopiowy	różne plazmidy wielokopiowe	20+
Wektor fagowy λ	bakteriofag λ	30
Kosmid	bakteriofag λ	40
Sztuczny chromosom bakteryjny (BAC)	duży plazmid bakteryjny	100-300
Sztuczny chromosom drożdżowy	chromosom drożdżowy	100-1000+

Wykorzystanie wektora

W wyniku nacięcia kolistego plazmidu przez endonukleazy np. EcoRI generowane są fragmenty z lepkimi końcami. Nacięci ludzkiego DNA np. również przez EcoRI generuje fragmenty z lepkimi końcami komplementarne do tych bakteryjnych. Są one łączone przez ligazy.

3. Metody wprowadzania DNA do komórki, klonowanie.

Metody wprowadzania transgenu

1. Użycie zrekombinowanych wektorów

• krótkie odcinki DNA [np. plazmid wielokopiowy, sztuczny chromosom P1(PAC), plazmid T1( rośliny)]

• blokada ekspresji genu antysensowym cDNA - stosuje się komplementarny, antysensowy cDNA, powstają 2 - niciowe DNA, które mogą tworzyć dimer, ale nie mogą podlegać translacji np. wyciszanie genów odpowiedzialnych za produkcję O2 w owocach

• wykorzystuje się głównie w przypadku roślin

2. Mikroiniekcja do przedjądrza

• wymaga przeprowadzenia naturalnego zapłodnienia in vitro, materiał genetyczny wstrzykuje się do komórki (zwykle do przedjądrza męskiego). Nie ma w tej metodzie ograniczeń gatunkowych.

3. Użycie pierwotnych komórek zarodka - Stem Cells - SM

• Możliwość hodowli i selekcji in vitro

• Komórki totipotencjalne

• Można je wprowadzać do jam zarodków

• W warunkach in vitro można selekcjonować komórki

• Powstaje mysz chimeryczna, mająca cechy 2 matek

4. Klonowanie somatyczne

• Jądra komórek somatycznych umieszcza się oocycie pozbawionym własnego jądra

• Może być stosowana u ssaków

5. Transpozony

• Odcinki chromosomów, które potrafią się z nich wycinać i wielokrotnie wstawiać do innych chromosomów

• Stosowana głównie od uzyskiwania transgenicznych owadów, może być stosowana u ssaków

6. Biobalistyka

• Wprowadzanie DNA

Stosowana głównie do otrzymywania transgenicznych roślin

4. Sekwencjonowanie DNA.

Sekwencjonowanie

1. Przygotowanie określonych fragmentów DNA lub RNA mających znacznik na określonym końcu, tym samym dla wszystkich fragmentów.

2. Drugi koniec również winien zawierać 1 z 4 nukleotydów

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów pozwala na odczytanie sekwencji

4. Fragment o długości 47 pz kończy się G

48 pz kończy się A

49 pz kończy się T

Sekwencja ………GAT…

Podstawowe metody sekwencjonowania

TECHNIKA	WSPÓLNY KONIEC	ZNACZNIK	SPECYFICZNY NUKLEOTYDOWY KONIEC
DNA Maxim&Gilbert	Restrykcyjna endonukleaza	^32P	Specyficzne zasadowo nacinanie chemiczne
DNA Singer	Primer dla polimerazy DNA	^32P lub fluorescencyjne	Zakończenie łańcucha przez dideoksynukleotyd
RNA........	Naturalny koniec RNA	^32P	Nacinanie specyficzne nukleotydowo

5. cDNA - otrzymywanie, zastosowanie.

Reprodukcja cDNA

• Matryca: mRNA.

• Do układu dodajemy aktywne prekursory.

• Primerem jest sekwencja komplementarna do poliA (sekwencja poliT).

• Dodajemy odwrotną transkryptazę

• Powstaje kopia na matrycy mRNA (cDNA) - hybryda

• RNA pozbywamy się przez alkaliczną hydrolizę lub kontrolowaną denaturację.

• Dodajemy nukleotydy

• Starterem jest utworzona „spinka do włosów”

• Fragment Klebnowa stosujemy jako polimerazę

• Odcinamy „spinkę do włosów”.

• Otrzymujemy 2-niciowy cDNA, pozbawiony eksonów.

cDNA - komplementarne DNA, nie zawiera intronów

Różnice między kodem genetycznym mitochondrialnym i jądrowym.

By powstało funkcjonalne białko: modyfikacje postrranslacyjne, składanie białek

Poziomy regulacji

Model operonu obrazuje indukcję ekspresji genu przez czynnik środowiskowy

6. Organizacja genomu u Eukariota.

Organizacja genomu u Eucaryota

• Sekwencje kodujące stanowią tylko ok. 2% genomu

• Sekwencje powtórzone - satelitarny DNA - mogą być rozproszone lub występować w blokach (tandemowo) ułożonych jeden za drugim.

Podział

• Makrosatelity i midisatelity - zawierają ok. 40 - 5000 par zasad ułożonych tandemowo

• Minisatelity - 9 - 80 par zasad

• Mikrosatelity - 1- 8 par zasad, zwykle ułożonych tandemowo.

Mikro- i mini- satelity charakteryzują się dużą zmiennością osobniczą, polimorfizm pod względem liczby kopii i sekwencji

Klasyfikacja wg Singera

1. SINES - krótkie 130 - 300 par zasad, powtarzające się z reguły tandemowo sekwencje rozproszone

2. LINES - długie 60 - 7000 par zasad, powtarzające się sekwencje rozproszone

Genom mitochondrialny

• Kolisty

• Brak histonów

• Koduje białka mitochondrialne (reduktaza NADH, cyt b)

• Podatny na mutacje

Proteom

• Określa poziom informacji funkcjonalnej, która obejmuje typ, funkcje i oddziaływanie białek tworzących funkcjonalną jednostkę (komórkę).

• Proteom w przeciwieństwie do genomu nie stanowi trwałej charakterystyki komórki, zmienia się wraz z typem komórki, etapem rozwoju i warunków środowiska.

Transkrypton - cały zestaw mRNA, nie zawiera intronów

Metabolon - wszystkie metabolity tworzące przez tę komórkę

Geny mozaikowe - mieszanina domen kodujących (eksony) i niekodujące (introny).

FINGER PRINT - genetyczny odcisk palca danego osobnika.

7. Fazy i regulacja cyklu komórkowego: rola cyklin oraz kinaz białowych zależnych od cyklin (cdk); mechanizmy regulujące ich aktywność; substraty białkowe cdk i inhibitory (białka p16, p21,p27); rola białka p110 Rb w regulacji cyklu komórkowego.

CYKL KOMÓRKOWY

składa się z

interfazy okres miedzy podziałami komórki

mitozy okres podziału komórki (faza M)

W interfazie wyróżnia się fazy cyklu

G1 - między końcem mitozy a rozpoczęciem syntezy DNA

S - synteza DNA

G2 - między końcem syntezy DNA a początkiem mitozy

Prawidłowe komórki ludzkie wykazują stałą zawartość DNA związaną z diploidalną liczbą chromosomów (2x23) jedynie w fazie mitozy

• Komórki nowopowstałe po podziale wchodzą w fazę wzrostu zwaną G1, którą cechuje:

• powiększenie jądra komórkowego - przemieszczenie białek z cytoplazmy

• wzrost zawartości RNA - wysoki poziom utrzymuje się w następnych fazach cyklu

• wzrost zawartości białek różnych klas

• synteza cyklin A, C, D i E

• długość fazy decyduje o długości całego cyklu

• w późnej fazie G1 zlokalizowany jest punkt restrykcyjny R

• trwa 6-12 godzin

• Fazę S cechuje synteza DNA chromatyny

• wzrasta masa komórki w stosunku do masy w fazie G1

• rozpoczyna się synteza cykliny B

• odbywa się synteza histonów

• trwa 6 - 8 godzin

• Fazę G2 charakteryzuje tetraploidalna liczba chromosomów

• służy przygotowaniu komórki do mitozy

• syntetyzowane są niezbędne białka wrzeciona podziałowego (tubulina), cyklina B (składnik kinazy fazy M) oraz składniki błony komórkowej

• w późnej fazie G2 następuje aktywacja kinazy białkowej CDK oraz kondensacja materiału genetycznego

• trwa 3 - 4 godziny

REGULACJA CYKLU KOMÓRKOWEGO

W zachowaniu prawidłowości cyklu komórkowego uczestniczą dwa tzw. punkty restrykcyjne

• Pierwszy punkt na granicy faz G1/S

• Kontrola integralności materiału genetycznego

• Wykrycie uszkodzenia w cząsteczce DNA powoduje:

• uruchomienie systemów naprawczych

• zatrzymanie cyklu komórkowego przed przejściem w fazę S

• skierowanie do apoptozy

• Drugi punkt restrykcyjny na granicy faz G2/M

• Kontrola prawidłowej kondensacji i segregacji materiału genetycznego

• Tworzenie wrzeciona podziałowego przed mitozą

Regulacja cyklu komórkowego odbywa się przez uruchomienie kaskady reakcji fosforylacji i defosforylacji białek

• fosforylację bialek katalizują kinazy białkowe

• defosforylację fosfatazy

• substratami kinaz są białka jądrowe i cytoplazmatyczne

• fosforylacji podlegają aminokwasy tyrozyna, treonina i seryna

• aktywacja kinaz zachodzi w obu punktach restrykcyjnych

Cykliny, kinazy cdk i ich funkcje

rodziny cyklin	kinaza	funkcja kompleksu
cykliny D1, D2, D3	cdk4, cdk6	fosforylacja w fazie G1
cyklina E	cdk2	fosforylacja na granicy faz G1/S
cyklina A	cdk2	fosforylacja w fazie S/G2
cykliny A i B cyklina B	cdk1 (p34)	fosforylacja na granicy faz G1/S, S/G2 i G2/M
	cdk1 (p34)	fosforylacja na granicy faz G2/M i M

Mechanizmy regulujące aktywność cdk

Aktywacja	Hamowanie
Dołączenie cykliny	Degradacja cykliny
Defosforylacja Tyr14 i Tyr15 przez fosfatazę cdc25	Fosforylacja Tyr14 i Tyr15 przez kinazy wee1 oraz mik1 - hamowanie przejścia domitozy
Fosforylacja Tyr160 przez cdk7-cyklina H	Defosforylacja Tyr160
Odłączenie jednego z endogennych inhibitorów białkowych	Utworzenie kompleksu z jednym z endogennych inhibitorów białkowych

Białkowe substraty cdk fosforylowane w fazach cyklu komórkowego (przykłady)

Faza cyklu	Substrat
G1	Czynniki transkrypcyjne: E2F, Sic1, Far1 Produkty genów supresorowych: p53, p105Rb Enzymy: fosfataza cdc25A, polimeraza RNA II
S	Czynniki transkrypcyjne: E2F-1, Swi5 Białko wiążące się z pojedynczą nicią DNA; RPA Duży antygen T wirusa SV40
G2	Czynniki transkrypcyjne : Swi5 Enzymy: fosfataza cdc25C
M	Białka cytoplazmatyczne i jądrowe: lekki łańcuch miozyny, kaldesmon, wimentyna, laminy, histon H1,nukleolina Czynniki transkrypcyjne: EF1, TFIIIB, c-myb Enzymy: fosfataza PP1, kinazy tyrozynowe c-ab1, c-src, kinazy MAP4/MAP1-B Białka pęcherzyków endocytarnych

Inhibitory cdk i ich substraty

Inhibitory	Białko docelowe inhibitora
Rodzina INK4: p16, p15, p18, p19 Rodzina Cip/ Kip p21, p27, p57	Kinazy cdk4 i cdk6
		Wszystkie kompleksy cyklina-cdk

Regulacja cyklu komórkowego z udziałem  

Białko P53

• jest produktem genu supresorowego P53

• zbudowane z 353 aminokwasów

• ma trzy domeny

• C - końcowa część białka zawiera wiele aminokwasów zasadowych, sygnał lokalizacji jądrowej oraz domenę oligomeryzacyjną

• część centralna zawiera sekwencje umożliwiające wiązanie się białka z DNA (DNA binding domain)

• N- końcowa zawiera domenę transaktywacyjną

• jest kluczowym regulatorem cyklu komórkowego

• uczestniczy w kontroli integralności genomu

• aktywność biologiczną wykazuje tetramer ufosforylowany, który rozpoznaje ściśle określoną sekwencję DNA czyli zachowuje się jak czynnik transkrypcyjny

• pod koniec fazy G 1 ilość białka P53 rośnie

• przedostaje się do jądra komórkowego

• gdy w DNA pojawia się uszkodzenie ilość P53 w jądrze rośnie powodując zatrzymanie cyklu komórkowego

• maksymalny poziom fosforylacji białka P53 osiągany jest w fazie M cyklu

• 20 min - okres półtrwania prawidłowego białka

• zmutowane białko P53 nie traci zdolności do tworzenia tetrameru z prawidłowym P53, ale traci zdolność do wiązania z DNA czyli nie spełnia roli regulatora transkrypcji

• Niektóre białka kodowane przez onkogeny wirusowe np. antygen T wirusa SV40 wiążą się z domeną oligomeryzującą prawidłowego białka P53 co powoduje obniżenie jego poziomu i przedwczesnego zwolnienia bloku prolifereacyjnego. Rozpoczyna się wtedy replikacja DNA mimo, że nie został jeszcze zakończony proces naprawy DNA, co może prowadzić do powstania mutacji.

Białko P53 w prawidłowej komórce obecne jest w niewielkiej ilości ponieważ ulega gwałtownej degradacji w procesie ubikwitylacji z udziałem białka MDM2 (właściwości ligazy ubikwitynowej)

Białka rodziny MDM2

• posiadają miejsca wiążące się z metalem oraz tzw. palce cynkowe - miejsca oddziaływania z DNA

• w wyniku alternatywnego składania mRNA powstają 4

transkrypty, których 3 produkty białkowe mogą łączyć się

z białkiem P53

• w prawidłowej komórce powstaje jeden najdłuższy

z alternatywnych transkryptów mRNA a jego produkt białkowy łączy się z DNA i pełni funkcję czynnika transkrypcyjnego dla pewnych białek

Droga regulacyjna cyklu komórkowego z udziałem białek p19(ARF)-mdm2-p53

Aktywność p53 podlega precyzyjnej kontroli z udziałem białka MDM2 na drodze ujemnego sprzężenia zwrotnego

Białko p53 nasila ekspresję genu mdm2, a białko mdm2 tworzy dimer z białkiem p53. Wynikiem jest utrata zdolności indukcji genów przez białko p53 a białko mdm2 wykazując aktywność ligazy ubikwitylowej odpowiada za degradację białka p53.

Białko PRB (P110)

• ulega fosforylacji w czasie cyklu komórkowego

• w formie częściowo ufosforylowanej posiada zdolność łączenia się z czynnikiem transkrypcyjnym E2F, kompleks ten jest stabilizowany przez białka z rodziny DP

• defosforylacja odbywa się w końcowym etapie mitozy i prowadzi do uwolnienia z kompleksu czynników transkrypcyjnych z rodziny E2F co prowadzi do aktywacji transkrypcji

• od wejścia w fazę S aż do późnego okresu fazy G2 białko PRB jest ufosforylowane czyli czynniki transkrypcyjne z rodziny E2F są związane w kompleksie

• zdefosforylowane białko PRB zatrzymuje cykl komórkowy w fazie G1 a ufosforylowane znosi to hamowanie

• białka wirusowe łączą się przede wszystkim

z nieufosforylowaną formą PRB, utworzenie takiego kompleksu hamuje zdolność regulacyjną PRB

Droga regulacyjna cyklu komórkowego z udziałem białek p16(INK4a)-cyklina D1-cdk4-pRb

8. Kontrola cyklu komórkowego w wyniku procesu transkrypcji i sprzężenia zwrotnego.

Patrz: p53 i PRB

9. Znaczenie białka p53 w procesie wzrostu, różnicowania i śmierci komórek..

Patrz: p53

10. Koncepcja śmierci komórki (nekroza, apoptoza).

11. Czynniki uczestniczące w programowanej śmierci: geny śmierci, receptory błonowe oraz ich ligandy, czynniki transkrypcyjne, białka antyapoptotyczne i proapoptotyczne, kaspazy, tyrozynowe kinazy białkowe.

12. Mechanizmy apoptotycznej śmierci komórki: apoptoza wywołana sygnałem wewnątrz komórkowym (z udziałem mitochondrium), czynnikiem zewnętrznym oraz z udziałem czynnika indukującego apoptozę (ApopIF) bez udziału kaspaz.

Drogi indukcji apoptozy

• Apoptoza indukowana niedoborem czynników wzrostu i regulowana przez rodzinę białek BCL-2

• białka z rodziny BCL-2 mają konserwatywną budowę końca C

• wykazują zdolność do wzajemnego oddziaływania oraz tworzenia homo- i heterodimerów

• umiejscowione są w zewnętrznej błonie mitochondrium, błonie jądrowej, retikulum endoplazmatycznego

• białko BCL-2 współdziała z białkiem BAX w regulacji apoptozy

• białko BCL-2 hamuje apoptozę poprzez

• hamowanie aktywacji proteaz serynowych

• aktywację kinazy Raf, która fosforyluje w blonie mitochondrialnej proapoptotyczny Bad . Fosforylowany Bad nie łączy się z BCL2 i w ten sposób promuje przeżycie

• uczestniczą w budowie porów

• zmiany konformacyjne białek tworzących pory, w tym BCL2 oraz BAX powodują:

• zmiany przepuszczalności błony

• zmiany potencjału transbłonowego

• uwolnienie do cytoplazmy cytochromu c

• cytochrom c łączy się z aktywatorem proteaz APAF1 indukując aktywację prokaspazy 9

• aktywacja kaskady kaspaz

BCL-2 związuje całą pulę BAX

• pozostałe białko BCL-2 ulega dimeryzacji- komórka przeżywa

• nadmiar homodimerów białka BAX - komórka jest kierowana do apoptozy

• białko BCL-X występuje w dwóch formach

• dłuższa - chroni komórkę przed śmiercią

• krótsza - stymuluje do apoptozy

Aktywacja procesu apoptozy przez białkowe czynniki uwalniane z mitochondrium

Apoptoza zależna od obecności na powierzchni błony komórkowej receptorów dla TNF, IGF1, a także antygenów dla FAS /APO-1

Mechanizm

• związanie liganda (trimer) z receptorem zakotwiczonym w błonie, agregacja, internalizacja kompleksu

• oddziaływanie fragmentu receptora przez domenę śmierci (DD) z białkami adaptorowymi

• przekazywanie sygnału decydującego o śmierci komórki lub przeżyciu z białek adaptorowych do białek efektorowych (kaspazy, czynniki transkrypcyjne a także synteza ceramidu)

• TNF-α działa plejotropowo, generuje wolne rodniki w tym podtlnek azotu i indukuje hydrolizę fosfolipidów

• FAS receptor i FAS-L na powierzchni komórek ale rzadko tych samych

• w ekspresji genu kodującego FAS- R i/lub FAS-L uczestniczą białka m.in. interferon γ, NFκ-B oraz białko supresorowe P53

• indukcja ekspresji genów kodujących FAS- R i/lub FAS-L cytostatykami - doksorubidyna, bleomycyna, metotreksat, fluorouracyl, kamptotecyna , cis- platyna - wywołuje apoptozę komórek nowotworowych

• po połączeniu receptora z odpowiednim ligandem sygnał proapoptotyczny jest przekazany do wnętrza komórki, zaangażowane jest białko adaptorowe FADD a efektorem szlaku, w którym uczestniczy FADD jest prokaspaza 8

Apoptoza w wyniku uszkodzenia materiału genetycznego i związana z obecnością
białka P53 oraz ATM

• uszkodzenie DNA wywołuje indukcję syntezy białka P53

• białko P53 jest czynnikiem transkrypcyjnym m.in. dla BAX (równowaga między pro- i antyapoptotycznymi białkami przesunięta w kierunku apoptozy)

• indukcja kaskady kaspaz

• indukcja kaspazy 3 wywołuje aktywację deoksynuklazy CAD (caspase activated deoksynuclease), która inicjuje degradację chromosomowego DNA

Droga sygnałowa z udziałem ATM/p53

• mutacja genu P53 prowadzi do syntezy nieprawidłowego białka P53 niezdolnego do zahamowania cyklu komórkowego lub uruchomienia systemów naprawczych

• transformacja nowotworowa - zanik zdolności komórki do apoptozy

13. Mikroprocesory DNA- budowa mikroprocesorów, przygotowanie próbek, hybrydyzacja, analiza danych. Zastosowanie mikroprocesorów w medycynie.

Chipy (mikroprocesory) DNA

• Opierają się na hybrydyzacji fragmentów DNA z tysiącami sond umieszczonymi na stałym podłożu (płytka szklana, nylonowa)

Zastosowanie:

• Analiza ekspresji genów (jednoczesna analiza setek a nawet tysięcy genów)

• Genotypowanie, określenie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów

• Sekwencjonowanie DNA

1. Izolujacja mRNA osobnika zdrowego i chorego

2. Hybrydyzacja z sondami

3. Wizualizacja

4. Analiza - dowiadujemy się jakie geny ulegają ekspresji u osoby zdrowej i chorej, a jakie tylko w zdrowego lub tylko u chorego; inrensywność fluorescencji świadczy o stopniu ekspresji danego genu

Praktyczne zastosowanie chipów DNA

• Identyfikacja czynników związanych z patogenezą chorób

• Diagnostyka:

• Poznanie czynników wpływających na skuteczność leków

• Dobór właściwej terapii

Zalety stosowanie chipów DNA

• Umożliwiają określenie ekspresji wielu genów jednocześnie

• Szybko uzyskuje się dużo wyników

• Istnieje możliwość bezpośredniego porównania ekspresji tych samych genów w 2 populacjach komórek (np. chorobowo zmienione - zdrowe)

• Pozwala na identyfikacje podgrup o określonych właściwościach (np. wrażliwość/niewrażliwość na dany lek)

Wady

• Zbyt wiele danych - trudności w interpretacji

• Trudna i żmudna analiza danych

• Niższa niż w innych metodach powtaerzalność wyników

• Wysoki koszt

14. Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR) i jej modyfikacje. Zastosowanie PCR do analizy metylacji DNA.

IV. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR

• Metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki

• Do reakcji wprowadza się:

• Matrycowy DNA

• Trifosforany deoksyrybonukleotydów

• Startery (primery) oskrzydlające naszą sekwencję DNA

• Termostabilną polimerazę np. Taq wyizolowaną z bakterii Termophilus aquaticus lub polimerazę Pfu z bakterii Pyrococcus furisus

• 3 Etapy, powtarzane 20 - 40 razy

• 95⁰C - denaturacja

• 50⁰ - 65⁰C - hybrydyzacja starterów

• 72⁰C - synteza komplementarnych nici przez polimerazę Taq

• W I cyklu powstają 2 nici potomne, w II cyklu powstają pierwsze nici o długości odpowiadającej sekwencji oskrzydlanej przez startery. Przy 100% wydajności po n-cyklach reakcji z 1 cząsteczki matrycy otrzymujemy 2ⁿ kopii

Modyfikacje podstawowej PCR

1. Hot start PCR

2. Nested PCR

3. Reverse transcription PCR

4. Real time PCR

5. Multiplex PCR

1. Hot start PCR

• Pozwala na uniknięcie niespecyficznej amplifikacji fragmentów DNA

• Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się nieaktywną polimerazę typu Hot-start, która ulega uaktywnieniu bezpośrednio przed właściwą amplifikacją (najczęściej 15 min inkubacja w temp. 95⁰C przed I cyklem PCR)

• Szczególnie przydatne przy amplifikacji krótkich fragmentów

2. Nested PCR

Zwiększono specyficzność amplifikacji dzięki zastoaowaniu 2 par starterów dla 1 sekwencji DNA

3. Nested PCR

• Służy do badania ekspresji genów

• Całkowity mRNA przepisywany jest na cDNA, który poddawany jest tradycyjnej reakcji PCR

4. Reverse transcription PCR

• Metoda ilościowa, PCR w czasie rzeczywistym

• Detekcja powstałych produktów w czasie trwania reakcji, brak konieczności elektroforezy

• Przyrost produktu sygnalizowany jest wzrostem wartości fluorescencji warunkowanej przez znakowane oligonukleotydy lub związki interkalujące DNA (np. SYBER-Green, który łączy się tylko z 2-niciowym DNA)

• Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do ilości produktu w próbie

5. Multiplex PCR

• Jednoczesna amplifikacja kilku różnych fragmentów DNA

Do jednej mieszaniny reakcyjnej dodaje się kilku par starterów

15. Ocena jakościowa i ilościowa DNA (analiza spektroskopowa). Elektroforeza kwasów nukleinowych.

II. Właściwości spektroskopowe kwasów nukleinowych

• Zasady purynowe i pirymidynowe absorbują prom. UV

• Max absorpcji przy 260nm

• Efekt hipochromiczny: dwuniciowe kwasy nukleinowe wykazują niższą wartość absorpcji niż odpowiadające im stężenie kwasu jednoniciowego

Spektroskopowe oznaczanie stęż kwasów nukleinowych w roztworach

• Wartość A₂₆₀ jest proporcjonalna do zawartości DNA w roztworze

• Dla 2-niciowego DNA o stężeniu 1 mg/ml A₂₆₀ = 20

• Miarą czystości roztworu DNA jest stosunek A260/A280. Optymalnie powinien wynosić 1,8 - 2,0

• Wartość A₂₈₀ wskazuje na stan zanieczyszczenia białkami, fenolem.

III. Elektroforeza DNA

• Rozdział fragmentów DNA zachodzi pod wpływem przyłożonego napięcia

• Dna jest polianionem, wędruje w kierunku elektrody +

• Ruchliwość fragmentów DNA zależy głównie od ich wielkości

• Do rozdziału stosuje się żele agarozowe lub poliakryloamidowe (większa rozdzielczość)

Etapy elektroforezy

1. Przygotowanie żelu (rozpuszczenie agarozy, wylanie na płytkę)

2. Przygotowanie próbek DNA

3. Naniesienie próbek DNA

4. Przyłożenie napięcia - migracja

5. Wizualizacja - bromek etydyny (interkaluje DNA)

Nakładanie badanych próbek DNA

• Każdą z prób miesza się z barwnym buforem obciążającym, który zapobiega wyciekaniu prób ze studzienek i umożliwia wzrokową obserwację przebiegu elektroforezy.

• Wizualizacja:

• Bromek etydyny - interkaluje DNA, wbudowuje się między sąsiadujące płasczyzny dwuniciowego DNA, wykrywa nanogramy DNA

• AgNO3 - bardzij czuły, wykrywa pikogramy DNA

• Znakowanie izotopami lub luminoforami

16. Techniki elektroforetyczne stosowane w analizie białek; znaczniki białkowe.

METODY DETEKCJI I ANALIZY BIAŁEK

BIAŁKA MOŻNA FRAKCJONOWAĆ I ODDZIELIĆ OD INNYCH CZĄSTECZEK WYKORZYSTUJĄC TAKIE ICH CECHY JAK:

• WIELKOŚĆ

• ROZPUSZCZALNOŚĆ

• ŁADUNEK

• POWINOWACTWO DO INNYCH CZĄSTECZEK

WIELKOŚĆ

• dializa przez błonę półprzepuszczalną, taką jak porowata błona celulozowa; cząsteczki o wymiarach znacznie większych niż średnica poru pozostają w woreczku dializacyjnym, natomiast mniejsze cząsteczki i jony przechodzą przez błonę i pojawiają się w dializacie na zewnątrz woreczka

• filtracja żelowa nazywana także sączeniem molekularnym

Zastosowanie filtracji żelowej:

• do rozdzielania dużej ilości białka

• często w celu odsolenia roztworu białka (np. w celu usunięcia siarczanu amonu po precypitacji siarczanem amonu), ponieważ sól wnika w kanaliki ziaren i wypływa z kolumny później, natomiast białko nie ma możliwości wejścia w kanaliki i wypływa z kolumny wcześniej

ROZPUSZCZALNOŚĆ

• rozpuszczalność większości białek zmniejsza się w stężonych roztworach soli, co nazywamy wysalaniem

• białka różnią się rozpuszczalnością w stężonych roztworach soli i dlatego wysalanie można wykorzystać do frakcjonowania białek (np. fibrynogen wytrąca się w 0.8 M siarczanie amonu, natomiast albumina osocza w 2.4 M), a także do zagęszczania rozcieńczonych roztworów białek

ŁADUNEK

• techniki elektroforetyczne (elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących - elektroforeza z SDS, ogniskowanie izoelektryczne, elektroforeza dwukierunkowa)

• chromatografia jonowymienna

Elektroforetyczne metody analizy białek

• należą do najpowszechniej stosowanych metod biologii molekularnej, z uwagi na ich wysoką rozdzielczość, krótki czas wykonywania analizy, prostotę i niskie koszty

• wykorzystują zdolność białek do migracji w polu elektrycznym z różną prędkością, zależną od masy cząsteczkowej rozdzielanego białka i jego ładunku

• jako podłoża wykorzystuje się żele agarozowe, poliakryloamidowe i skrobiowe

Elekroforeza w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących (z SDS)

• mieszaninę białek rozpuszcza się w siarczanie dodecylu (SDS); ten anionowy detergent niszczy niemal wszystkie oddziaływania niekowalencyjne w natywnych białkach

• w celu zredukowania wiązań disiarczkowych dodaje się także merkaptoetanol lub ditiotreitol

• aniony SDS wiążą się z łańcuchami głównymi w stosunku 1 anion na 2 reszty aminokwasowe, nadając powstałemu kompleksowi ze zdenaturowanym białkiem ujemny ładunek wypadkowy, w przybliżeniu proporcjonalny do masy cząsteczkowej białka

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z SDS

• kompleksy SDS ze zdenaturowanym białkiem poddaje się elektroforezie, na ogół na pionowo ustawionych płytach z żelem poliakryloamidowym (kierunek: od góry do dołu)

• małe białka poruszają się w żelu szybko, natomiast duże zatrzymują się na górze, blisko miejsca nałożenia mieszaniny na żel

• rozdzielone białka można wybarwić srebrem lub barwnikiem typu błękit Commassiego, natomiast znakowane radioaktywnie białko można zlokalizować metodą autoradiografii, umieszczając na żelu błonę rentgenowską

Zastosowanie elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS

• do analizy mas cząsteczkowych białek i liczby polipeptydowych podjednostek w obrębie białka

• do oszacowania stopnia czystości badanej próby

• metoda szybka, czuła i o dużej rozdzielczości

Ogniskowanie izoelektryczne

• jest techniką o wysokiej rozdzielczości, pozwalającą na rozdział białek o bardzo złożonej budowie

• wykorzystuje zjawisko punktu izoelektrycznego, tj. takiej wartości pH, przy którym wypadkowy ładunek białka wynosi zero; z chwilą znalezienia się w takim pH cząsteczki białka zatrzymują się

• technikę tę można prowadzić na żelach agarozowych jak i poliakryloamidowych

• pozwala na rozdział białek różniących się pI o 0.01, tzn. tylko jednym ładunkiem wypadkowym

Elektroforeza dwukierunkowa

• polega na rozdziale cząsteczek z zastosowaniem dwóch metod rozdziału

• żel rozdzielamy wg jednej z metod np. ogniskowania izoelektrycznego, obracamy o 90^o i prowadzimy rozdział w drugim kierunku z zastosowaniem np. elektroforezy z SDS

• w pierwszym przypadku rozdzielamy białka w oparciu o ich punkt izoelektryczny, a w drugim o ich masę cząsteczkową

Chromatografia jonowymienna

• wykorzystuje różnice w ładunku wypadkowym odmiennych cząsteczek białkowych

• białko mające w pH 7 wypadkowy ładunek dodatni będzie się na ogół wiązać z wymieniaczem jonowym przez jego grupy karboksylowe; z takim nośnikiem nie zwiąże się białko naładowane ujemnie

POWINOWACTWO DO INNYCH CZĄSTECZEK

• obok ładunku wypadkowego istnieją także inne czynniki wpływające na zachowanie się białek na kolumnie jonowymiennej, takie jak np. specyficzne powinowactwo do nośnika wypełniającego kolumnę

• białka naładowane ujemnie (białka anionowe) można rozdzielać chromatograficznie na kolumnach wypełnionych dodatnio naładowaną dietyloaminocelulozą (DEAE-celulozą), natomiast białka naładowane dodatnio na kolumnach z ujemnie naładowaną karboksymetylocelulozą (CM-celulozą)

POWINOWACTWO DO INNYCH CZĄSTECZEK - chromatografia powinowactwa

• wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne i wykazujące duże powinowactwo wiązanie się białka z inną cząsteczką, nazywaną ligandem

• ligand jest wiązany kowalencyjnie z obojętnym chemicznie i porowatym nośnikiem np. Sepharozą

• mieszaninę białek przepuszcza się przez kolumnę z unieruchomionym ligandem; określone białko wiąże się z ligandem, natomiast pozostałe przechodzą swobodnie przez kolumnę

• kolumnę przemywa się intensywnie buforem, aby usunąć niespecyficznie związane białka

Chromatografia powinowactwa

• białko wiążące się z ligandem uwalnia się z kolumny dwoma sposobami: przez przemycie kolumny roztworem zawierającym ligand w wolnej postaci, który współzawodniczy z unieruchomionym ligandem o wiązanie z białkiem, lub zmieniając właściwości buforu (zmiana pH lub stężenia soli)

• chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne, często wyjątkowe właściwości białka, umożliwia więc jego wyodrębnienie z mieszaniny kilkuset białek w trakcie pojedynczego etapu chromatograficznego

ZNACZNIKI BIAŁKOWE

• biotyna - posiada wysokie powinowactwo do białek: streptawidyny i awidyny, łącząc się z nimi z wysoką stałą wiązania

• znaczniki enzymatyczne - najczęściej w ich skład wchodzą enzymy katalizujące reakcję przejścia bezbarwnego substratu w barwny produkt absorbujący światło, np. fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa i β-galaktozydaza; enzymy do przeciwciał mogą być przyłączane w sposób bezpośredni jak i pośrednio, np. za pośrednictwem biotyny i streptawidyny

• radioizotopy - najczęściej izotopy fosforu, siarki i jodu

• fluorochromy - kumaryna, fluoresceina, rodamina

Zastosowanie znaczników białkowych

• w zależności od tego w jakim celu chcemy znakować białka należy dobrać odpowiedni znacznik

• znaczniki enzymatyczne - badania immunohistochemiczne, testy ElISA i Western blot

• radioizotopy - testy RIA

znaczniki fluorescencyjne - wysokorozdzielcze testy immunocytochemiczne

17. Immunoprecypitacja

IMMUNOPRECYPITACJA

Proces, w wyniku którego peptydy lub białka oddziaływujące specyficznie z przeciwciałem są usuwane z roztworu i badane w kierunku ich cech fizycznych (pI, masa cząsteczkowa).

ETAPY PRECYPITACJI

• znakowanie białek np. ³H-metioniną (znakowanie metaboliczne), J białek powierzchniowych

• liza komórek w celu uwolnienia badanego antygenu przy wykorzystaniu odpowiedniego buforu lizującego pozwalającego wydajnie uwolnić antygen i rozpoznać go przez przeciwciało

• tworzenie kompleksu przeciwciało-antygen

• precypitacja kompleksu przeciwciało-antygen poprzez dodanie przeciwciała związanego z odpowiednim białkiem (białko G lub A)

• analiza elektroforetyczna

Prawidłowa precypitacja zależy od dwóch czynników:

• wystarczającej ilości antygenu w badanej próbie

• powinowactwa przeciwciała do antygenu

18. Zasada i zastosowanie techniki Western blotu.

WESTERN BLOT

• jest najprostszą metodą stosowaną w immunodetekcji białek, polegającą na przeniesieniu białek z żelu poliakryloamidowego na stałe podłoże

• umożliwia analizę badanego białka zarówno biochemiczną, jak i immunologiczną

• dzięki wysokiej czułości umożliwia detekcję antygenów w ilości poniżej 1 µg

Technika blottingu składa się z trzech etapów:

• rozdział elektroforetyczny białek w żelu poliakryloamidowym z SDS

• przeniesienie (transfer) białek z żelu na błonę (elektrotransfer)

• wykrywanie utrwalonych na podłożu białek metodami immunoenzymatycznymi

Metody immunoenzymatyczne dzielimy na:

• jednostopniowe

• dwustopniowe

Etapy metody jednostopniowej:

• związanie białka ze specyficznym przeciwciałem I-rzęd., np. mysim

• wykrycie mysich przeciwciał za pomocą II-rzęd. przeciwciała związanego z enzymem katalizującym reakcję barwną np. peroksydazą chrzanową

• dodanie substratu odpowiedniego dla peroksydazy (1-chloro-1-naftolu)

• utworzenie charakterystycznych prążków w miejscu reakcji katalizowanej przez enzym sprzęgnięty z II-rzęd. przeciwciałem

Etapy metody dwustopniowej:

• używamy biotynylowanego II-rzęd. przeciwciała

• inkubacja kompleksu antygen-I-rzęd. przeciwciało-II-rzęd. przeciwciało-biotyna w roztworze streptawidyny lub awidyny sprzężonych z fosfatazą zasadową

• dodanie odpowiednich substratów dla fosfatazy zasadowej

• utworzenie kolorowego precypitatu

Western blot

• 1. Blokowanie niespecyficznych miejsc na błonie poprzez inkubację z odtłuszczonym mlekiem

• 2. Inkubacja z I-rzęd. przeciwciałem

• 3. Wiązanie I-rzęd. przeciwciała z II-rzęd. biotynylowanym przeciwciałem

19. Metody detekcji kompleksu antygen - przeciwciało.

Etapy metody jednostopniowej:

• związanie białka ze specyficznym przeciwciałem I-rzęd., np. mysim

• wykrycie mysich przeciwciał za pomocą II-rzęd. przeciwciała związanego z enzymem katalizującym reakcję barwną np. peroksydazą chrzanową

• dodanie substratu odpowiedniego dla peroksydazy (1-chloro-1-naftolu)

• utworzenie charakterystycznych prążków w miejscu reakcji katalizowanej przez enzym sprzęgnięty z II-rzęd. przeciwciałem

Etapy metody dwustopniowej:

• używamy biotynylowanego II-rzęd. przeciwciała

• inkubacja kompleksu antygen-I-rzęd. przeciwciało-II-rzęd. przeciwciało-biotyna w roztworze streptawidyny lub awidyny sprzężonych z fosfatazą zasadową

• dodanie odpowiednich substratów dla fosfatazy zasadowej

• utworzenie kolorowego precypitatu

20. Chromatografia powinowactwa.

POWINOWACTWO DO INNYCH CZĄSTECZEK - chromatografia powinowactwa

• wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne i wykazujące duże powinowactwo wiązanie się białka z inną cząsteczką, nazywaną ligandem

• ligand jest wiązany kowalencyjnie z obojętnym chemicznie i porowatym nośnikiem np. Sepharozą

• mieszaninę białek przepuszcza się przez kolumnę z unieruchomionym ligandem; określone białko wiąże się z ligandem, natomiast pozostałe przechodzą swobodnie przez kolumnę

• kolumnę przemywa się intensywnie buforem, aby usunąć niespecyficznie związane białka

Chromatografia powinowactwa

• białko wiążące się z ligandem uwalnia się z kolumny dwoma sposobami: przez przemycie kolumny roztworem zawierającym ligand w wolnej postaci, który współzawodniczy z unieruchomionym ligandem o wiązanie z białkiem, lub zmieniając właściwości buforu (zmiana pH lub stężenia soli)

• chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne, często wyjątkowe właściwości białka, umożliwia więc jego wyodrębnienie z mieszaniny kilkuset białek w trakcie pojedynczego etapu chromatograficznego

21. Laserowa desorpcja/jonizacja z wykorzystaniem matrycy (MALDI) - zasada, etapy i zastosowanie.

Laserowa desorpcja/jonizacja z wykorzystaniem matrycy (MALDI)

• białka wyekstrahowane z komórki lub tkanki rozdziela się za pomocą elektroforezy dwukierunkowej; uzyskuje się dwukierunkową mapę plamek białkowych zawierających kilka tysięcy różnych białek

• pojedyncze plamki wycina się następnie z żelu i trawi proteazami, takimi jak trypsyna, w celu uzyskania zestawu peptydów charakterystycznych dla danego białka

• dokładną masę cząsteczkową każdego peptydu określa się następnie przy użyciu spektrometrii masowej typu MALDI, uzyskując swoisty wzór mas cząsteczkowych peptydów badanego białka

Laserowa desorpcja/jonizacja z wykorzystaniem matrycy (MALDI)

• w metodzie tej próbki, w tym przypadku peptydy i białka są wspólnie krystalizowane z matrix na płytce MALDI

• płytka po wysuszeniu jest umieszczana w komorze próżniowej spektrometru masowego MALDI

• następnie płytka jest poddawana działaniu pulsującego promienia laserowego, co powoduje transfer matrix do fazy gazowej

• faza gazowa pod wpływem silnego pola elektrycznego, wytworzonego poprzez przyłożenie wysokiego napięcia do płytki MALDI, przenoszona jest z kolei do sprzężonego z MALDI MS, spektrometru masowego (TOF) mierzącego czas przelotu próbki przez wyznaczony odcinek drogi w komorze TOF

Laserowa desorpcja/jonizacja z wykorzystaniem matrycy (MALDI)

• w komorze analizowane cząsteczki rozdzielają się podczas przesuwania się w kierunku detektora; cząsteczki o mniejszej masie osiągają detektor szybciej niż cząsteczki o większej masie

• detektor mierzy docierające do niego w czasie badania jony peptydowe i tworzone jest widmo odzwierciedlające współczynnik masy do ładunku analizowanych peptydów (m/z)

• gdy wielkość masy odpowiada standardom o znanej masie i ładunku, czas przelotu danego jonu może wskazywać jego masę

Laserowa desorpcja/jonizacja z wykorzystaniem matrycy (MALDI)

• następnie masa ta porównywana jest z bazą danych przewidywanych wzorów mas cząsteczkowych peptydów, opracowaną dla wszystkich znanych białek zidentyfikowanych na drodze analizy sekwencji DNA wielu organizmów

• badania te są wysoce zautomatyzowane, co pozwala na możliwość identyfikacji wielu białek proteomu danej komórki i zrozumienie jak funkcjonują komórki oraz jak funkcje te zmieniają się podczas choroby

• są one obiektem olbrzymiego zainteresowania przemysłu farmaceutycznego, związanego z poszukiwaniem nowych białek będących celem działania nowych generacji leków

22. Metody identyfikacji osobniczej (RFLP,VNTR).

RFLP- polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

VNTR- różna liczba tandemowych powtórzeń =polimorfizm liczby tandemowych powtórzeń -kod paskowy-

23. Zastosowanie analizy DNA w poradnictwie genetycznym

•Diagnostyka prenatalna i preimplantacyjna

•Wykrywanie heterozygot

•Określanie ryzyka urodzenia dziecka obciążonego genetycznie

•Prognozowanie przebiegu choroby

•Ustalenie skutecznej terapii na podstawie diagnozy

24. Diagnostyka molekularna dystrofii mięśniowej Duchenne'a i mukowiscydozy.

•Zidentyfikowano ponad 200 różnych mutacji prowadzących do mukowiscydozy

•Częstość i rodzaj mutacji są różne w poszczególnych populacjach

•Mutacja delta F 508 (delecja jednego kodonu w genie CFTR) występuje u około 70% pacjentów rasy białej. W Polsce występuje w 50% przypadków mukowiscydozy

DMD

•Dziedziczenie sprzężone z płcią (1/3000 noworodków płci męskiej)

•Objawy: postępujący zanik mięśni

•Mutacje (delecje kilku lub kilkunastu eksonów) prowadzące do braku dystrofiny w mięśniach (postać letalna) lub do zmniejszenia ilości dystrofiny (dystrofia Beckera)

•Wiele odmian dystrofiny kodowanych przez gen DMD

•Promotory:

- C; kora mózgowa, hipokamp

- M; mięśnie szkieletowe, mięsień sercowy

- L; limfocyty

- R; siatkówka oka

- G; większość tkanek oprócz mięśni

•Alternatywne składanie transkryptu

•Kotranskrypcyjne składanie mRNA dystrofiny

25. Czynniki kwalifikujące chorobę genetyczną do terapii genowej; przykłady defektów genetycznych, w których możliwe jest podjęcie prób terapii genowej.

•Choroba dziedziczona recesywnie jednogenowo

•Wysoka śmiertelność i częstość występowania

•Brak odpowiedniego skutecznego leczenia

•Zlokalizowanie defektu genetycznego wywołującego chorobę

•Możliwość transferu genu do komórki z defektem

•Ocena ryzyka terapii genowej

Hemofilia A, B, mukowiscydoza, dystrofia mięśniowa Duchenne'a

26. Nośniki genu terapeutycznego oraz komórki docelowe w terapii chorób genetycznych.

KOMÓRKI DOCELOWE

1. gamety, zygoty (terapia genowa linii zarodkowej, terapia płodowa, terapia embrionalna)

2. komórki somatyczne

• komórki nowotworowe

• limfocyty T

• fibroblasty

• makrofagi

• komórki nabłonka płuc

• hepatocyty

• komórki mięśniowe

• komórki macierzyste

• komórki skóry

• komórki śródbłonka naczyń

• komórki nerwowe

27. Terapia genowa w leczeniu nowotworów.

1) Terapia genowa

a. manipulacje fenotypowe

* wprowadzenie prawidłowych genów

* antysensy

* rybozymy

* siRNA

* wewntątrzkom., 1-łańcuchowe p/ciała

* peptydowe pochodne kw. nukleinowych

b. chemioprotekcja komórek prawidłowych

* wprowadzenie genów oporności wielolekowej

c. bezpośrednia eliminacja komórek nowotworowych

* geny samobójcze

* geny proapoptotyczne

* wirusy onkolityczne

d. pośrednia eliminacja komórek nowotworowych

* terapia antyangiogenna

* genetyczna immunoterapia - np. cytokiny.

28. Strategie wprowadzania genu do organizmu gospodarza w terapii genowej.

STRATEGIE WPROWADZANIA GENU

• ex vivo

• in vivo

Wektory

• wirusowe

• niewirusowe

• nagi DNA

• liposomy

• polimery

• wg ładunku (+,-,+/-)

• wg budowy (liniowe, rozgałęzione, sferyczne)

• tzw. kopolimery

METODY TRANSFEKCJI

1. metody fizyczne

• iniekcje bezpośrednie

• `gene gun'

• elektroporacja

• immunoporacja

• transfekcja ultradźwiękowa

1. metody chemiczne

• DEAE-dekstran

• Precypitaty P-Ca

• Lipofekcja

1. metody fizykochemiczne

• transfekcja fotochemiczna

29. Ograniczenia terapii genowej.

30. Molekularne markery nowotworowe, markery biochemiczne, testy podatności oraz testy diagnostyczne w diagnostyce i prewencji chorób nowotworów.

MARKERY NOWOTWOROWE

Definicja: substancja wielkocząsteczkowa, która jest wykorzystywana wyłącznie w komórkach nowotworowych albo zarówno w komórkach nowotworowych, jak i prawidłowych (jeśli jej wytwarzanie w nowotworze jest znacząco wyższe)

Podział:

1. m. n. komórkowe

2. m. n. krążące

• swoiste dla nowotworu (neoantygen)

• antygeny towarzyszące nowotworom (płodowo-zarodkowe, łożyskowe, transplantacyjne, enzymy i izoenzymy, hormony)

• m. n. nieswoiste (cytokiny, pierwiastki śladowe)

Zjawiska odzwierciedlane przez markery nowotworowe

1. proliferacja (np. TPS)

2. różnicowanie (np. AFP, CA 15-3, CA 125, PSA)

3. obumieranie (np. TPA, CYFRA 21.1)

Zastosowanie markerów nowotworowych

• wykrywanie (badania przesiewowe)

• rozpoznanie (objawy sugerujące nowotwór)

• określanie stopnia zaawansowania

• lokalizowanie

• monitorowanie

• wykrywanie wznowy nowotworu

Diagnostyka- markery nowotworowe:

• Ca 15-3

• Ca 125

• Ca 19-9

• CYFRA 21-1

• PSA

• Ca 72-4

• Antygeny T

Podział markerów molekularnych

I grupa- tzw. markery nowotworowe

II grupa- tzw. markery klonalności, np. diagnostyka chłoniaków

Testy diagnostyczne:

• Mutacje w genach torów mutacyjnych (np. p53, MYC, RAS, MTS1, MTS2, RET)

• Analiza zmian w sekwencjach mikrosatelitarnych

• Sondy molekularne (np. dla genów immunoglobulin i receptorów limfocytów T)

• Poziom aktywności telomerazy

Prewencja

1. tryb życia

• negatywnie: palenie, nadmiar alkoholu, tłuszczu, cukru, czerwonego mięsa, soli

• pozytywnie: warzywa i owoce 5x dziennie, błonnik (resweratrol, kwas foliowy, witaminy A, C, E, ASA)

2. wczesna diagnostyka- programy screeningowe

• wymaz co 3-5 lat (25-60 r.ż)- rak szyjki macicy

• mammografia co 2-3 lata (40-70 r.ż.)- rak sutka

• badanie obecności krwi utajonej w kale co 1-2 lata (50-74 r.ż.)- rak jelita grubego

• zdjęcie Rtg płuc (18-60? r.ż.)- rak płuc

• poziom PSA we krwi- rak gruczołu krokowego

1. testy podatności- mutacje w genach

• BRCA1 i/lub BRCA2

• RER (geny mutatorowe)

MTS1 (p16)

31. Techniki biologii molekularnej w optymalizacji leczenia nowotworów.

Leczenie

1. Terapia genowa

1. Manipulacja fenotypowe

• Wprowadzenie prawidłowych genów

• Antysensy

• Rybozymy

• siRNA

• wewnątrzkomórkowe, jednołańcuchowe przeciwciała

• peptydowe pochodne kw. nukleinowego

2. chemioprotekcja komórek prawidłowych

• wprowadzenie genów oporności wielolejkowej

1. bezpośrednia eliminacja komórek nowotworowych

• geny samobójcze

• geny proapoptotyczne

• wirusy onkolityczne

• pośrednia eliminacja komórek nowotworowych

• terapia antyangiogenna

• genetyczna immunoterapia- np. cytokiny

1. typowe badania patomorfologiczne

• ocena histopatologiczna tkanki nowotworowej

• ocena rodzaju receptorów hormonalnych (np. hybrydyzacja in situ)

1. optymalizacja leczenia

• monitorowanie

• prognozowanie

• oporność na leczenie

• wybór terapii

• decyzja o wdrażaniu kosztownych schematów terapeutycznych

1. immunoterapia

• szczepionki

• leczenie choroby

• ochrona przed chorobą

• terapia genowa służąca zwiększeniu immunogenności komórek nowotworowych

• antiestrogenowa i estrogenowi terapia

pomiar i ocena obecności receptorów hormonalnych

32. „Szczepionki” w chorobach nowotworowych.

Patrz 31 ppkt4

33. Definicje: olignukleotydy antysensowne, olignuklukleotydy antygenowe, rybozymy, deoksyrybozymy, siRNA, aptamery i gapmery.

Blokowanie działania białek tzw aptamery

Definicja:

Wyselekcjonowane oligonukleotydy wykazują niezwykle silne powinowactwo do określonych białek dzieki odpowiedniemu kształtowi czasteczek aptameru

Często blokują białka niezwiązane bliżej z metabolitami kwasu nukleinowego

Np. trombinę , selektynę, odwrotną transkryptaze ptasiej białaczki, integraze wirusa HIV

I. Oligonukleotydy antysensowe

• Definicja:

• Krótkie fragmenty DNA komplementarne do docelowych odcinków mRNA (tych, które chcemy hamować)

II. Rybozymy

• Definicja:

Jednoniciowe, katalityczne cząsteczki RNA wysokospecyficznie rozpoznające docelowe RNA. (Występują w komórce naturalnie i naprawiają zmutowane DNA

III. Dezoksyrybozymy

1-niciowe cząsteczki DNA zdolne do samodzielnej katalizy różnych przemian chemicznych tzw. enzymy DNA =DNAzymy

IV. siRNA

• Najnowsza grupa leków

• Ok. 22 nukleotydowe odcinki RNA wprowadzane do komórki docelowej bezpośrednio lub przy użyciu wektorów

Tzw. postranskrypcyjne wyciszanie genów (PTGS) vs tzw. transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS

34. Mechanizmy działania oligonukleotydów antygenowych, oligonukleotydów antysensownych i siRNA rybozymów i aptamerów (podobieństwa i różnice).

Mechanizm działania antysensów :

-13 pz (RNA) - 17pz DNA (wyst 1x w genomie)

- inhibicja mRNA przez hamowanie transportu mRNA z jądra

-hamowanie splicingu

- zahamowanie translacji

• zawada przestrzenna (nie może się przyłaczyc rybosom)

aktywacja Rnazy H (-> destrukcja docelowego mRNa

Rybozymy- mech

• Działanie:

• Rozpoznają docelowe RNA lub

Naprawiają zmutowane komórkowe RNA

35. Kwasy nukleinowe ( przykłady chorób/genów), które potencjalnie mogą być/są stosowane w terapii.

ANTYSENS	CHOROBA	GEN DOCELOWY
Fomivirsen	Infekcja oka wirusem CMV lub AIDS	CMV
G3 139	Nowotwory	BCL-2
ISIS 3521 (Affnitac)	Nowotwory	Kinaza proteinowa C
Resten NG	Restenoza	C-MYC
GEM 231	Nowotwory	Kinaza proteinowa A
alicaforsen	Łuszczyca	ICAM-1

36. Budowa i właściwości optymalnego oligonukleotydu antysensownego.

Zwiększona oporność na nukleazy

Łatwiej przechodzą przez błony komórkowe

• Unika hybrydyzacji z niewłaściwym celem

Odpowiednio długi

37. Definicja organizmu transgenicznego. Cechy GMO.

Organizm transgeniczny - GMO - organizm, który niesie obcy gen albo jego informacja genetyczna została zmieniona.

Organizm modyfikowany genetycznie - pojęcie szersze niż organizm transgeniczny

Cechy organizmu transgenicznego

• Obcy DNA przyłączony w sposób trwały.

• Trwale zmodyfikowany dowolny gen

• Modyfikacja genetyczna powstała w sposób celowy

• Wprowadzony lub zmodyfikowany gen podlega dziedziczeniu

38. Transgeneza a klonowanie - porównanie, wspólne płaszczyzny zastosowań.

Transgeneza - trwałe umieszczenie nowej informacji genetycznej podlegającej dziedziczeniu. Także modyfikacja genetyczna organizmu.

Klonowanie - uzyskiwanie zespołu komórek identycznych pod względem genetycznym (o identycznym genomie)

39. Otrzymywanie organizmów transgenicznych: etapy procesu; pojęcie konstruktu DNA (kasety ekspresyjnej DNA); możliwości włączania się transgenu do genomu (rekombinacja nieuprawniona, rekombinacja homologiczna), selekcja rekombinantów za pomocą markerów pozytywnych i negatywnych; metody wprowadzenia transgenu (przykłady wektorów, plazmid Ti, przykład zastosowania strategii antysensu; mikroinjekcja do przedjądrza, przykłady genów reporterowych, metoda z użyciem „STEM CELLS” - definicja ES, klonowanie somatyczne, transpozomy, biobalistyka )

Otrzymywanie organizmu transgenicznego

• Konstruowanie transgenu

• Połączenie z wektorem naprowadzającym, klonowanie konstruktu DNA

• Ocena ekspresji transgenu i selekcja wektora z włączonym transgenem.

• Integracja transgenu z genomem biorcy

• Transfer do matek zastępczych

• Analiza DNA i selekcja potomstwa.







Konstrukt DNA













Transgen może się włączać w sposób przypadkowy na zasadzie rekombinacji nieuprawnionej lub w sposób celowy na zasadzie wymiany odcinków homologicznych występujących w miejscach sobie odpowiadających.

Tworzymy kasetę ekspresyjną z odcinkiem homologicznym do genu modyfikowanego. Stosuje się geny markerowe: pozytywne - „jak ja ciebie mam to przeżyję” i negatywne - „jak ja ciebie mam to nie przeżyję”. Za pomocą tych markerów można likwidować geny, które nie włączyły odpowiedniego odcinka podczas modyfikacji.

Pytanie: W jaki sposób transgen może zintegrować się z genomem organizmu podlegającego modyfikacji genetycznej?

Metody wprowadzania transgenu

7. Użycie zrekombinowanych wektorów

• krótkie odcinki DNA [np. plazmid wielokopiowy, sztuczny chromosom P1(PAC), plazmid T1( rośliny)]

• blokada ekspresji genu antysensowym cDNA - stosuje się komplementarny, antysensowy cDNA, powstają 2 - niciowe DNA, które mogą tworzyć dimer, ale nie mogą podlegać translacji np. wyciszanie genów odpowiedzialnych za produkcję O2 w owocach

• wykorzystuje się głównie w przypadku roślin

8. Mikroiniekcja do przedjądrza

• wymaga przeprowadzenia naturalnego zapłodnienia in vitro, materiał genetyczny wstrzykuje się do komórki (zwykle do przedjądrza męskiego). Nie ma w tej metodzie ograniczeń gatunkowych.

9. Użycie pierwotnych komórek zarodka - Stem Cells - SM

• Możliwość hodowli i selekcji in vitro

• Komórki totipotencjalne

• Można je wprowadzać do jam zarodków

• W warunkach in vitro można selekcjonować komórki

• Powstaje mysz chimeryczna, mająca cechy 2 matek

10. Klonowanie somatyczne

• Jądra komórek somatycznych umieszcza się oocycie pozbawionym własnego jądra

• Może być stosowana u ssaków

11. Transpozony

• Odcinki chromosomów, które potrafią się z nich wycinać i wielokrotnie wstawiać do innych chromosomów

• Stosowana głównie od uzyskiwania transgenicznych owadów, może być stosowana u ssaków

12. Biobalistyka

• Wprowadzanie DNA

• Stosowana głównie do otrzymywania transgenicznych roślin

40. Zastosowania GMO: przykłady poprawy cech użytkowych roślin i zwierząt; pojęcie „pharmingu”, przykłady; owady transgeniczne - idea likwidacji przenosicielstwa chorób zakaźnych; metoda SIT; zastosowania GMO w transplantologii; ksenotransplantacje; jadalne szczepionki

Zastosowanie GMO

• Poprawa niektórych cech użytkowych

• Produkcja pożądanych związków chemicznych (bioreaktory transgenicznych organizmów probiotycznych)

• Jadalne szczepionki (rośliny)

• Likwidacja przenosicielstwa chorób zakaźnych (owady)

• Ksenotransplantacje (stworzenie dawców organów)

• Modele badawcze

Biotechnologia.

• Zielona - związana z roślinami

• Biała - związana z przemysłem

• Czerwona - związana z farmacją

• Niebieska - związana z ekologią

Poprawa cech użytkowych roślin i zwierząt - przykłady

• Rośliny asymilujące N2 z powietrza z genem Rhizobium sp.

• Zwierzęta hodowlane ze zmodyfikowanymi genami wzrostu (świnie, karp, łosoś)

• Pomidor o podwyższonej zawartości likopenu

• Rośliny uprawne odporne na wysoką zawartość soli mineralnych w glebie

• Soja z genem orzecha brazylijskiego, o wzbogaconym składzie aminokwasowym

• Kukurydza, soja i bawełna z genem Bt (odporna na szkodniki i owady)

• Kawa bezkofeinowa - wyciszony gen CaMXMT

• Produkcja leczniczych substancji chemicznych przez GMO (Pharming = Pharmaceutical Farming): np. krowa produkująca w mleku leki białkowe, których nie można otrzymywać syntetycznie; Owady transgeniczne.

• Ksenotransplantacje (świnie)

• Produkcja jadalnych szczepionek

Produkcja leczniczych substancji chemicznych przez zwierzęta transgeniczne:

ZWIERZĘ	LEK	ZASTOSOWANIE
owca	AAT	Rozedma płuc
koza	TPA	Udar mózgu
owca	czynnik VIII	Hemofilia
owca	czynnik IX	Hemofilia
świnia	Hemoglobina	Suplementacja
krowa	Laktoferyna	Zaburzenia gospodarki Fe

Jadalne szczepionki

• Tanie lokalne uprawy, dostosowane do profilu gospodarczego regionu

• Możliwość reprodukcji z nasion uzyskiwanych z własnej uprawy

• Omija się bariery logistyczne

• Łatwa droga podania

• Szczepionki na gruźlicę, polio i ospę, głównie w krajach rozwijających się. Rośliny: ryż, soja, szpinak, sałata.

41. Modele transgeniczne w badaniach naukowych: cele stosowania modeli TG; sposoby wprowadzania transgenów w zależności od rodzaju modelu (modele z nadekspresją, modele typu „knock-out”, modele z genem reporterowym, modele odtwarzające mutacje); przykłady najbardziej popularnych modeli TG („Smart Mouse”, modele do badań metabolizmu ksenobiotyków, „Onco Mouse”, modele do wykrywania mutacji in vivo)

Transgeniczne modele badawcze

• Najczęściej modyfikowane są myszy.

Zalety myszy:

• Małe

• Wytrzymałe na krzyżowanie wsobne

• Stosunkowo duża wydajność transgenezy

• Duża plenność

• Dostępność protokołów hodowlanych

Etapy badawcze

Hipotezy oparte na badaniach populacyjnych

Eksperymenty in vitro oraz in vivo

Wyznaczenie celów molekularnych

Badania funkcjonalne

TG

Cele stosowania modeli TG

• Poznanie funkcji genów in vivo

• Poznanie interakcji czynnik chemiczny - gen

• Tworzenie modeli chorób

• Projektowanie modeli do badan farmakologicznych i toksykologicznych

• Uwrażliwienie zwierząt na ksenobiotyk

• Zwiększenie wrażliwość na ksenobiotyk

• Upodobnienie metabolizmu ksenobiotyków zwierząt do ludzkiego.

• Badanie efektów toksycznych, kancerogennych związków chemicznych

Techniki tworzenia modeli TG

• Wprowadzanie nowych genów (głównie metoda mikroiniekcji)

• Osiąganie nadekspresji wybranych genów (głównie metoda mikroiniekcji)

• Homologiczna wymiana lub nokautowanie genów (technika ES)

• Odtwarzanie mutacji występujących u ludzi (technika ES)

• Kierowanie ekspresją transgenu (topograficzne i czasowe)

• Warunkowo indukowana promotorem modyfikacja genu (np. badanie funkcji BRCA)

Przykłady zastosowania w badaniach

• Geny reporterowe - obrazowanie ekspresji transgenu

• Geny markerowe - informują czy dany gen został włączony do genomu

Pytanie: Co to są geny markerowe i reporterowe? W jakim celu się je stosuje?

• Osiąganie nadekspresji genu (Smart Mouse) - badanie funkcji receptora NMDA u myszy, leczenie stanów otępienia u ludzi

• Modele do wykrywania mutacji in vivo - stosowanie genów reporterowych: Muta Mouse®, Big Blue®

• Modele transgeniczne w badaniach metabolizmu ksenobiotyków.

• Modele transgeniczne w badaniach kancerogenezy:

• Onko Mouse® - mysz o podwyższonej podatności na indukcję kancerogenezy

• Nokautowanie genów supresorowych (np. p53)

• Wstawianie lub aktywacja onkogenów (np. białko RAS)

• Badanie interakcji gen - kancerogen

Badanie interakcji gen - gen (np. badanie aktywności czynnika transkrypcyjnego wraz z aktywowanym onkogenem)

42. Zagrożenia związane ze stosowaniem GMO.

• Alergeny

• Toksyny

• Zmniejszenie jakości pokarmu

• Rozprzestrzenianie się transgenu w środowisku (Trojane gene)

• Zmniejszenie bioróżnorodności

• „Super chwasty”

• Uzależnienie organizmu od człowieka (rośliny niepotrafiące się rozmnażać)

• Migracja międzygatunkowa wirusów

Wzrost oporności drobnoustrojów na antybiotyki

Stare pytania:

Geny markerowe

Oznaczanie ekspresji genu

Western Blotting

Mech działania oligonukleotydó antysensownych i antygenowych

Klonowanie, metody wprowadzania

RNTP

Zastosowanie i otrzymywanie cDNA

Zasada elektroforezy w warukach denaturacji

Przykłady kw nukl używanych do leczenia

3 metody używane w GMO

zastosowanie metod biologii molekularnej w diagnostyce

rola cyklin w regulacji cyklu komórkowego

GMO- co to jest? Cechy

Wektory rekombinowane

PCR- etapy

Znaczniki białkowe

Apoptoza- mech

Strategie terapii genowej w leczeniu nowotworów

Definicje rybozynu, siRNA, oligonukleotydy...

1

AAA

3`

sekwencje genu

sekwencje sy

gnałowe

promotor

sekwencje wzmacniające

5`

---