Badanie właściwości fizykochemicznych aminokwasów

Identyfikacja aminokwasów

Białka, jak i wolne aminokwasy reagują za pośrednictwem grup: -NH₂ i -COOH z ninhydryną, dinitrofluorobenzenem i kwasem azotowym (III). Występowanie w strukturze aminokwasów innych grup funkcyjnych, oprócz aminowej i karboksylowej, umożliwia identyfikację tych aminokwasów na podstawie czułych reakcji barwnych.

Reakcja biuretowa

Nazwa pochodzi od biuretu, związku powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180^OC. Reakcję biuretową dają wszystkie połączenia zawierające w cząsteczce co najmniej 2 grupy -CO-NH- połączone ze sobą bezpośrednio (np. w diamidzie kwasu szczawiowego NH₂-CO-CO-NH₂), poprzez azot (w biurecie) lub poprzez atom węgla (w diamidzie kwasu malonowego, bursztynowego, w produktach hydrolizy białek). W wyniku utworzenia połączenia koordynacyjnego Cu²⁺ z dwoma przyległymi wiązaniami -CO-NH- powstaje barwny produkt. Dodatniego odczynu reakcji biuretowej nie dają wolne aminokwasy i dipeptydy.

Wykonanie:

Do 1 ml danej próby dodać 1 ml NaOH i kilka kropli 0,5% CuSO₄ W obecności białka powstaje fioletowe zabarwienie. Uwaga: ponieważ niebieska barwa odczynnika może maskować właściwy odczyn należy unikać nadmiaru CuSO₄.

Reakcja ninhydrynowa

Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji cząsteczki zredukowanej i utlenionej ninhydryny z amoniakiem powstaje niebiesko-fioletowe zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasów.

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać 3-4 krople 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Po wymieszaniu próbę ogrzać do wrzenia. Wszystkie aminokwasy (oprócz proliny) reagują z ninhydryną tworząc niebieskie zabarwienie.

Reakcja ksantoproteinowa

Aminokwasy aromatyczne oraz fenole ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym HNO₃, dając żółto zabarwione pochodne nitrowe (fenyloalanina wymaga do nitrowania dodatku H₂SO₄).

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać 0,5 ml stężonego HNO₃ i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 2 min. Wytrąca się żółty osad.

Reakcja Adamkiewicza

Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy. W obecności kwasu siarkowego i formaldehydu (kwas glioksalowy) dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji:

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli formaldehydu. Po wymieszaniu roztwór podwarstwić (po ściance) stężonym H₂SO₄. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień.

Reakcja Millona

Reakcja na wykrywanie tyrozyny jest mało specyficzna, ponieważ dodatni wynik dają również związki zawierające reszty fenolowe.

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli odczynnika Millona. Mieszaninę ogrzewać w łaźni wodnej przez kilka minut. W przypadku obecności tyrozyny pojawia się biały osad, który zabarwia się na żółto, a później na czerwono (lub powstaje czerwone zabarwienie roztworu).

Wykrywanie cysteiny i cystyny

Zawarta w cysteinie i cystynie siarka w silnie zasadowym środowisku ulega uwolnieniu w postaci jonów siarczkowych, które z jonami Pb²⁺ dają czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku w tej reakcji. Schemat przebiegu reakcji:

Wykonanie:

Do 1 ml próby badanej dodać 1 ml roztworu octanu ołowiu i 3 ml 10% roztworu NaOH (roztwór powinien być klarowny). Próbkę ogrzewać na łaźni wodnej, po kilku minutach pojawia się czarny osad.

Wykrywanie glutaminy

Próba na obecność glutaminy wykorzystuje obecność w jej cząsteczce ugrupowania amidowego, z którego w warunkach hydrolizy zasadowej uwalnia się gazowy amoniak. Dodatni wynik tej reakcji dają też asparagina i sole amonowe.

Wykonanie:

Do 3 ml próby badanej dodać 3 ml 10% NaOH (roztwór dodać do probówki pipetą, tak aby nie dotknąć jej wylotu). Całość umieścić we wrzącej łaźni wodnej a do wylotu probówki zbliżyć zwilżony uniwersalny papierek lakmusowy. W przypadku obecności glutaminy papierek zmienia zabarwienie na niebieski Uwaga: należy uważać, aby nie dotknąć papierkiem brzegu probówki. wówczas zmiana zabarwienia papierka następuje na skutek obecności NaOH a nie amoniaku.

WF - ćw.1; OML - ćw.1; BL - ćw.1

1

---