Wykład I - 4.10.2011

Prof. dr hab. Małgorzata Zdzienicka

Max 3 wykłady można opuścić - wymagane usprawiedliwienie !

Powyżej 3 nieobecności - zaliczenie z wykładów

Toksykologia - nauka o szkodliwym działaniu czynników fizycznych (np. promieniowanie jonizujące, UV) oraz chemicznych (aflatoksyny B, benzopiren) na organizmy żywe.

Cel:

• Ocena toksyczności danego czynnika

• Poznanie mechanizmów odpowiedzialnych za toksyczność

• Ocena zagrożenia (dawki, na poziomie organizmu, wyodrębnienie grupy ryzyka)

• Poszukiwanie mniej toksycznych związków (np. leków)

Stosowanie substancji toksycznych

• Medycyna (diagnostyka, prewencja, leki)

• Produkcja żywności (dodatki)

• Rolnictwo (środki ochrony roślin)

• Przemysł chemiczny (rozpuszczalniki, przemysł rafineryjny)

Ile mamy związków chemicznych??

CasRegistry:

• 31 milionów (marzec 2007);

• 55 milionów (wrzesień 2010);

• >60 milionów (aktualnie)

Baza Cas stara się gromadzić informacje o wszystkich znanych związkach chemicznych. Na CasRegistry rejestruje się średnio na dobę ok. 4.000 - 12.000 związków chem. CAS (Chemical Abstract service) np. 58-08-2 CAS Registry numer dla kofeiny

EINESC ok. 100.000 związków

Aby ocenić dane toksykologiczne muszą być wzięte pod uwagę:

• Struktura chemicznego czynnika i ważne grupy funkcyjne

• Właściwości fizyczno - chemiczne (np. rozpuszczalność, trwałoś itp.)

• Bioaktywacja i detoksykacja

• Wpływ na płodność/ rozrodczość

• Inne parametry (podrażnienia skóry, indukcja wzrostu komórki, wpływ na układ immunologiczny)

Uszkodzenia komórki (DNA, białka, membrany itp.) Biologiczne konsekwencje (mutacje, aberracje chromosomowe, apoptoza, nekroza) konsekwencje zdrowotne (nowotwory, toksyczność np. w obrębie tkanek, mutacje dziedziczne)

Efekty toksyczne różnych związków:

Związek reaktywny metabolicznie	Efekt toksyczny
Bromobenzen	Nekroza wątroby
Chlorek winylu	Rak wątroby
Anilina	--> Methemoglobinemia[Author:A]
Chloroform	Nekroza wątroby/nerek
Benzo(a)piren	Nowotwory płuc

Czynniki karcinogenne w środowisku

Kategoria	Przykład	Karcynogenność
Przemysł	Chlorek winylu	+++
Występujące naturalnie	Aflatoksyna B1	+++
Cytostatyki	Melphalan	+++
Life style	Palenie papierosów	+++

Ocena ryzyka toksykologicznego:

Przed wprowadzeniem do handlu przygotowywane są profile toksykologiczne, określające:

• Genotoksyczność

• Karcynogenność

• Toksyczność reprodukcyjna

Grupy dużego narażenia na działanie szkodliwych substancji:

• Kobiety w ciąży

• Noworodki

• Dzieci

• Starcy

• YOPIL's (Young, Old, Pregnant, Immuno-incompetent, LiverPatient)

Podział toksykologii:

Dziedziny toksykologii	Specyficzność narządowa
Kliniczna	neurotoksykologia
Zawodowa	Neurotoksykologia
Środowiskowa	Nerfotoksykologia
Żywności	Immunotoksykologia
Genetyczna (genotoksyczność - mutagenność)	Immunotoksykologia

Odkrycie mutagennego działania czynników:

Fizycznych - promieniowanie X (Henry Muller, 1927)

Chemicznych - gaz musztardowy (Auerbach and Robson 1941)

Początek toksykologii genetycznej - 1953 Watson i Crick

Zadania toksykologii genetycznej

• Wykrywanie związków genotoksycznych

• Ocena ich działania współzależność między mutagennością i karcynogennością

• Wykrywanie mutacji i zmian genetycznych oraz ich biologicznych konsekwencji

• Elektroporacja wyników doświadczalnych do człowieka

Toksykologia genetyczna opisuje procesy:

• Indukcji uszkodzeń DNA

• Naprawy uszkodzeń DNA

• indukcji zmian genetycznych i ich biologicznych konsekwencji.

Czynniki uszkadzające DNA

• Endogenne - reaktywne formy tlenu (ROS), powstające w procesach metabolicznych, błędy w replikacji

• Egzogenne - fizyczne i chemiczne

• promieniowanie jonizujące (elektromagnetyczne X) Rentgena, bomby kobaltowe i cezowe

• Cząsteczkowe - przyspieszone neutrony, cząsteczki --> delta (ja mam alfa ;[Author:A] P) oraz promieniowanie UV

• Związki alkilujące, ROS, policykliczne węglowodory aromatyczne, związki sieciujące DNA

Różne rezultaty działania czynników genotoksycznych

• Efekty toksyczne - letalne

• zahamowanie replikacji DNA

• zahamowanie transkrypcji

• śmierć komórki (nekroza, apoptoza)

• Efekty genetyczne - mutagenne

• Powstają podczas replikacji DNA

• Mutacje genowe

• Aberracje chromosomowe

• Komórki rozrodcze choroby dziedziczne

• Komórki somatyczne nowotwory

35 000 genów u człowieka x 2

6 miliardów par zasad

Struktura DNA umożliwia wierne kopiowanie informacji genetycznej

Jak uszkodzenie DNA prowadzi do mutacji? niestabilność genomu

• niestabilność chemiczna DNA

• depurynacja

• dezaminacja

• Uszkodzenia endogenne

• Metylacja (S-adenozylometionina)

• Oksydacja (reaktywne formy tlenu [ROS])

• Wolne rodniki

• Uszkodzenia egzogenne

• Promieniowanie UV

• Czynniki chemiczne (cytostatyki, azbest, nitrozoaminy)

• Podwójne pęknięcie DNA (DSB)

• Małe modyfikacje zasad

• Addukty DNA (bulky adducts)

• Reakcje metaboliczne i ich efekty aktywacja metaboliczna (metabolizm czynników chemicznych poddawanych przemianie w organizmie)

Wolne rodniki tlenowe, czynniki alkilujące depurynacja DNA miejsce pozbawienia zasady (a-basic site, AP), 8-oxyguanina po replikacji DNA powstaje mutacja punktowa; naprawa przez wycinanie BER (base excision repair).

Człowiek posiada ok. 3% zmetylowanego DNA

Dezaminacja, np. z cytozyny na uracyl

Uszkodzenie oksydacyjne zasad - utrata/zmiana właściwości parowania zasad.

ROS:

• 8-okso-guanina (powoduje błędne parowanie zasad, zarówno z C jak i z A)

• 8-okso-adenina

• Glikol tyminy

• 5-hydroksyuracyl

Mechanizm powstawania mutacji punktowych: potrzebne 3 rundy replikacyjne (AT-GC)

Promieniowanie UV

Policykliczne węglowodory aromatyczne (6-4)PP bulky adducts CPD dimery pirymidynowe naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER - nucleotide excision repair)

Promieniowanie jonizujące

Czynniki przeciwnowotworowe (cis Pt, MMC) wiązania sieciujące, krzyżowe (cross-link), pęknięcia podwójnej nici naprawa rekombinacyjna (HR, EJ)

Błędy w replikacji

Złe parowanie zasad A-G mismatch, T-C mismatch, delecje, insercje mismatch repait (MMR)

Uszkodzenia DNA indukowane przez:

• UV

• Dimery pirymidynowe cyklobutanu

• 6-4 fotoprodukty

• Promieniowanie jonizujące

• SSB/DSB

• uszkodzenia zasad

• Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA/PAH)

• Pochodne benzo(a)pirenu (dym papierosowy)

• Aflatoksyna B₁ (pożywienie)

• Uszkodzenia alkilacyjne zasad (Zanik właściwości parowania zasad) - Przyłączanie grup alkilacyjnych (np. CH₃)

• Np. alkilacja guaniny O-6 Ethylguanina jako produkt (GCAT)

• Alkilacja tyminy O-4 Ethyltymina jako produkt (TACG)

• Zmiana właściwości parowania zasad

Czynniki alkilujące - typy adduktów DNA

• Monoaddukty DNA (monofukcyjne)

• Siarczan metylu - DMS (Dimethylsulfate)

• Polifunkcyjne (tworzenie wiązań krzyżowych DNA)

• Busulfan

Formowanie adduktów DNA przez dwufunkcyjny Iperyt azotowy (nitrogen mustard, mechlore thamine, MEC)

Powstają wiązania krzyżowe między deoksyrybozami.

deoksyryboza - CH₂ - CH₂ - N(CH₃) - CH₂- CH₂ - deoksyryboza

lub monoaddukt:

deoksyryboza - CH₂ - CH₂ - N(CH₃) - CH₂- CH₃

Wiązania międzyniciowe DNA (interstrand crosslinks) blokują transkrypcję i replikację.

Jest to jeden z mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych, np. cis platyny.

Podwójne pęknięcie (DSBs)

Powstają w czasie replikacji (zatrzymanie się widełek replikacyjnych) oraz po naświetlaniu promieniowaniem jonizującym

Nieprawidłowe DSBs są letalne.

Gdzie mogą powstać mutacje:

• We wszystkich miejscach chromosomu (genu)

• Większość jest typu „silent”, to znaczy, że nie uszkadzają funkcji genu

• Mutacje zachodzące w genach mogą, ale nie muszą prowadzić do uszkodzenia funkcji danego genu.

Mutacje w genie

1. Promotor: mogą wpływać na wydajność transkrypcji, na ekspresję

2. Ekson: uszkodzenie funkcji; mogą wpływać na strukturę białka

3. Miejsce splicingowe: mogą uszkodzić splicing (wpływ na pominięcie eksonu)

4. Intron: brak efektu.

Delecje, insercje i translokacje na poziomie chromosomu i genu.

Klasyfikacja zmian molekularnych w DNA

Mikrouszkodzenia:

Zmiana par zasad:

dziki: Lys Gln Val

5' AAG CAA GTT 3'

3' TTC GTT CAA 5'

Nonsens Lys STOP Val

5' AAG TAA GTT 3'

3' TTC AAT CAA 5'

Mutacja nonsensowna skrócenie białka (częściowa utrata funkcji); kodon stop

Mutacje zmiany sensu zamiana aminokwasu (częściowa utrata funkcji)

Zmiana ramki odczytu skrócenie białka ([częściowa]utrata funkcji); często kodon stop

Makrouszkodzenia (wykrywane metodami cytogenetycznymi)

• Aberracje chromosomowe

• Aberracje numeryczne

• Nondysjunkcja aneuploidie

• Toksyny wrzeciona podziałowego

• Zaburzenia centrosomu

• AP-site (są konsekwencją przerwania i ponownego połączenia DSB - złamania chromosomów)

• Aberracje strukturalne

• Typ chromatyda chromosom

• stabilne - niestabilne aberracje

• strukturalne aberracje chromosomowe (CA's) są konsekwencją przerwania i ponownego połączenia DSB (złamania chromosomów) i pozwalają ocenić …….

Błędy w czasie segregacji chromosomów - aneuploidie:

• U człowieka - częstość występowania komórek aneuploidalnych w ciele - bardzo niska:

• 1-2 % u ludzi (w wieku 20-25 lat)

• 9% u kobiet (70-75 lat)

• 7% u mężczyzn (70-75 lat)

• Np. Zespół Downa, Turnera

• Większość zarodków aneuploidalnych jest eliminowana przez aborcje spontaniczne (częstość zwiększona z wiekiem)

• Utrata lub dodatkowy chromosom może prowadzić do rozwoju nowotworów, bo wiadomo, że wiele nowtworów rozwija się w wyniku monosomii lub trisomii pewnych chromosomów. Przykład: monosomia może prowadzić do utraty genów supresorowych, jak wykazano podczas retinoblastomy nowotworu Wilmsa, np. nowotwór piersi, gdzie odpowiedzialny jest BRCA1.

Poliploidia

• Występuje normalnie w ludzkim szpiku kostnym (megakariocyty - mają zazwyczaj 8-16x liczby haploidalnej)

• Tetraploidy występują normalnie w regenerujących się komórkach wątroby i innych tkanek

• Nienormalny kariotyp

• SV 40 transformowanych fibroblastach

• Generalnie w nieśmiertelnych liniach komórkowych

Aberracje strukturalne

• Typu chromosomowego - zmiana w obydwu chromatydach

• Typu chromatydowego (indukowanego głównie przez mutageny chemiczne) - złamanie pojedynczej chromatydy lubz łamanie orazz ponowne połączenie chromatydy

Rodzaj aberracji zależy od czynnika typu indukowanego uszkodzenia w DNA, momentu cyklu życiowego komórki w czasie ekspozycji

• Typ czynnika:

• S niezależny (X-ray)

• S zależny (UV, CH₃)

• Promieniowanie jonizujące:

• G₁ chromosomowy typ

• G₂ chromatydowy typ

• S - obydwa typy

Skutki aberracji chromosomalnych (CA)

1. 1-2% noworodków CA

2. 50% spontanicznych aberracji CA

3. Większość komórek nowotworowych CA

4. Większość czynników genotoksycznych CA

5. Wiele wirusów jest przyczyną CA

6. Wiele chorób z zapadalnością na nowotwory wykazuje CA

Choroby dziedziczne z niestabilnością genomu

• Syndrom Bloom'a (BS)

• Xeroderma Pigmentosium (XP)

• Ataksja Teleangiektazja (AT)

• Nijmegen Breakage Syndrom (NBS)

• anemia Fanconi'ego (FA)

• Rozwój choroby nowotworowej

Żelazo na +III zamiast +II

Też mam alfa

---