1. Poradnictwo genetyczne - czym jest i jakim być powinno.

1. Proszę określić szacunkową częstość występowania chorób genetycznych w populacji.

Z analizy danych dotyczących częstości występowania chorób genetycznie uwarunkowanych w populacji noworodków wynika, że corocznie w krajach Europy co najmniej 2% noworodków wymaga objęcia opieką poradni genetycznych.

Szacuje się, że około 0,4-0,6% noworodków obarczonych jest zaburzeniami rozwoju uwarunko­wanych aberracjami chromosomowymi; one też stanowią istotną przyczynę niepowodzeń ciąży oraz martwych urodzeń. Mimo iż większość chorób monogenowych to choroby rzadko występu­jące w populacji, znanych jest obecnie ponad 10 tys. chorób o tym typie uwarunkowania. Stano­wią one około 10% przyczyn hospitalizacji i odpowiedzialne są za około 7% martwych urodzeń i zgonów okołoporodowych.

Choroby wieloczynnikowe stanowią największą liczbowo grupę chorób genetycznych. Szacuje się, że ten typ uwarunkowania dotyczy około 20% wszystkich wad rozwojowych i około ¹/₄-¹/₃ przypadków chorób przewlekłych u dorosłych. Wady rozwojowe stwierdza się natomiast u około 3% noworodków, przy czym blisko połowa z nich uwarunkowana jest czynnikiem genetycznym.

2. Co określa termin „poradnictwo genetyczne” i jakie są jego cele?

Istnieje kilka bardziej lub mniej zwięzłych definicji poradnictwa genetycznego. Definicja, która, jak się wydaje, najpełniej określa jego istotę, sformułowana przez Frasera w 1974 r., stwierdza, że „…jest ono procesem mającym na celu wyjaśnienie osobie konsultowanej wszystkich proble­mów wynikających z wystąpienia lub ryzyka wystąpienia choroby genetycznej w rodzinie”.

Działalność ta, prowadzona przez jedną lub więcej odpowiednio przygotowanych osób, ma po­móc choremu lub jego rodzinie w zakresie następujących celów:

1. Uzyskanie pełnej informacji o rozpoznanej chorobie genetycznej, jej przebiegu oraz istnieją­cych możliwościach leczenia.

2. Zrozumienie istoty genetycznego uwarunkowania choroby oraz ocena ryzyka jej wystąpie­nia u określonych członków rodziny.

3. Właściwe zinterpretowanie ryzyka ponownego wystąpienia choroby u potomstwa.

4. Przyjęcie takiego postępowania, które będzie wynikiem decyzji podjętej przez konsultowa­nych w zgodzie z uzyskaną wiedzą, przekonaniami oraz uznawanymi celami życiowymi.

5. Podjęcie takich form postępowania, które umożliwią optymalne przystosowanie chorego do życia w środowisku oraz podjęcie działa zmierzających do zmniejszenia ryzyka ponownego wystąpienia choroby w rodzinie.

1. Proszę omówić metodykę poradnictwa genetycznego.

W praktyce poradnictwa genetycznego wyróżnia się kilka etapów warunkujących prawidłowość jego funkcjonowania. Warunkiem podstawowym udzielenia porady genetycznej jest prawidłowe ustalenie rozpoznania choroby (1). W zbieraniu informacji genetycznych istotnym elementem jest właściwa konstrukcja i analiza rodowodu konsultowanej rodziny (2). Umożliwia ona okre­ślenie toku przekazywania cechy lub choroby w rodzinie, a także ustalenie, którzy z członków rodziny ponoszą zwiększone ryzyko genetyczne i jak rozległe badania diagnostyczne należy przewidzieć i zaplanować. Znajomość toku dziedziczenia poszczególnych chorób oraz umiejęt­ność jego interpretacji w świetle danych rodowodowych oraz wyników badań diagnostycznych jest warunkiem właściwej oceny wielkości ryzyka genetycznego dla poszczególnych członków rodziny (3). Ostatnim etapem jest proces przekazywania porady genetycznej (4).

2. Jakie są zasady oceny ryzyka genetycznego - proszę omówić na przykładzie chorób monogeno­wych, poligenowych i aberracji chromosomowych.

Tabela 2, str. 14.

3. Proszę zinterpretować wymóg niedyrektywności poradnictwa genetycznego.

Porada genetyczna powinna mieć charakter informacyjny, a nie dyrektywny. Należy wobec tego pamiętać, iż treść, a także forma informacji przekazywanych w trakcie porady genetycznej, czę­sto odnosząc się do podstawowych problemów i wartości osoby ludzkiej, mogą mieć istotny wpływ na decyzje o planowaniu lub rezygnacji z kolejnych ciąż, a niekiedy warunkują dalsze funkcjonowanie rodziny. Zasadą uznawaną przez znakomitą większość osób prowadzących po­radnictwo genetyczne jest pogląd, że decyzje pacjentów dotyczące zarówno planowania ciąży, jak i akceptacji badań prenatalnych, przerwania ciąży po wykryciu choroby płodu czy też adopcji powinny być podejmowane przez samych konsultowanych w zgodzie z ich wiedzą, przekona­niami, uznawanym światopoglądem, celami życiowymi i systemem wartości.

4. Proszę omówić zasadnicze aspekty psychologiczne poradnictwa genetycznego i wynikające z nich wymogi dla procesu przekazywania treści porady.

Oceniając proces poradnictwa w kontekście problemów psychologicznych, wymienia się cztery następujące fazy stanów psychicznych u rodzin zasięgających porady z powodu rozpoznania cho­roby genetycznej u dziecka: 1) wstępnego szoku i załamania, 2) lęku, 3) złości lub poczucia winy i 4) depresji. W praktyce poradnianej są one widoczne wyraźnie. Prowadzenie rozmowy z rodzi­nami ryzyka genetycznego, szczególnie w kontekście ich planów prokreacyjnych, wymaga więc uwzględnienia wielu bardzo delikatnych w swej istocie czynników natury psychologicznej i emocjonalnej.

Informacje uzyskane w poradni genetycznej stają się często źródłem głębokich, niekiedy tragicz­nych przeżyć konsultowanych rodzin. Dlatego proces przekazywania porady genetycznej powi­nien uwzględniać wiele warunków i okoliczności wynikających z istoty i treści przekazywanych informacji. Porada genetyczna powinna być udzielana wtedy, kiedy rodzina rzeczywiście jest zainteresowana jej uzyskaniem. W rozmowie powinni uczestniczyć oboje rodzice chorego dziecka. Ze względu na charakter omawianych problemów rodzinie należy zapewnić poczucie pełnej intymności, rozmowy, otwartości i zaufania do konsultującego lekarza. Rozmowa powinna być prowadzona językiem prostym i zrozumiałym. Należy również uwzględnić poziom wy­kształcenia i środowisko konsultowanych osób.

6. Proszę wymienić okoliczności, które nakładają na lekarza obowiązek przekazania pacjentom infor­macji o możliwości przeprowadzenia badania prenatalnego ze względu na zwiększone ry­zyko wystąpienia choroby genetycznej (wrodzonej) u potomstwa.

Tabela 5, str. 15.

7. Proszę wymienić kryteria uzasadniające diagnostykę prenatalną choroby genetycznej.

Tabela 6, str. 15.

2. Inwazyjna diagnostyka przedurodzeniowa.

1. Jakie główne cele wytycza program inwazyjnej diagnostyki przedurodzeniowej - PIDP?

Głównymi celami diagnostycznymi programu PIDP są:

1. wykluczenie aberracji chromosomowej jako potencjalnego czynnika ryzyka choroby płodu;

2. wykluczenie wad OUN poprzez określenie stężenia α-fetoproteiny w płynie owodniowym, oznaczenie ilościowe (spektrofotometryczne) aktywności acetylocholinesterazy i choline­sterazy oraz ich oznaczenia jakościowe;

3. pozyskanie próbki DNA płodu, a następnie określenie ryzyka choroby płodu drogą badania mutacji DNA, badań biochemicznych lub analizy sprzężeń.

Dwa pierwsze cele programu PIDP są celami obligatoryjnymi i muszą być realizowane łącznie w każdym przypadku amniopunkcji wykonywanej dla celów poradnictwa genetycznego. Trzeci program diagnostyczny realizowany jest w przypadkach wyselekcjonowanych na podstawie da­nych z wywiadu lekarskiego.

1. Jakie wskazania lekarskie kwalifikują ciężarną do programu PIDP?

Wyróżniamy następujące wskazania lekarskie do przeprowadzenia diagnostyki przedurodzenio­wej są:

1. wiek ciężarnej powyżej 35 roku życia;

2. wynik testu przesiewowego surowicy ciężarnej MSS (Maternal Serum Screening) wskazu­jący na podwyższone ryzyko aneuploidii chromosomowych lub otwartych wad OUN i/lub nieprawidłowy wynik badania USG;

3. nosicielstwo przez jedno lub oboje rodziców aberracji strukturalnej chromosomów;

4. urodzenie dziecka ze zdiagnozowaną aberracją chromosomową;

5. wysokie ryzyko wystąpienia chorób sprzężonych z płcią (w związku z 25% ryzykiem cho­roby u dziecka płci męskiej zwykle poprzestaje się na określeniu płci płodu metodami cyto­genetycznymi lub molekularnymi);

6. niektóre choroby, zależne od możliwych do zdiagnozowania mutacji pojedynczych genów (o celowości przeprowadzenia w poszczególnych przypadkach analizy mutacji lub analizy sprzężeń dowiadujemy się, oceniając obciążony wywiad lekarski lub na podstawie wyników populacyjnych badań przesiewowych);

7. obciążający wywiad rodzinny lub wynik testu przesiewowego MSS w kierunku wad OUN;

8. wskazania natury psychologicznej.

Niezależnie od konieczności przestrzegania powyższych wskazań lekarskich do przeprowadze­nia inwazyjnej genetycznej diagnostyki przedurodzeniowej, należy zwracać uwagę na spełnienie warunków niezbędnych do przeprowadzenia badania.

1. Jaką aberrację chromosomową wykrywamy najczęściej realizując program PIDP?

Najczęściej spotykaną aberracją chromosomowa jest trisomia chromosomu 21 (w badaniach przeprowadzanych w ciągu 15 lat w Zakładzie Genetyki Medycznej UM w Łodzi: 23,3%).

2. Jak powinien być wyposażony gabinet zabiegowy, w którym przeprowadzany jest zabieg amniopunk­cji?

Zabiegi amniopunkcji muszą być przeprowadzane w pomieszczeniu odpowiadającym warunkom aseptycznego gabinetu zabiegowego przy stałym monitorowaniu warunków sanitarnych pracy przez właściwą Stację Sanitarno-Epidemiologiczną. W każdym przypadku zakłada się standar­dową dokumentację lekarską, zwracając uwagę na wszystkie okoliczności, które mogłyby powi­kłać stan ciężarnej po zabiegu amniopunkcji. Po przygotowaniu ciężarne są badane ginekolo­gicznie, palpacyjnie oraz z użyciem wziernika, w celu oceny stanu szyjki macicy w obecnej ciąży. Operator ubrany jest w jałowy fartuch chirurgiczny, maskę i gumowe rękawice; podobnie ubrana jest asysta. Powłoki brzuszne ciężarnej myje się trzykrotnie roztworem 70% alkoholu etylowego, a następnie alkoholowym roztworem 1% jodyny. Pole operacyjne obkłada się jało­wymi serwetami. Igłę wkłuwa się do największej i najłatwiej dostępnej kieszeni worka owo­dniowego, uwzględniając lokalizację łożyska i aktualne położenie płodu, przy czym należy uni­kać obrzeży worka owodniowego i zabiegać o zachowanie kąta prostego pomiędzy osią wkłucia igły i powierzchnią worka owodniowego. Czynności powyższe przeprowadza się przy użyciu wysokiej klasy ultrasonografu. Głowicę, po zwilżeniu jałowym żelem, umieszcza się w jałowym worku foliowym, uzbrajając w prowadnicę umożliwiającą monitorowanie procesu wkłucia igły.

3. Z jakim ryzykiem utraty ciąży wiąże się zabieg amniopunkcji?

Ocenia się, że realizacja programu PIDP obarczona jest ryzykiem utraty ciąży mniejszym niż 1%.

4. W jakim odsetku ciężarnych skierowanych na inwazyjną diagnostykę PIDP wykrywamy aberracje chromosomowe?

Według badań przeprowadzonych w Zakładzie Genetyki Medycznej UM w Łodzi: 4,27% (wraz z wariantami chromosomowymi: 5,76%).

5. W jakim odsetku ciężarnych skierowanych na inwazyjną diagnostykę PIDP wykrywamy wady otwarte OUN?

Według badań przeprowadzonych w Zakładzie Genetyki Medycznej UM w Łodzi: 1,44%.

8. Czy konsekwentnie realizowany program PIDP może zwiększyć pulę patogennych genów w popula­cji?

Powszechnie dostępny program diagnostyki przedurodzeniowej, stosowany przez odpowiednio długi okres czasu, może przynieść niezamierzony efekt w postaci zwiększenia liczby nosicieli chorób uwarunkowanych genetycznie. Interpretacja tego potencjalnego zagrożenia zmusza do stwierdzenia, że program diagnostyki przedurodzeniowej dedykowany jest zdrowiu i szczęściu indywidualnej rodziny, a w mniejszym stopniu populacji jako takiej.

3. Prenatalna diagnostyka cytogenetyczna chorób genetycznych. Klasyczne metody i zasady oceny kariotypu.

1. Jakie są wskazania do prenatalnej oceny kariotypu?

Tabela 1, str. 28.

2. Od czego zależy wielkość ryzyka wystąpienia niezrównoważonej aberracji strukturalnej u potom­stwa nosicieli translokacji chromosomowych?

Ryzyko wystąpienia u potomstwa niezrównoważonej aberracji zależy od wielu czynników, mię­dzy innymi od rodzaju translokacji, liczby uczestniczących w niej chromosomów, dokładnej lo­kalizacji punktów złamań, a także od płci nosiciela translokacji.

3. W którym tygoniu ciąży wykonywane są zazwyczaj prenatalne badania cytogenetyczne zzastosowa­niem amniopunkcji, biopsji kosmówki oraz kordocentezy?

Tabela 4, str. 29.

4. Czym się różnią dwie stosowane w prenatalnych badaniach cytogenetycznych metody otrzymywa­nia i analizy preparatów chromosomowych?

Preparaty chromosomowe otrzymywać można drogą hodowli komórek (amniocytów lub komó­rek zrębu mezodermalnego kosmków) bądź metodą „bezpośrednią (p. 3.5).

W metodzie hodowli zarówno amniocyty, jak i komórki kosmówki rosną przyrośnięte do dna na­czynia hodowlanego, tworząc kolonie (z każdej komórki powstaje jedna kolonia). Hodowla wy­maga stosowania odpowiednich podłóż i określonych warunków inkubacji. Rodzaj stosowanego naczynia i związany z nim sposób prowadzenia hodowli ma istotne znaczenie dla czasu trwania hodowli oraz metody otrzymywania preparatów chromosomowych i ich analizy. Wyróżniamy dwie metody otrzymywania preparatów chromosomowych: z zawiesiny komórek oraz z hodowli pierwotnych in situ.

Otrzymanie preparatu z zawiesiny komórek wymaga ich enzymatycznego odklejenia (zazwyczaj trypsyną) od dna naczynia hodowlanego. W metodzie tej nie ma możliwości stwierdzenia, z któ­rych kolonii pochodzą analizowane komórki. Inną jej wadą jest długi czas hodowli. Zaletami metody są dobra jakość techniczna preparatów i możliwość uzyskania w razie potrzeby dodatko­wych preparatów chromosomów.

Analiza chromosomów in situ w pierwotnych hodowlach komórek nie wymaga odklejania ich od szkiełka, na którym znajdują się kolonie komórkowe. Metoda ta jest mniej pracochłonna, tańsza i pozwala na łatwiejszą interpretację mozaikowości chromosomowej. Jakość techniczna prepara­tów jest jednak niższa, liczba komórek do analizy mniejsza, a przy tym brak możliwości uzyska­nia dodatkowych preparatów chromosomowych.

5. Wymień podstawowe zalety i wady „bezpośredniej” metody oceny kariotypu w komórkach ko­smówki.

Możliwość uzyskania preparatów chromosomowych bezpośrednio z pobranej do badania ko­smówki zapewnia duża aktywność mitotyczna warstwy cytotrofoblastycznej kosmków in vivo. W metodzie „bezpośredniej” nie stosuje się hodowli - preparaty chromosomowe sporządzane są po 1-3-godzinnej inkubacji kosmków w pożywce z kolcemidem (niekiedy stosowana jest dłuższa, 24- lub 48-godzinna inkubacja kosmków w medium hodowlanym w celu zwiększenia liczby ko­mórek mitotycznych i uzyskania lepszych chromosomów do analizy).

Metoda „bezpośrednia” pozwala szybko uzyskać wynik badania (1 do 3 dni). Nie występuje w niej też niebezpieczeństwo oznaczenia kariotypu matki zamiast kariotypu płodu, ponieważ w tkankach matczynych, mogących się znajdować w materiale biopsyjnym, nie ma dzielących się komórek. Stosowanie tej metody wiąże się natomiast z ryzykiem stwierdzenia aberracji chromo­somowej (zazwyczaj w mozaice z komórkami prawidłowymi, 1-2% badań) obecnej tylko w ko­smówce, nie występującej natomiast w komórkach płodu.

6. Dlaczego wynik badania diagnostycznego uzyskany metodą hodowli komórek kosmówki jest bar­dziej wiarygodny niż wynik uzyskany metodą „bezpośrednią”?

Wynik badania uzyskany przy zastosowaniu hodowli komórek zrębu mezodermalnego kosmków jest bardziej wiarygodny niż wynik uzyskany metodą „bezpośrednią”, ponieważ komórki zrębu pochodzą z węzła zarodkowego blastocysty, z którego rozwija się również zarodek.

7. Jakie są wskazania do prenatalnej oceny kariotypu we krwi pępowinowej?

Ocena kariotypu we krwi pępowinowej dokonywana jest tylko w szczególnych sytuacjach dia­gnostycznych - najczęściej w przypadku stwierdzenia w badaniu ultrasonograficznym wad roz­wojowych płodu, sugerujących aberrację chromosomową, oraz w celu weryfikacji kariotypu uzy­skanego z amniocytów lub kosmówki.

8. Jakie wyniki prenatalnej analizy cytogenetycznej sprawiają zazwyczaj problemy w interpretacji cy­togenetycznej i klinicznej kariotypu?

Problemy interpretacyjne sprawiają najczęściej te wyniki badań, w których stwierdzana jest:

1. zrównoważona aberracja strukturalna powstała de novo - nie ma bowiem w takim przypadku pewności, czy aberracja jest rzeczywiście w pełni zrównoważona (dane kliniczne wskazują, że ryzyko nieprawidłowego fenotypu wynosi w takich przypadkach około 7%);

2. chromosomy markerowe - obecnie dzięki technice FISH można stosunkowo łatwo ustalić, od którego z chromosomów pochodzi chromosom mar, mimo to ocena skutków klinicznych obecności takich chromosomów jest w wielu przypadkach trudna lub niemożliwa;

3. mozaikowość i pseudomozaikowość - kliniczna interpretacja kariotypu mozaikowego spra­wia wiele problemów (wynika to z dużej różnorodności i zmienności indywidualnej fenotypu związanego z określonym rodzajem mozaikowości); ponadto często trudno rozstrzygnąć, czy mamy do czynienia z mozaikowością, czy z pseudomozaikowością.

Rzadziej problemy interpretacyjne dotyczą wzrostu w hodowli komórek pochodzenia matczy­nego.

1. Jaka jest definicja mozaikowości i pseudomozaikowości?

Mozaikowość prawdziwa definiowana jest jako obecność nieprawidłowych komórek w co naj­mniej dwóch koloniach znajdujących się w co najmniej dwóch naczyniach hodowlanych, jeśli badanie wykonywane jest metodą in situ. W przypadku analizy preparatów sporządzanych z za­wiesiny komórek mówimy o niej, jeśli nieprawidłowe komórki pochodzą z dwóch naczyń ho­dowlanych. Mozaikowość prawdziwa stwierdzana jest w 0,25% badań.

Pseudomozaikowość definiowana jest jako obecność jednej lub wielu nieprawidłowych komórek tylko w jednym z kilku naczyń hodowlanych. Może polegać na występowaniu jednej lub wielu nieprawidłowych komórek. Powstaje zazwyczaj podczas hodowli in vitro, ale może być też wy­nikiem obecności w hodowli nieprawidłowych komórek pochodzących z błon płodowych i trofo­blastu lub komórek matki.

2. Jakie są minimalne możliwe do zaakceptowania standardy dotyczące skuteczności prenatalnych ba­dań cytogenetycznych?

Odpowiednio wysoki standard prenatalnych badań cytogenetycznych dotyczy procedury i meto­dyki badania, sposobu przedstawiania i interpretacji wyniku, a także okresu ciąży, w którym ba­danie jest wykonywane, i jakości uzyskanego materiału do badania. Minimalne standardy doty­czące skuteczności badań wynoszą odpowiednio: 97-98% dla badania płynu owodniowego i ko­smówki, 96% dla badania krwi pępowinowej.

4. Kliniczne aplikacje technik cytogenetyki molekularnej w procesie diagnostyki prenatalnej wybra­nych przypadków aberracji chromosomowych.

1. Jaka jest rola technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce prenatalnej?

Rozwój cytogenetyki molekularnej zasadniczo zwiększył możliwości diagnostyczne chorób uwa­runkowanych przez aberracje chromosomowe i wprowadził je na nowy poziom.

Diagnostyka chorób genetycznie uwarunkowanych o niejasnej etiopatogenezie opiera się w obecnej chwili na technice FISH, zwłaszcza wtedy, gdy istnieje konieczność oceny subtelnych zmian w obrębie struktury chromosomów. Technika ta skuteczna jest w identyfikacji rearanżacji chromosomowych i chromosomów markerowych, a także w diagnostyce niektórych aberracji chromosomowych w komókach okresu interfazy. Pozwala dokładnie określić punkty złamań chromosomowych i dzięki temu prowadzić badania nad strukturą i funkcją specyficznych regio­nów chromosomowych.

Nowe narzędzia diagnostyczne ilościowej cytogenetyki molekularnej, CGH i mCGH, pozwalają na detekcję rzadkich rearanżacji subchromosomowych, takich jak mikrodelecje czy mikrodupli­kacje chromosomów w przypadkach zespołów wad rozwojowych i/lub opóźnienia rozwoju umy­słowego.

2. Co to jest UPD i jakie mogą być jej konsekwencje kliniczne?

Disomia jdnorodzicielska (UPD) jest to stan, w którym obydwa chromosomy homologiczne określonej pary pochodzą tylko od jednego, zamiast od obojga rodziców. W obrębie UPD wyróż­nia się heterodisomię (od jednego z rodziców pochodzą dwie różne kopie określonego chromo­somu) i izodisomię (od jednego z rodziców pochodzą dwie identyczne kopie).

Mechanizmy powstawania UPD to:

• komplementacja gamet (połączenie gamety disomicznej z nullisomiczną - heterodisomia);

• korekta stanu trisomicznego na drodze nondysjunkcji mitotycznej w zygocie (możliwa mozai­kowość disomia/trisomia);

• duplikacja chromosomu w monosomicznej zygocie (izodisomia);

• błędy mitotyczne (nieuprawniona rekombinacja mitotyczna w zygocie, skutkująca częściową izodisomią).

Konsekwencjami klinicznymi UPD mogą być:

1. utrata heterozygotyczności (LOH) - ujawnianie się chorób autosomalnych recesywnych u nosi­cieli mutacji, przenoszenie chorób sprzężonych z chromosomem X z ojca na syna, ujaw­nianie się chorób recesywnych sprzężonych z chromosomem X u kobiet, które dziedziczą od jednego z rodziców dwie identyczne kopie chromosomu X ze zmutowanym allelem;

2. nieprawidłowy imprinting (utrata imprintingu);

3. nieprawidłowy rozwój embrionalny związany z obecnością trisomicznej linii komórkowej (mo­zaikowość we wczesnym życiu płodowym).

2. Jakie są wskazania do przeprowadzenia interfazowej cytogenetyki prenatalnej?

Aberracje chromosomowe są przyczyną ponad 400 wrodzonych zespołów klinicznych, z których większość występuje sporadycznie. Większość z nich stanowią aberracje liczbowe chromoso­mów, z których najpowszechniejsze to trisomia chromosomu 21 i aneuploidie gonosomów. Pozo­stałe aneuploidie chromosomów, tj. trisomia chromosomu 18 czy 13, stanowią istotną przyczynę zgonów w okresie noworodkowym i wczesnym okresie niemowlęcym. Aplikacja wielokolorowej techniki FISH do niehodowanych amniocytów znacząco skraca czas oczekiwania na wynik bada­nia przez możliwość analizowania jąder interfazowych bezpośrednio po uzyskaniu próbki płynu owodniowego. Wynik testu dostępny jest już po kilkunastu godzinach od zabiegu amniocentezy. Badanie umożliwia także określenie płci chromosomowej płodu, co ma szczególne znaczenie w przypadkach podejrzenia u płodu choroby jednogenowej sprzężonej z płcią, zwłaszcza wtedy, gdy badanie w kierunku swoistej mutacji nie jest możliwe do przeprowadzenia w krótkim czasie.

Po uwzględnieniu pewnych ograniczeń związanych ze stosowaniem prenatalnej cytogenetyki in­terfazowej można określić następujące wskazania do przeprowadzenia tego badania:

1. Konieczność przeprowadzenia diagnostyki prenatalnej w ciąży powyżej 20 tygodnia.

2. Stwierdzenie wad rozwojowych płodu w badaniu USG.

3. Zwiększenie przezierności karkowej.

4. Zwiększone ryzyko (≥1:250) aneuploidii płodu określone biochemicznymi testami przesiewo­wymi (MSS).

5. Zasady oszacowania ryzyka genetycznego w rodzinach nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych.

1. Jakiego rodzaju patologii ciąży można się spodziewać u par małżeńskich nosicieli translokacji chromosomowych wzajemnych (TCW) i dlaczego?

Nosicielstwo TCW może być przyczyną powstawania wad rozwojowych, zespołów cech dysmor­ficznych i nieprawidłowości rozwoju umysłowego u potomstwa w wyniku różnych form nie­zrównoważonego kariotypu. Ograniczona przeżywalność płodów z niezrównoważonym karioty­pem może manifestować się poronieniami samoistnymi, ciążami obumarłymi lub wczesnymi zgonami noworodków, prowadząc do bezdzietności.

2. Jakie znasz mechanizmy rozdziału i segregacji chromosomów mejotycznych prowadzące do róż­nych form niezrównoważonego kariotypu u potomstwa nosicieli indywidualnych TCW?

„Diagnostyka laboratoryjna”, t. 37, 2001, str. 63-65.

3. Jakie dane są niezbędne do konstrukcji rodowodu?

Przy sporządzaniu rodowodu wskazane jest zebranie wywiadu od każdego nosiciela TCW w da­nej rodzinie osobno. Uwzględnia się przede wszystkim informacje na temat łącznej liczby dzieci i liczby ciąż z różnymi formami patologii, a więc:

• liczbę dzieci z wadami i niezrównoważonym kariotypem;

• liczbę poronień samoistnych i niekariotypowanych ciąż obumarłych;

• liczbę wczesnych zgonów noworoków ze znanym lub nieznanym kariotypem;

• wyniki diagnostyki prenatalnej płodów z I i II trymestru;

• liczbę dzieci zdrowych z prawidłowym kariotypem, TCW lub fenotypowo prawidłowych bez danych o kariotypie potomstwa.

Ważną informacją jest płeć nosiciela translokacji. Konstrukcja rodowodu wymaga też zbadania cytogenetycznego jak największej liczby jego członków.

4. Co to jest wskaźnik indywidualnego ryzyka genetycznego u nosicieli TCW?

Ryzyko genetyczne TCW jest prawdopodobieństwem występowania potomstwa z niezrównowa­żonym kariotypem mierzone wskaźnikiem, który oznacza stosunek liczby nieprawidłowego po­tomstwa do całkowitej liczby potomstwa po korekcie oszacowania probandów, którą wprowadza się, aby uwolnić się od błędu selekcji.

5. W jaki sposób przeprowadza się analizę pośrednią rodowodów TCW?

W metodzie pośredniej konieczne jest zgrupowanie danych empirycznych z rodowodów nosicieli podobnych TCW zamieszczonych bądź w różnych kolekcjach TCW, bądź w piśmiennictwie. Podstawą grupowania rodowodów jest obecność tego samego niezrównoważenia kariotypu u probanda z uwagi na podobny efekt kliniczny, podobne proporcje gamet różniących się karioty­pem i podobną przeżywalność płodów. Czasem w rodowodach odnotowuje się kilka różnych kombinacji niezrównoważonego kariotypu. Wówczas należy zsumować poszczególne wartości wskaźników ryzyka obliczonego oddzielnie dla każdej formy niezrównoważenia kariotypu z uwzględnieniem płci nosicieli TCW.

Opracowaną w sposób pośredni wartość ryzyka genetycznego należy traktować z pewnym przy­bliżeniem z uwagi na heterogenność grupy nosicieli TCW.

6. Od czego zależy wielkość empirycznego ryzyka genetycznego u nosicieli poszczególnych TCW?

Wielkość empirycznego ryzyka genetycznego zależy od rodzaju i liczby chromosomów zaanga­żowanych w TCW, dokładnej lokalizacji punktów złamań i formy niezrównoważenia segmentu chromosomowego (jego monosomia lub trisomia), do której wytworzenia prowadzą różne me­chanizmy rozdziału mejotycznego. Odrębną grupę stanowią TCW angażujące chromosom X, z uwagi na zjawisko selektywnej inaktywacji prawidłowego chromosomu X w kariotypie i nie­płodność uzależnioną od położenia punktu złamania na chromosomach X lub Y.

7. Co to jest kwadriwalent mejotyczny i jak wykorzystuje się jego schemat do prognozy form niezrów­noważenia kariotypu, jakie mogą powstać w wyniku poszczególnych mechanizmów roz­działu i segregacji chromosomów?

Kwadriwalent mejotyczny jest figurą przypominającą krzyż, ilustrującą przebieg koniugacji ho­mologicznych segmentów obu par chromosomów podczas mejozy.

Na podstawie skonstruowanego kwadriwalentu ustala się:

1. jakie rodzaje segregacji i który rozdział chromosomów mejotycznych mógł (lub może) dopro­wadzić do powstania niezrównoważonego kariotypu zaobserwowanego u żywo uro­dzonego potomstwa nosicieli danej TCW lub w określonym okresie życia prenatalnego;

2. jakie kombinacje segmentów chromosomowych w niezrównoważonym kariotypie wystąpiły (lub mogą wystąpić) u żywo urodzonego potomstwa bądź w określonym okresie życia pre­natalnego, biorąc pod uwagę zredukowaną przeżywalność potomstwa z określonymi kombi­nacjami segmentów chromosomowych w kariotypie.

1. Co wpływa na dokładność oszacowania prawdopodobieństwa wystąpienia niezrównoważenia ka­riotypu u potomstwa nosicieli TCW?

2. Jak zmienia się wielkość ryzyka genetycznego w poszczególnych okresach rozwoju ciąży w przy­padku nosicielstwa TC u jednego z rodziców z uwzględnieniem diagnostyki preimplantacyjnej oraz diagnostyki prenatalnej pierwszego i drugiego trymestru ciąży ?

3. Co powinna zawierać karta ryzyka genetycznego nosicieli indywidualnych TCW?

Karta ryzyka genetycznego powinna zawierać następujące elementy:

1. Zapis rozpoznania cytogenetycznego z interpretacją punktów złamań wg ISCN.

2. Rodowód nosicieli.

3. Schemat kwadriwalentu mejotycznego z analizą mechanizmów segregacji i rozdziału prowadzą­cych do powstania niezrównoważonego kariotypu.

4. Oszacowanie wielkości prawdopodobieństwa urodzenia dziecka z niezrównoważonym karioty­pem.

5. Określenie prawdopodobieństwa niezrównoważonego kariotypu w I i II trymestrze ciąży.

6. Określenie prawdopodobieństwa wystąpienia poronień samoistnych.

6. Markery biochemiczne otwartych wad ośrodkowego układu nerwowego w płynie owodniowym.

1. Jakie mogą być przyczyny podwyższonego stężenia AFP w surowicy krwi matki i płynie owodnio­wym?

Tabela 1, str. 50.

Podwyższony poziom AFP obserwuje się także u chorych z pierwotnym rakiem wątroby, guzem jądra nie wywodzącym się z komórek nasiennych, guzem zatoki endodermalnej jajnika, marsko­ścią wątroby, po przebyciu wirusowego zapalenia wątroby, a także w innych rzadkich przypad­kach.

2. Na czym polega diagnostyka otwartych wad OUN?

Diagnostyka otwartych wad OUN w płynie owodniowym jest integralnym elementem diagno­styki przedurodzeniowej. Polega ona na oznaczaniu w surowicy ciężarnej i płynie owodniowym klasycznych markerów biochemicznych wad OUN, którymi są alfafetoproteina i acetylocholine­steraza. Występowanie podwyższonego poziomu AFP i AchE w surowicy ciężarnej i/lub płynie owodniowym jest znamiennie skorelowane z występowaniem otwartych wad OUN u płodu.

3. Jaką rolę pełni AFP w organizmie kobiety ciężarnej?

Przypuszcza się, że AFP może posiadać działanie immunosupresyjne.

4. Jak przebiega krążenie AFP w jednostce płodowo-łożyskowej?

AFP w płynie owodniowym pochodzi początkowo z dyfuzji z pęcherzyka żółtkowego, następnie jej transfer do płynu owodniowego zachodzi poprzez skórę, jelita i oskrzela. Największa jednak część pochodzi z moczu wydalanego przez płód. Wady płodu polegające na niezamknięciu cewy nerwowej lub powłok brzusznych powodują bezpośrednie przechodzenie AFP z naczyń włoso­watych płodu do płynu owodniowego.

5. Jakie jest fizjologiczne stężenie AFP w płynie owodniowym, surowicy kobiety ciężarnej i suro­wicy płodu?

Fizjologiczne stężenie AFP w płynie owodniowym maleje wraz z wiekiem ciąży i wynosi od średnio 17,66 μg/ml w 12 tygodniu do 3,31 μg/ml w 23 i 24 tygodniu. Stężenia w surowicy płodu są od 150 do 300 razy wyższe. Stężenie AFP w surowicy matki podnosi się po 7 tygodniu ciąży, a największe wartości osiąga pomiędzy 28 a 32 tygodniem.

6. Jaką metodą można oznaczać poziom AFP?

Przykładową metodą jest immunoelektroforeza rakietkowa wg Laurella. Elektroforezę wykonuje się w 1% żelu agarozowym z dodatkiem przeciwciał anty-AFP, a otrzymane wyniki porównuje się z wartościami krzywej standardowej AFP.

7. Jakie są przyczyny podwyższonej aktywności acetylocholinesterazy?

Acetylocholinesteraza jest specyficznym enzymem pochodzącym z komórek układu nerwowego płodu. Jej aktywność zwiększa się w płynie owodniowym i w surowicy matki dziecka z wadą OUN, a także w 50% przypadków wad przedniej ściany powłok brzucha.

8. Na czym polega jakościowa i ilościowa ocena aktywności AchE?

Jakościowa ocena aktywności AchE polega na elektroforetycznym rozdziale cholinesteraz w żelu poliakrylamidowym. Wzrost aktywności tego enzymu powoduje pojawienie się obok wolniej mi­grującego prążka odpowiadającego cholinesterazie szybciej migrującego prążka odpowiadają­cego AchE.

Ilościowa ocena aktywności cholinesteraz polega na pomiarze spektrofotometrycznym metodą Ellmana. Poziom aktywności przekraczający zakres normy 0,96-5,08 mU/ml potwierdza obec­ność wady OUN w badanym przypadku.

9. Jaką rolę pełnią inhibitory w diagnostyce biochemicznej?

Inhibitory stosowane są dla rozróżnienia AchE od niespecyficznej ChE. Ich działanie pozwala ograniczyć do minimum liczbę wyników fałszywie pozytywnych.

10. W jaki sposób można odróżnić wady OUN od wad ściany powłok brzucha?

Do rozróżnienia przypadków wad OUN od wad ściany powłok brzucha i przypadków fałszywie podwyższonego poziomu AFP i AchE może służyć metoda immunochemicznego oznaczania acetylocholinesterazy (A) i butyrylocholinesterazy (B) w surowicy oraz określania ich wzajem­nego stosunku. W przypadku występowania wady OUN stosunek A/B jest większy niż 0,3, na­tomiast w przepuklinie pępkowej i wytrzewieniu płodu mniejszy niż 0,3.

7. Diagnostyka prenatalna chorób monogenowych autosomalnych - recesywnych i dominujących.

1. Pomiaru aktywności jakiego enzymu należy dokonać, aby potwierdzić rozpoznanie mukopolisacha­rydozy VI (choroby Maroteaux-Lamy)?

Enzymem tym jest arylosulfataza B.

2. Jakie badanie należy wykonać przed oznaczeniem aktywności arylosulfatazy A?

Stwierdzenie obniżonej aktywności arylosulfatazy A może być wystarczającym testem na wyka­zanie choroby płodu (leukodystrofii metachromatycznej). U ok. 10% rodzin występuje jednak allel pseudodeficytu ASA (PDASA), powodujący obniżenie aktywności enzymu bez efektu pa­tologicznego. Interpretacja wyniku badania prenatalnego wymaga wówczas analizy DNA, za pomocą której zarówno u rodziców, jak i u płodu można wykazać lub wykluczyć nosicielstwo genu PDASA.

3. Jaka mutacja jest wykrywana w większości przypadków rdzeniowego zaniku mięśni?

Molekularne podłoże rdzeniowego zaniku mięsni (SMA) jest dość skomplikowane. Ogromna większośc - przynajmniej 95% mutacji - polega jednak na delecji w obrębie kopii telomerowej genu SMN, którą określa się jako SMN1, w odróżnieniu od kopii centromerowej SMN2. Delecja w przypadku SMA często obejmuje nie tylko gen SMN1, ale i inne geny leżące w sąsiedztwie, a w szczególności kopię telomerową genu NAIP. Geny SMN i NAIP zlokalizowane są na chromo­somie 5q13.

4. Co to są mutacje dynamiczne?

Seminarium z 26.10.04.

6. Jakie choroby dziedziczne można wykluczyć na podstawie prenatalnego badania USG?

Jako przykłady mogą posłużyć:

• zespół Meckela-Grubera, w którym stwierdza się wielotorbielowate zwyrodnienie nerek, poli­daktylię i przepuklinę mózgową;

• dziecięca postać torbielowatości nerek z współistniejącymi torbielami w wątrobie i trzustce.

Obie ww. jednostki chorobowe są letalne (dziecko ginie zazwyczaj w okresie okołoporodowym) i dziedziczą się w sposób autosomalny recesywny.

1. Jakie znasz choroby uwarunkowane mutacjami dynamicznymi?

Seminarium z 26.10.04.

2. Jaki tor dziedziczenia reprezentuje ataksja Friedreicha?

Autosomalny recesywny.

3. Co to jest antycypacja?

Antycypacja jest zjawiskiem coraz bardziej dramatycznego przebiegu choroby w kolejnych po­koleniach. Zachorowanie może następować coraz wcześniej, a postać choroby może być coraz cięższa.

4. Na czym polega diagnostyka preimplantacyjna?

Diagnostyka preimplantacyjna (PPD) może być wykonywana tylko w ośrodkach zajmujących się zapłodnieniem pozaustrojowym. Polega na pobraniu 1 lub 2 komórek z trzydniowego, ośmioko­mórkowego zarodka. Ilość DNA zawarta w tych komórkach wystarcza do zdiagnozowania sze­regu chorób monogenicznych. Do implantacji przeznacza się tylko takie zarodki, w których za pomocą analizy DNA wykluczono określoną mutację. Główną zaletą tej metody jest wyelimino­wanie konieczności przerywania ciąży.

8. Diagnostyka prenatalna chorób monogenowych.

1. Co to są choroby monogenowe?

Choroby monogenowe, dziedziczone zgodnie z prawami Mendla, powodowane są mutacjami w jednym lub obu genach tworzących parę genów autosomalnych lub w genach występujących w chromosomach płciowych. Geny autosomalne występują w parach - jeden gen zlokalizowany jest na chromosomie pochodzącym od matki, drugi - od ojca. Obie formy genu nazywane są al­lelami. Allele zmutowane mogą, lecz nie muszą, warunkować zmienioną funkcję. Jeżeli oba geny z pary homologicznej są identyczne, osobnik jest homozygotą dla określonego locus. Jeśli geny te są różne, osobnik jest heterozygotą.

Każda właściwość określana przez gen zwana jest cechą. Jeśli cecha ulega ekspresji u osobnika heterozygotycznego, określana jest mianem dominującej. Jeśli ujawnia się jedynie u homozygoty (osobnika z uszkodzonymi obydwoma allelami genu), jest recesywna. Ponad połowa opisanych dotychczas cech jest dziedziczona dominująco, ok. ¹/₃ recesywnie, a ¹/₁₀ jako cechy sprzężone z chromosomem X.

2. Jakie są podstawowe kryteria dziedziczenia się chorób monogenowych?

Str. 59-60.

3. Jakie jest ryzyko powtórzenia się choroby recesywnej?

25%.

4. Na czym polega diagnostyka prenatalna chorób monogenowych?

Diagnostyka prenatalna chorób monogenowych polega na ustaleniu, czy płód posiada prawi­dłowy gen albo czy jest nosicielem uszkodzonego genu na jednym lub obu allelach.

5. Na czym polega analiza sprzężeń?

Analiza sprzężeń to inaczej analiza sposobu dziedziczenia się genu. Markerem diagnostycznym jest polimorficzny fragment genomu lub pojedyncza zmiana nukleotydu sprzężone z badanym genem (tzw. haplotyp markerowy choroby). Im większe sprzężenie, to znaczy im bliżej siebie marker i gen położone są na chromosomie, tym mniejsza możliwość rekombinacji i tym większe prawdopodobieństwo, że będą dziedziczyć się wspólnie. Analiza sprzężeń pozwala więc pośred­nio prześledzić przekazywanie uszkodzonego genu w rodzinie.

6. Wymień etapy diagnostyki molekularnej chorób uwarunkowanych mutacjami genów, których bu­dowa jest znana.

1. Wstępne badania polegają na analizie wzoru restrykcyjnego specyficznego dla locus genu cho­roby i amplifikacji wszystkich egzonów uszkodzonego genu w celu identyfikacji dużych zmian typu delecji, duplikacji i inwersji całego lub części genu.

2. W następnym etapie stosowana jest analiza konformacji pojedynczych nici (SSCP) i analiza he­terodupleksów (HA), które umożliwiają wykrycie fragmentó posiadających drobne zmiany w sekwencji genu.

3. Na koniec przeprowadza się sekwencjonowanie zmienionego elektroforetycznie fragmentu, co pozwala na identyfikację mutacji specyficznej dla chorego.

1. Co jest materiałem z wyboru w pozyskiwaniu DNA w diagnostyce prenatalnej?

Do badań prenatalnych źródłem genomowego DNA jest trofoblast. W szczególnych przypadkach (w zależności od rodzaju choroby bądź trudności w uzyskiwaniu materiału) wykorzystywane są hodowle komórek z wód płodowych.

2. Na czym polega wczesna terapia farmakologiczna we wrodzonym przeroście kory nadnerczy?

W wypadku matek obciążonych posiadaniem dzieci z wrodzonym przerostem kory nadnerczy, spowodowanym deficytem 21-hydroksylazy steroidowej, kobieta ciężarna już od 8 tygodnia ciąży otrzymuje dexamethazon. W 11-12 tygodniu pobierana jest próbka trofoblastu, z której izolowany jest preparat genomowego DNA. W pierwszym rzędzie określana jest wówczas płeć płodu. W przypadku wykrycia płci żeńskiej terapia farmakologiczna jest kontynuowana do końca ciąży lub do chwili wykluczenia obecności mutacji na jednym lub obu allelach, gdyż podawanie dexamethazonu zapobiega maskulinizacji zewnętrznych narządów płciowych u płodów płci żeń­skiej dotkniętym defektem 21-hydroksylazy steroidowej. W wypadku stwierdzenia płci męskiej terapia farmakologiczna jest zazwyczaj przerywana.

3. Wymień możliwości diagnozowania zespołu Smitha, Lemlego i Opitza w okresie prenatalnym.

Zespół SLO jest drugą po mukowiscydozie najczęściej występującą chorobą metaboliczną. Spo­wodowany jest zaburzeniem w biosyntezie cholesterolu, tj. niedoborem reduktazy ∆⁷-dehydro­cholesterolu (7-DHC) - enzymu biorącego udział w ostatnim etapie syntezy cholesterolu.

W diagnostyce inwazyjnej SLO wykonuje się testy biochemiczne i/lub analizę genetyczną w ko­mórkach trofoblastu lub komórkach płynu owodniowego. Test biochemiczny polega na ocenie proporcji poziomu 7-DHC do poziomu wszystkich steroli (cholesterolu i 8-DHC) w tkankach za­rodka (11-12 tydzień ciąży) lub oznaczaniu poziomu 7-DHC w płynie owodniowym (w 13 tygo­dniu ciąży). Analiza genetyczna polega na zbadaniu budowy obu alleli genu DHCR7. Za pomocą sekwencjonowania wykrywa się specyficzne dla rodziny mutacje w genie DHCR7 i określa, czy płód jest zdrowy, obciążony chorobą czy też jest bezobjawowym nosicielem.

Podstawą nieinwazyjnej diagnostyki zespołu SLO u płodu jest wykazanie zaburzonej biosyntezy steroidów w jego nadnerczach, m.in. poprzez oznaczanie metabolitów steroidowych pochodzą­cych od płodu w surowicy/moczu matki. W warunkach prawidłowych nadnercza płodu około 8 tygodnia życia podejmują czynność steroidogenezy. Cholesterol jest niezbędny do zapoczątko­wania biosyntezy hormonu steroidowego, jakim jest estriol. Pochodne estriolu są przekształcane przez enzymy łożyskowe do postaci wolnej, która przedostaje się do krążenia matczynego. Obni­żony poziom wolnego E₃, badany w II trymestrze ciąży np. za pomocą testu potrójnego, może więc być jednym z markerów obecności SLO u płodu. Nie jest jednak specyficzny dla tego zabu­rzenia i dlatego nie może być wykorzystywany jako podstawowy test diagnostyczny.

Ostatnio zaproponowano bezinwazyjne badanie prenatalne poprzez identyfikację nietypowych metabolitów steroidogenezy płodowej po postacią 7- i 8-dehydroestrioli (od 12 tygodnia ciąży) w moczu kobiety ciężarnej.

Obecność zespołu SLO u płodu można również wykryć za pomocą badania USG. Na duże praw­dopodobieństwo zespołu wskazuje obserwacja w 13-14 tygodniu ciąży objawu zwiększonej przezierności karkowej bądź zespołu mnogich wad wrodzonych pod postacią m.in. holoprosence­falii, obojnaczych zewnętrznych narządów płciowych, wady serca, rozszczepu podniebienia oraz polidaktylii dłoni/stóp.

4. Wymień co najmniej trzy choroby monogenowe diagnozowane przez Pracownię Genetyki Moleku­larnej Zakładu Genetyki Człowieka IP-CZD w Warszawie.

Przykładami chorób są: rodzinna krzywica hipofosfatemiczna, zespoły Pradera-Williego i An­gelmana, zespół SLO, wrodzony przerost kory nadnerczy, zespół Huntera.

9. Diagnostyka prenatalna chorób sprzężonych z płcią na podstawie dystrofii mięśniowej Du­chenne'a/Beckera.

1. Jakim badaniem można potwierdzić rozpoznanie kliniczne dystrofii mięśniowej Du­chenne'a/Beckera?

Najlepszym sposobem potwierdzenia diagnozy klinicznej jest wykrycie mutacji u osoby chorej. W przypadku dystrofii mięśniowej Duchenne'a/Beckera poszukuje się mutacji w genie dystro­finy. W przypadku wcześniejszej identyfikacji mutacji diagnostyka prenatalna polega na poszu­kiwaniu tego samego uszkodzenia w DNA otrzymanym z komórek płodowych. Niewykrycie mutacji zmusza do prowadzania diagnostyki metodą pośrednią, poprzez śledzenie dziedziczenia allelu uważanego za zmutowany.

2. Dlaczego w reakcji PCR fragmentu genu amelogeniny z użyciem DNA wyizolowanego od mężczy­zny otrzymuje się 2 produkty różnej wielkości?

Ponieważ obok produktu fragmentu genu amelogeniny położonego na chromosomie X i liczą­cego 500 pz pojawia się dodatkowo produkt wielkości 350 pz pochodzący z położonego na chromosomie Y pseudogenu amelogeniny (niepełna, nieczynna kopia genu).

3. Za pomocą jakiej reakcji wykrywa się delecje genu dystrofiny u chorych dotkniętych DMD/BMD?

Najczęściej stosowaną metodą jest multiplex-PCR.

4. Co to jest mutacja nonsens?

Mutacją nonsens nazywa się wprowadzenie do otwartej ramki odczytu kodonu stop.

5. Na czym polega polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych?

„Biologia molekularna w medycynie”, str. 37.

6. Czy sekwencję mikrosatelitarną z chromosomu X, wykrytą u zdrowego mężczyzny, można wykryć u jego syna?

Nie.

7. Czy możliwe jest badanie prenatalne w kierunku choroby sprzężonej z płcią, gdy brak jest DNA od chorego mężczyzny (chłopca)?

Jest to możliwe. Metodą, jaką należy się wówczas posłużyć, jest śledzenie dziedziczenia alleli, które można zidentyfikować u zdrowych męskich członków rodziny. W tym celu należy uzyskać DNA od zdrowego brata osoby chorej i od zdrowego mężczyzny - brata matki. Następnie należy określić ich haplotyp i sprawdzić, czy haplotyp płodu jest taki sam.

Czasem możliwe jest również wywnioskowanie, jakie mogą być haplotypy męskie, i wykonanie diagnozy prenatalnej wyłącznie na podstawie analizy DNA kobiety ciężarnej i jej matki.

8. Jakie jest prawdopodobieństwo nosicielstwa mutacji genu położonego na chromosomie X u córki chorego mężczyzny?

100%.

9. Na czym polega zjawisko rekombinacji?

Zjawisko rekombinacji może zajść podczas oogenezy i spermatogenezy, w czasie podziału re­dukcyjnego. Polega ono na wymianie odcinków DNA między chromatydami siotrzanymi („cros­sing over”). Zjawisko to stanowi pewne utrudnienie w śledzeniu dziedziczenia mutacji w obrębie badanych rodzin. Im większa jest odległość fizyczna (mierzona liczbą nukleotydów) i genetyczna (mierzona częstością rekombinacji) pomiędzy mutacją a określoną sekwencją polimorficzną, tym większe prawdopodobieństwo rozdzielenia się ich podczas mejozy.

10. Jakie jest prawdopodobieństwo nosicielstwa mozaikowatości gonad u kobiety, która jako jedyna w rodzinie urodziła syna dotkniętego DMD?

5-10%.

10. Zastosowanie metod analizy DNA w diagnostyce chorób płodu i noworodka spowodowanych al­loimmunizacją matczyno-płodową.

1. Dlaczego musimy brać pod uwagę przynależność rasową osoby badanej przy genotypowaniu anty­genów erytrocytów?

Ponieważ podłoże cechy Rh minus jest różne u przedstawicieli różnych grup etnicznych. U osó odmiany białej cecha ta wynika z braku genu RhD, podczas gdy u Japończyków i osób odmiany negroidalnej gen RhD może być obecny, lecz nie ulega ekspresji.

2. Jaki materiał badamy dla oznaczenia genotypu RhD płodu?

Materiałem badanym dla oznaczenia genotypu RhD płodu jest wolne DNA płodu znajdujące się w osoczu matki.

3. Jaki materiał badamy dla oznaczenia genotypu innych niż RhD antygenów płodu?

Podejmuje się próby badania metodą nieinwazyjną (w osoczu matki) antygenu c układu Rh. Ba­danie pozostałych antygenów krwinek czerwonych i wszystkich antygenów płytek i granulocy­tów opiera się na analizie DNA pobranego metodami inwazyjnymi (kordocenteza, pobranie ko­smków).

4. Dlaczego przy diagnostyce chorób spowodowanych alloimmunizacją matczyno-płodową istotne jest poznanie genotypu/fenotypu ojca?

Typowanie antygenów u ojca jest konieczne, aby przewidzieć, czy płód mógł odziedziczyć od ojca antygen nieobecny u matki. Należy również ustalić, czy ojciec był pod względem tego anty­genu homozygotą (wówczas istnieje pewność, że dziecko odziedziczyło niezgodny antygen), czy heterozygotą (wówczas istnieje 50% szans, że dziecko nie odziedziczyło niezgodnego antygenu i nie jest zagrożone chorobami spowodowanymi alloimmunizacją matczyno-płodową).

5. Który z antygenów HPA najczęściej powoduje immunizację matczyno-płodową odpowiedzialną za AIMPN?

HPA-1a (choroba może mieć ciężki przebieg). Drugi w kolejności jest antygen HPA-5B (prze­bieg choroby na ogół bardzo łagodny).

6. Czy jest już możliwe genotypowanie HPA płodu metodami nieinwazyjnymi?

Nie.

7. Jakie metody używane są do genotypowania HPA i HNA?

Metodami stosowanymi w genotypowaniu ww. antygenów są PCR SSP i PCR RFLP.

8. Dlaczego diagnostyka AIMPN i AIGPN jest częściej oparta o genotypowanie antygenów niż diagno­styka ChHPN?

Wynika to przede wszystkim z małej dostępności surowic diagnostycznych do oznaczania tych antygenów metodami serologicznymi.

Przeciwciała monoklonalne do oznaczenia HPA nie są produkowane, a stosowane do tej pory metody serologiczne są dużo bardziej skomplikowane niż metody oznaczeń antygenów erytro­cytów. Ponadto przy pobieraniu materiału od płodu liczba płytek krwi jest zbyt mała, by prze­prowadzić badanie serologiczne.

Genotypowanie w diagnostyce AIGPN jest ważne głównie ze względu na trudności techniczne, jakie wiążą się z pracą z użyciem świeżych granulocytów, co jest konieczne do badań serologicz­nych. Dodatkowo, podobnie jak w przypadku płytek, występują duże trudności w uzyskaniu swoistych surowic do badań antygenów HNA (bardzo ograniczona dostępność przeciwciał od kobiet, które urodziły dzieci z AIGPN, a także przeciwciał monoklonalnych).

9. Jaka jest rola genotypowania RhD płodu u RhD-ujemnych kobiet ciężarnych?

Immunoprofilaktyka konfliktu poprzez stosowanie immunoglobuliny anty-RhD znacznie obni­żyła częstość występowania choroby hemolitycznej, lecz nie wyeliminowała jej całkowicie. Kli­niczne konsekwencje konflikru matczyno-płodowego w układzie RhD mogą być bardzo po­ważne, więc odpowiednia diagnostyka, monitorowanie przebiegu ciąży oraz leczenie płodu i no­worodka są bardzo istotne. Badania molekularne w tej dziedzinie oferują możliwość nieinwazyj­nej identyfikacji RhD płodu, a tym samym określenia, czy jest on czy nie jest zagrożony chorobą hemolityczną.

10. Czy należy genotypować RhD płodu u kobiet RhD-ujemnych z przeciwciałami anty-RhD?

Tak. Jeśli u kobiety ciężarnej wykrywa się przeciwciała anty-RhD, ustalenie, że płód jest RhD-ujemny (czyli nie jest zagrożony chorobą), ma szczególne znaczenie. Można bowiem wówczas zaniechać inwazyjnych metod monitorowania ciąży, koniecznych w przypadku zaistnienia kon­fliktu w układzie RhD.

(Dla kobiet, u których nie wykrywa się przeciwciał anty-RhD ustalenie, że płód jest RhD-ujemny, również jest istotne. Nie jest bowiem wtedy konieczne podawanie kobiecie immunoglo­buliny anty-RhD w celu immunoprofilaktyki wytworzenia przeciwciał).

17. Ewolucyjna historia zaludnienia Europy w kontekście różnorodności genetycznej współcze­snych populacji - implikacje dotyczące badań w populacji polskiej.

1. Jakie procesy kształtują różnorodność genetyczną populacji?

Różnorodność genetyczna w populacjach ludzkich w kształcie, jaki obserwujemy obecnie, zde­terminowana została przez procesy mutacji i selekcji oraz dryf genetyczny (przypadkowe zmiany w częstości występowania alleli), a także przez historyczne uwarunkowania i dynamikę demogra­ficzną populacji (podziały w populacjach, migracje, ekspansje, domieszki itp.).

2. Czym charakteryzuje się różnorodność genetyczna gatunku ludzkiego i na jaki model ewolucji Homo sapiens wskazuje?

Różnorodność genetyczna charakteryzująca gatunek ludzki jest 1) niewielka, 2) w większości wspólna dla wszystkich współczesnych populacji ludzkich, a 3) najwyższy poziom osiąga w populacjach afrykańskich. Obserwacje te są zgodne z modelem „niedawnego początku afrykańskiego”, według którego współczesnym grupom ludzkim początek dała niewielka macierzysta populacja. Zamieszkiwać ona początkowo Afrykę lub Bliski Wschód i dopiero niedawno (100-150 tys. lat temu), w wyniku ekspansji demograficznej i geograficznej, zaczęła zaludniać pozostałe kontynenty, wypierając z nowo zasiedlanych terenów wcześniejsze miejscowe formy hominidów (Neanterdalczyków w Europie czy też Homo erectus w południowo-wschodniej Azji).

W ramach modelu „niedawnego afrykańskiego początku” bardzo ważne jest pytanie dotyczące liczby i prawdopodobnych szlaków rozpraszania się współczesnego człowieka z jego kolebki. Obecnie coraz popularniejszy staje się model wielokrotnych rozproszeń, według którego pojawienie się współczesnego człowieka w Afryce było czasowo oddzielone od wzrostu demograficznego macierzystej populacji i zwiększenia jej zasięgu, a kolonizacja świata odbywała się w wielu etapach i wzdłuż różnych szlaków. W oparciu o dane archeologiczne i paleontologiczne zakłada się istnienie dwóch głównych geograficznych szlaków migracji wychodzących z Afryki. Droga „północna” łączy Afrykę poprzez Środkowy Wschód z Europą i zachodnią Azją, a „południowa” prowadzi z Etiopii przez Półwysep Arabski i południową Azję do Australii.

3. W jakich dziedzinach wykorzystuje się dane dotyczące różnorodności genetycznej populacji?

Praktyczne wykorzystanie informacji dotyczącej różnorodności genetycznej w badanej populacji nie ogranicza się do odnajdywania mutacji powodujących chorobę czy polimorfizmów fukcjonalnych zmieniających w jakimś stopniu działanie organizmu. Poznanie zmienności neutralnej (badanie polimorfizmów selekcyjnie obojętnych) ułatwia zrozumienie genezy i obecnego kształtu lokalnych profilów różnorodności genetycznej. Wiedza taka prowadzi pośrednio do lepszego zrozumienia etiologii chorób o niemendlowskim typie dziedziczenia. W szczególności ułatwia ona działania w zakresie asocjacyjnego mapowania genów w chorobach wielogenowych i/lub wieloczynnikowych. Równie ważna jest w badaniu oporności lub podatności organizmu na działanie leków (farmakogenetyka), w ustalaniu prawdopodobieństwa zgodności dawcy i biorcy w przeszczepach (transplantologia), w genetycznej identyfikacji osób (medycyna sądowa), a także w badaniach antropologicznych.

4. Jakie rodzaje markerów genetycznych są najbardziej informatywne w badaniu młodych populacji?

W badaniu młodych populacji największą informatywność posiadają szybko muitujące, wieloalleliczne markery mikrosatelitarne, a także warianty sekwencji w hiperzmiennych regionach genomu mitochondrialnego. Pojedyncze markery typu SNP są zbyt stabilne, tzn. charakteryzują się zbyt małą częstością mutacji, aby ich analiza mogła być w tym przypadku informatywna.

5. Czym różnią się choroby wielogenowe/wieloczynnikowe od chorób o mendlowskim typie dziedziczenia?

Przykładami chorób wielogenowych i/lub wieloczynnikowych są np. nowotwory, cukrzyca, astma, choroba wieńcowa, choroba nadciśnieniowa, pewne formy niepłodności czy osteoporoza. Choroby te nie zależą bezpośrednio od mutacji w jednym konkretnym genie, lecz zazwyczaj są wynikiem kumulatywnego działania wielu genów o małych efektach, a w związku z tym są uwarunkowane allelami występującymi w znacznej częstości również w populacji zdrowej. Rolę w powstawaniu choroby często odgrywają również czynniki epigenetyczne (oddziaływanie gen-środowisko). Zrozumienie etiologii chorób o niemendlowskim typie dziedziczenia wymaga więc 1) ustalenia, jakie geny uczestniczą w wytworzeniu lub modyfikacji fenotypu, 2) wykrycia potencjalnie szkodliwych mutacji, a także 3) określenia wzajemnych interakcji pomiędzy poszczególnymi genami oraz pomiędzy genami a środowiskiem.

6. Dlaczego niejednorodność genetyczna (struktura) populacji utrudnia badania asocjacyjne?

Wiele analiz zmierzających do rozszyfrowania genetycznego podłoża schorzeń wielogenowych i/lub wieloczynnikowych opiera się na porównywaniu grup niespokrewnionych osób chorych i zdrowych w poszukiwaniu asocjacji (współwystępowania) pomiędzy objawami badanej patologii a obecnością określonych markerów genetycznych. Asocjacje takie mogą być wynikiem rzeczywistego sprzężenia genetycznego pomiędzy loci odpowiedzialnymi za fenotyp a badanymi markerami, ale mogą również odzwierciedlać wpływ czynników niedziedzicznych modyfikujących badany fenotyp lub wynikać z niejednorodności genetycznego profilu badanych grup. Niejednorodność populacji może więc prowadzić do nieprawidłowej oceny istotności badanych asocjacji.

7. Dlaczego do badania nierównowagi sprzężeń nie stosuje się markerów mitochondrialnych?

Każdy nowy allel wprowadzony do populacji (w wyniku mutacji lub migracyjnej domieszki) występuje zawsze w określonym kontekście haplotypowym. W miarę upływu czasu początkowa nierównowaga sprzężeń pomiędzy nowym allelem a sąsiadującymi markerami ulega zanikowi na skutek rekombinacji. Proces ten oczywiście nie dotyczy mtDNA (a także nierekombinującej części chromosomu Y) i dlatego markery mitochondrialne nie są użyteczne w badaniu nierównowagi sprzężeń.

8. Jakie procesy historyczne i demograficzne może odzwierciedlać różnorodność populacji europejskich?

„Prehistoryczne migracje w Europie”, str. 114.

9. Jakie są najważniejsze przyczyny rozbieżności wniosków w badaniach różnorodności genetycznej populacji?

„Podstawowe przyczyny rozbieżności danych”, str. 116.

10. Jaki rodzaj markerów genetycznych został jak dotąd najdogłębniej zbadany w populacji polskiej?

Największym jak dotąd kompleksowym studium genetycznej różnorodności w Polsce, obejmującym dużą liczbę informatywnych loci w próbie stanowiącej obszerną (aczkolwiek nie kompletną) reprezentację polskiej populacji, była praca poświęcona analizie mikrosatelitarnych haplotypów w chromosomie Y.

18. Epidemiologia genetyczna: nowe możliwości i nowe wyzwania.

1. Podaj definicję epidemiologii genetycznej i określ jej główne cele.

Epidemiologia genetyczna jest dziedziną, która zajmuje się etiologią, rozkładem cech chorobowych w grupach spokrewnionych osób oraz rozkładem genetycznych determinant choroby w populacjach. Jako bezpośredni następca genetyki populacyjnej oraz klasycznej epidemiologii epidemiologia genetyczna łączy w sobie metodologię obu tych dziedzin.

Główne cele epidemiologii genetycznej koncentrują się na:

1. klonowaniu pozycyjnym genów chorobowych;

2. identyfikacji polimorfizmów DNA oraz ich asocjacji z cechami chorobowymi w populacji;

3. określaniu produktów genów odpowiedzialnych za wystąpienie choroby (proteomika) oraz ich rozkładu w populacji;

4. ocenie związku pomiędzy genotypem a czynnikami środowiskowymi w rozwoju etiologii chorób złożonych (kompleksowych);

5. identyfikacji populacyjnych grup ryzyka genetycznego;

6. rozwoju skutecznych metod pierwotnej prewencji chorób.

W ostatnich latach listę powyższych celów uzupełniano o farmakogenomikę, która zajmuje się oceną zależności pomiędzy genotypem a odpowiedzią lub jej brakiem w stosunku do konkretnego środka terapeutycznego.

1. Omów zasadnicze różnice między selekcją kompletną i niekompletną?

Selekcja jest postawą wiarygodności wyników przeprowadzanej analizy. Optymalna rejestracja osób powinna przebiegać tak, aby zapewnić jednakowe prawdopodobieństwo włączenia do badań czy to indywidualnej osoby, czy też rodziny - niezależnie od stopnia częstości choroby czy liczby chorych osób w rodzinie.

Znanych jest kilka sposobów selekcji stosowanych w badaniach epidemiologii genetycznej:

• Selekcja kompletna polega na rejestracji rodzin poprzez rodziców, bez zwracania uwagi na fenotypy/genotypy dzieci. Ten sposób rejestracji może mieć znaczenie tylko w przypadku analizy cech (chorób) o wysokiej częstości populacyjnej.

• Selekcja niekompletna prowadzona jest poprzez rejestrację chorych dzieci. W takim przypadku dochodzi do „opuszczenia” rodzin, w których wszystkie dzieci są zdrowe. Chore dziecko, poprzez które dochodzi do identyfikacji rodziny, określa się mianem probanta. W każdej rodzinie może być więcej niż jeden probant, jeżeli kolejne chore dziecko zostanie zidentyfikowane w sposób niezależny od jego rodzeństwa. Na podstawie liczby probantów szacowane jest prawdopodobieństwo rejestracji π = A/R, gdzie R oznacza liczbę chorych dzieci, A zaś - liczbę tych spośród nich, które zostały zidentyfikowane jako probant. Zw wzoru widać, że π→1, gdy A→R, co oznacza, że im więcej niezależnych źródeł informacji, tym dokładniejsza i bardziej precyzyjna selekcja.

1. Jakie są warunki przeprowadzenia analizy segregacyjnej?

Analiza segregacyjna jest to zestaw metod matematycznych pozwalających na ocenę rozkładu cechy/markera genetycznego w rodzinie i estymacji stosunków genetycznych oraz zdefiniowanie modelu dziedziczenia. Metody te są nieodzownym elementem oszacowania ryzyka wystąpienia i powtórzenia choroby.

Warunkami do przeprowadzenia analizy segregacyjnej są:

1. polimorfizm badanej cechy;

2. heterozygotyczność jednego z rodziców;

3. posiadanie potomstwa.

1. Na czym polega efekt założyciela?

Efekt założyciela związany jest z obecnością w całej badanej populacji genów głównych pochodzących od wspólnego przodka. Zjawisko to obserwuje się szczególnie często w populacjach izolowanych w sensie geograficznym, kulturowym czy religijnym. Ze względu na niski odsetek migracji, a co za tym idzie - małą domieszkę nowych genów, populacje te są bardziej homogenne w sensie etiologicznym, fenotypowym i genotypowym.

2. Co oznacza termin „odziedziczalność” i do jakiej kategorii cech dziedzicznych się odnosi?

Termin „odziedziczalność” odnosi się do chorób o niemendlowskim, złożonym modelu dziedziczenia. Ekspresja fenotypowa tych jednostek uzależniona jest od interakcji pomiędzy dziedziczną podatnością, warunkowaną zwykle przez wiele genów, a działaniem czynników wyzwalających. Odziedziczalność pozwala w sposób matematyczny określić względny udział czynników genetycznych w determinowaniu całkowitej zmienności fenotypowej.

3. Jak definiuje się moc sprzężenia i „lod score”?

Sprzężenie genetyczne zdefiniowane jest jako kosegregacja dwóch loci chromosomowych występująca znacząco częściej, niż należałoby tego oczekiwać w przypadku zjawiska losowego. Oznacza to, że dwa loci są synteniczne (znajdują się na tym samym chromosomie) oraz że odległość, jaka je dzieli, jest na tyle mała, iż prawdopodobieństwo wystąpienia rekombinacji jest względnie małe. Jako wartość graniczną dla stwierdzenia sprzężenia przyjmuje się zwykle prawdopodobieństwo 0,05.

Moc (siła) sprzężenia określana jest za pomocą ilorazu wiarygodności, czyli stosunku prawdopodobieństwa wystąpienia sprzężenia do prawdopodobieństwa jego niewystąpienia. W praktyce stosuje się logarytm dziesiętny z tej wartości, określany jako „lod score”.

4. Jakie są kryteria przyjęcia i odrzucenia obecności znamiennego sprzężenia w oparciu o „lod score”?

Hipotezę zakładającą obecność znamiennego sprzężenia genetycznego można przyjąć, gdy lod score ≥+3 (szansa, że istnieje sprzężenie, jak 1000:1). Hipotezę należy natomiast odrzucić, gdy lod score ≤-2 (szansa, że nie ma sprzężenia, jak 100:1).

5. Jakie testy statystyczne stosuje się do analizy sprzężeniowej w przypadku chorób o niemendlowskim modelu dziedziczenia?

Testy stosowane w analizie sprzężeniowej dzielą się na parametryczne i nieparametryczne. W przypadku, gdy badana cecha/choroba nie wykazuje prostego mendlowskiego modelu dziedziczenia (a także w przypadku stwierdzenia w badanych rodzinach znaczącej heterogenności), stosuje się testy nieparametryczne.

Testy te nie wymagają wcześniejszego ustalenia modelu dziedziczenia. Oparte są na zjawisku posiadania przez parę rodzeństwa o tym samym fenotypie (wykazującego objawy tej samej choroby) identycznych alleli markerów genetycznych. Metoda zakłada bowiem, że w przypadku sprzężenia odziedziczeniu genu warunkującego wystąpienie choroby towarzyszy przekazanie przez rodziców identycznych alleli markerowych - IBD, identity by descent. (W przypadku, gdy nie dysponujemy genotypami rodziców, a jedynie parami chorego rodzeństwa, określa się tylko zgodność w zakresie alleli markera genetycznego - IBS, identity by state).

6. Na czym polega klonowanie pozycyjne?

Klonowanie pozycyjne polega na identyfikacji pozycji genu w genomie bez uprzedniej znajomości jego funkcji i rozpoczyna się od oceny fenotypu choroby. Następnie za pomocą technik molekularnych oraz z wykorzystaniem analizy sprzężeniowej określana jest lokalizacja chromosomowa oraz sekwencja genu. Dopiero w końcowej fazie określa się produkt genu oraz jego funkcje.

7. Które geny określono jako geny kandydujące w przypadku astmy atopowej?

Lista genów kandydujących w przypadku astmy atopowej obejmuje geny kodujące mediatory reakcji alergicznej, a więc: receptor o wysokim powinowactwie do IgE (FCεRI), IL-4, IL-5, TNF-α, IL-4R.

19. Choroby uwarunkowane genetycznie - spojrzenie epidemiologa.

1. Jakie są źródła informacji o chorobach uwarunkowanych genetycznie?

Źródłami informacji o chorobach uwarunkowanych genetycznie są:

• rejestry zgonów;

• wypisy szpitalne;

• rejestry zgłoszeniowe;

• populacyjne badania przesiewowe;

• populacyjne badania epidemiologiczne;

• inne źródła (dokumentacja różnych placówek służby zdrowia, takich jak szpitale czy poradnie ogólne i specjalistyczne, w tym poradnie genetyczne).

1. Zalety i wady rejestrów zgłoszeniowych.

Rejestry zgłoszeniowe mogą być potencjalnie cennymi źródłami informacji. Obejmują one różne jednostki chorobowe i mają różny zasięg (w nielicznych przypadkach, z reguły w krajach o stosunkowo małej populacji, są to rejestry ogólnokrajowe). Wartość informacji generowanych przez każdy rejestr jest tym większa, im większa kompletność i jakość rejestracji. Zapewnienie wysokiej jakości rejestru nie jest jednak łatwe - wymaga dużych nakładów, aby sprostać ostrym rygorom organizacyjnym i metodycznym.

2. Źródła obciążeń w badaniach epidemiologicznych nad chorobami uwarunkowanymi genetycznie.

Obciążenia w badaniach epidemiologicznych nad chorobami genetycznie uwarunkowanymi mogą mieć różny charakter:

1. Kompletność. Wysoka kompletność wiąże się z aktywnym nadzorem terenowym i wyszukiwaniem źródeł ewentualnego niedorejestrowania lub nadrejestrowania. Aktywne rehestry docierające do różnych źródeł informacji i sprawdzające, czy wszystkie rozpoznane przypadki zostały zgłoszone, mogą to obciążenie ograniczyć pod warunkiem, że dotarły do wszystkich istotnych źródeł.

2. Wiarygodność. Wysoka wiarygodność zależy od poprawności rozpoznań. Istotną rolę odgrywa tu oparcie rozpoznania na ściśle określonych kryteriach i wyczerpująca dokumentacja (obejmująca w zależności od rejestrowanej jednostki wyniki autopsji, badań histopatologicznych i laboratoryjnych, dokumentację fotograficzną itd.). Poprawa w tym zakresie nie jest prosta i wiąże się z ciągłym doskonaleniem warsztatu diagnostycznego i podwyższaniem kompetencji personelu.

3. Klasyfikacja. Obciążenie wynikające z błędnej klasyfikacji może dotyczyć zarówno rozpoznanych chorób, jak i czynników narażania. Ograniczenie tego typu obciązenia wymaga odpowiedniego przygotowania zespołu badawczego.

4. Selekcja. Ograniczenie selekcji wiąże się z możliwością odnoszenia danych o przypadkach do całej określonej populacji, a nie tylko populacji wyselekcjonowanej, jaką jest np. populacja obejmująca pacjentów szpitali bądź przychodni.

5. Zakłócenia. Zakłócenie występuje wtedy, kiedy określona zależność między ekspozycją a skutkiem zdrowotnym nie jest rzeczywista z powodu tego, że badana próba składa się z dwu lub większej liczby różnych grup jednostek. Zakłócenie może również wystąpić w przypadku, kiedy zależność pomiędzy czynnikiem ryzyka i chorobą może być wyjaśniona poprzez istnienie jakiejś zmiennej pozostającej w związku zarówno z czynnikiem ryzyka, jak i z tą chorobą. Źródło tego typu obciążenia może tkwić w planie badania bądź w sposobie analizy.

6. Inne. Z innych obciążeń należy wymienić przede wszystkim błędy zapamiętywania zdarzeń, które miały miejsce w przeszłości, a także różny stopień precyzji w gromadzeniu informacji w stosunku do różnych osób objętych badaniem.

1. Zakłócenia i ich źródła w badaniach epidemiologicznych.

P. 19.3.

2. Jak rozumieć genom jako czynnik ekspozycji?

Genom można traktować jako czynnik ekspozycji, posługując się technikami klasycznej epidemiologii. Przedmiotem badań epidemiologicznych jest wówczas zależność pomiędzy określonym czynnikiem genetycznym a jego skutkiem w postaci choroby lub innego defektu zdrowotnego. Objęte badaniem osoby, stanowiące próbę wyłonioną z populacji, dzielone są w takim wypadku na cztery kategorie:

1. występuje określony czynnik genetyczny i skutek zdrowotny;

2. brak jest czynnika, lecz występuje skutek;

3. występuje czynnik, lecz brak jest skutku;

4. brak czynnika i skutku.

Posługując się tymi czterema kategoriami można obliczyć podstawowe miary zależności pomiędzy narażeniem (w tym przypadku: określonym genomem) a jego skutkiem w postaci choroby lub innego defektu zdrowotnego.

1. Główne miary zależności w badaniach epidemiologicznych.

Podstawowymi miarami zależności w badaniach epidemiologicznych są:

Różnica ryzyka:

Ryzyko względne:

Iloraz szans:

Inną często używaną miarą związku pomiędzy narażeniem a skutkiem zdrowotnym jest ryzyko przypisane, wyrażające nadwyżkę ryzyka wśród osób eksponowanych w porównaniu z osobnikami nienarażonymi.

2. Wnioskowanie o związkach przyczynowych w badaniach epidemiologicznych.

Spostrzeżenie o istnieniu zależności pomiędzy ekspozycją na czynnik genetyczny i skutkiem zdrowotnym, nawet jeśli związek ów jest statystycznie istotny, nie świadczy jednoznacznie, że czynnik ten jest przyczyną wystąpienia skutku zdrowotnego.

Sformułowano dziewięć kryteriów, których spełnienie upoważnia do przyjęcia twierdzenia, że ujawniona zależność epidemiologiczna ma charakter przyczynowy:

1. Siła związku. Zależy od tego, jak duże w kategoriach liczbowych są ww. miary związku. W przypadku czynników genetycznych: im większa jest różnica pomiędzy osobnikami o różnych genotypach, z tym większym zaufaniem można wnioskować, że inkryminowany gen odgrywa rolę czynnika przyczynowego.

2. Spójność. Określona zależność wykazywana jest przy zastosowaniu różnych rodzajach badań w różnych populacjach.

3. Swoistość. Ściśle określony czynnik narażający wykazuje związek ze ściśle określonym skutkiem zdrowotnym (wymaganie to nie jest jednak w pełni bezwzględne, ponieważ ekspozycja na określony czynnik może wykazywać związek z wieloma chorobami).

4. Sekwencja w czasie. Ekspozycja powinna wyprzedzać w czasie skutek zdrowotny. Ponieważ genotyp jest zdeterminowany przed urodzeniem, kryterium to w stosunku do ekspozycji genetycznej zawsze jest spełnione.

5. Gradient biologiczny. Wzrastającej dawce ekspozycji towarzyszy wzrost (lub obniżenie) prawdopodobieństwa wystąpienia określonego skutku zdrowotnego. W przypadku czynnika genetycznego analizuje się prawdopodobieństwo wystąpienia skutku zdrowotnego u osobników z brakiem, jednym lub dwoma inkryminowanymi allelami.

6. Racjonalność. Domniemany związek przyczynowy jest wytłumaczalny i zgodny z ogólną wiedzą biologiczną. (Nie jest to kryterium absolutne, ponieważ w przypadku czynników genetycznych często to badanie epidemiologiczne nasuwa pierwsze przypuszczenie, że badany gen może być odpowiedzialny za dany skutek chorobowy).

7. Koherentność. Hipotetyczny związek przyczynowy nie jest sprzeczny z dotychczasową wiedzą o patogenezie danej choroby.

8. Dowody eksperymentalne. Eksperymentalne doświadczenia laboratoryjne dostarczają dowodów na potwierdzenie związku przyczynowego.

9. Analogia. Istnieją podobne przykłady zależności pomiędzy innymi genotypami i skutkami zdrowotnymi, które mogą nasuwać przypuszczenie, że zaobserwowany związek ma charakter przyczynowy.

1. Co to są uwarunkowania wieloczynnikowe?

O uwarunkowaniach wieloczynnikowych mówimy w sytuacjach, w których skutek zdrowotny nie zależy wyłącznie od jednego czynnika (np. zmutowanego genu), lecz także od narażenia na czynniki środowiskowe.

2. Profilaktyka pierwotna w chorobach uwarunkowanych genetycznie.

Celem profilaktyki pierwotnej jest zmniejszenie częstości rozwoju wad wrodzonych u płodu w okresie życia wewnątrzmacicznego. Powodzenie jej pozwoliłoby ograniczyć zakres stosowania profilaktyki wtórnej i trzeciorzędowej. Jak dotąd jednak, jedynym znaczącym w skali populacyjnej osiągnięciem jest suplementacja kwasem foliowym w okresie przedkoncepcyjnym i w pierwszym trymstrze ciąży. Dotyczy to głównie (choć nie tylko) wad cewy nerwowej.

3. Zasady polskiego programu profilaktyki pierwotnej wad cewy nerwowej.

„Polski program pierwotnej profilaktyki WCN”, str. 134.

1

16

---