.Wektor plazmidowy poddano linearyzacji enzymem EcoRI został uzyty do ligacji z DNA powstałym w wyniku hybrydyzacji dwóch syntetycznych oligonukleotydów. Syntatyczny ds.DNA został tak zaprojektowany iż posiada konce identyczne z końcami wektora(EcoRI).Mieszanine poligacyjna poddano transformacji komórki bakteryjne i wylano je na podłoze zawierajace odpowiedni dla wekrota antybiotyk. Które z podanych ponizej twierdzen sa nieprawdziwe?
a)pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace wektor pozbawiony insertu tak bo mogle sie sam zamknac
b )pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace rekombinowany wektor z wbudowanym jednym fragmentem tak
c)pośród powstałych klonów można było zaobserwowac wektor zawierajacy wiecej niż jeden fragment tak bo jak to oligonukleotyd (krotki) i ma takie same wszystkie konce to moze tak byc
d)ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 4ch wiazań fosfodiestrowych tak (po 2 wiazana na kazdej nici a to bylo dsDNA)
f) ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 2ch wiazań fosfodiestrowych nie

1. jak transformowano bakterie pBR322 otrzymano 108 kolonii. Ile otrzymamy jak transformujemy bakterie plazmidem z insertem o dl. (chyba) 2000pz.
   odp. mniej bo im mniejsza cz. DNA tym lepiej bakteria ją łyknie (z insertem jest wiekszy niz sam plazmid)
   
   2) Ktory enzym jest przede wszystkim odp. za utrate fragmentu 5' sekwencji cDNA
   
   ja dalam polimeraza DNA I , bo odwrotna transkryptaza ma starter komplementarny do AAAAAA na 3' koncu mRNA a jak ona juz zrobi ta cz. DNA to pol.DNA I moze miec problem ze starterem
   
   5-------------------------------AAAAAAAAAAA3 mRNA
   _________TTTTTT (starter dla odw. transkryptazy)
   
   
   5---------------------------------AAAAA3 (RNA)
   3---------------------------------TTTTT5 (1szy DNA)
   ^^^ tu jest problem wlasnie (a to robi pol. DNA)
   
   3) Ktory z procesow nie dotyczy techniki primer extension
   
   tu nie pamietam co bylo
   
   1.Charakterystyka wektora(tylko rysunku nie ma hehheheheh)
   a)wektor może być użyty do przygotowania biblioteki genomowej
   b) zawiera geny markerowe
   c)może replikować w komórkach bakteryjnych w sposób charakterystyczny dla plazmidów
   d)zawiera COS -pakowanie do wektora
   e)zawiera polilinker(sekwencje wielokrotnego klonowania)
   
   
   2.Nukleaza SI
   a) może być użyta do lokalizacji sekwencji intronowych tak
   b) może degradować DNA i RNA i powstaja produkty posiadajace sekwencje P-5' tak
   c) DNANA,RNA:RNA i DNA:RNA sa odporne na działanie tego enzymu tak
   b) jest egzonukleazą NIE - endo!
   e) używana do odtrawiania fragmentów kw.nukleinowych ,które maja forme pojedynczej nici tak
   
   3.Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu DNA o końcach tępych (ja pamietam ze tu bylo dodane ze chodzi o zn. 5')?
   a) dATP znakowany P32 w pozycji g
   b) ATP znakowany w pozycji a
   c) dGTP znakowany w pozycji a
   d) [g-P32] -ATP
   e) [a-P32]-dATP
   
   
   
   
   5. Dwie próbki E.coli poddano transformacji plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na ampicylinę).Do pierwszej próbko dodano niewielka ilośc pozywki i wylano na podłoze.do drugiej również dodano niewielka ilosc pozywki i wylano na podłoze najpierw bez antybiotyku ,inkubowano przez 30 min w 37'C a potem na antybiotyk.:
   
   na pierwszej na pewno bedzie mniej niz na 2 bo opornosc na ant. daje produkt genu a nie sam gen wiec komorka musi miec czas na zrobienie tego bialka co daje opornosc
   
   a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :300 klonów NIE
   b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :25 klonów NIE
   c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów MOZLIWE, ZAKŁADAJĄC ZE SAME SIE TEZ MOGA ZMUTOWAC, ZWLASZCZA ZE TO MNIEJ NIZ 10% ALE NIE DAM SOBIE ZA TO GLOWY UCIAC
   d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka II :300 klonów TO JEST NA PEWNO OK
   e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z próbka II :30 klonów NIE
   
   6.Dla elektroforezy nie jest prawdą: (chyba zalezy w jakim żelu )
   a)superzwinięte czasteczki DNA wędruja szybciej niż liniowe prawda
   b)cząsteczki DNA obdazone ładunkiem ujemnym wędrują do elektrody dodatniej prawda
   c)mieszanian fragmentów Dna jest rozdzielana tym ekektywniej im któtsze sa fragmenty prawda
   d)małe cząsteczki Dna wedruja najczescoej szybciej niż wieksze [przy załozeniu ze stosunek ładunku do masy jest bardzo podobny dla różnych DNA] prawda
   e)cząsteczki o długości 302 i 303 pz mogą być rozdzielane dla agarozowego nie prawda, bo to do duzych cz. jest i musza miec duza roznice masy, a dla poliakryloamidowego prawda
   Lanii (19:47)
   

7.Enzym restrykcyjny ClaI rozpoznaje sekwencje AT CGAT i trawi wiazanie fosfodiestrowe pomiedzy resztami TiC.enzym restrykcyjny TaqI rozpoznaje sekwencje T CGA:
ClaI : AT CGAT TaqI : T CGA
TAGC TA AGC T
^^ i to sie pewnie rozjedzie
a)ktotsze (chyba wystające raczej) fragmenty DNA generowane przez enzymy sa końcami komplementarnymi TAK
b) fragmenty powstałe po trawieniu enzymami sa tylko w czesci komplementarne W CAŁOŚCI KOMPLEMENTARNE
c)ClaI i TagI sa izoschizomerami IZOKAUDAMERAMI (TWORZĄ TAKIE SAME KOCE LEPKIE, IZOSCHIZOMERY TNA TĘ SAMĄ SEKWENCJĘ ALE NIE KONIECZNIE TAK SAMO)
d)dowolne fragmenty powstałe po trawieniu ClaI i TagI mogą być ligowane i następnie trawione ClaI NIE bo przy Taq za T lub A moze być cokolwiek a przy Cla musi byc ATCGAT
e)dowolne fragmenty powstałe po ligowaniu produktu trawienia ClaI i TagI mogą być trawione TagI tak

8.Klon może być użyty jako substrat do radioaktywnego znakowania fragmentu DNA przy wykorzystaniu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA: (TO JEST BEZ SENSU BO KLON TO NIE SUBSTRAT DLA NICZEGO, ALE DLA POLMERAZY KLENOWA SUBSTRATEM DO ZNAKOWANIA SĄ dNTP ZNAKOWANE W POZ. ALFA - są wbudowywane do łancucha dlatego alfa - najblizej cukru)
a)dATP znakowany P32 w pozycji g
b)ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a OK
d)[g-P32] -ATP
e)[a-P32]-dATP OK

10.Zakładajac ze polimeraza Tagi nie traci aktywnosci ani nie ulega rozkładowi,substraty PCR można powiedziec ze dov\celowa sekswncja Dna jest powielana po n-cyklach:
2 ^ (n-2) bo 2 pierwsze są bezuzyteczne

11.Który z podanych wektorów jest najmniej przydatny do sekwencjonowania genomu ssaczego?:
a)YAC
b)BAC
c)wektor bedacy pochodną faga l
d)kosmid
e)wektor plazmidowy (-- ten najmniej przydatny bo najmniej miesci

12.spośród podanych temperatur wybrac która z najwiekszym powodzeniem da wydajne otrzymanie produktów PCR przeprowadzajac dla startera 5' GGTAATCGGTTAGGCTCC3':
a)56'C
b)72'C
c)59'C
d)55'C
e)żadna

Tm=4*(ilość G +ilość C) +2*(ilość A + ilość T)
temp. hybrydyzacji jest o 1-2 st. niższa do Tm

13.Który z podanych czynników istotny dla jednej z metod pozwalajacych an otrzymanie cDNA jest głównym winowajcą odpowiedzialnym za brak cDNA inf reprezentujacej 5' koniec transkryptu:
a)5'AGCAATGG3'
3'TCGT5'
b)5'AGCAAT GG3'
3'ACC5'
c)5'AGCAATGG3'
3'TCGTTACC5&# 8217;
d)5'AGGAA3'
3'TCGTTACC5'
f) nie wiadomo

tu chyba kolezanka pomylila pytanie z odpowiedzią, bo odpowiedz na to pytanie jest w 1), a odpowiedzi są do tego gdzie najpierw starwiono DNA jakims e.r. co daje 5'konce lepkie a potem trawiono Bal31 i S1 wiec konce na pewno beda tepe (Bal31 i S1 sie o to postaraja), ale kij wie czy to nie byl hak i czy nie chodzi o odpowiez ze nie wiadomo bo nie wiadomo jaka byla sekwencja poczatkowa

14.Wektor plazmidowy zawiera gen markerowy odpowiedajacy za odpornośc na erytromycynę(EryR) i gen markerowy odpowiedzialny za opornośc na ampicylinę.Gen AmpR został przecięty enzymem restrykcyjnym a powstały w ten sposób plazmid połączono z fragmentem 1000pz o końcach komplemantarnych do wektora.Które z ponizsych fenotypów maja komórki transformowane: (insercyjan inaktywacja AmpR w rekombinowanych plazmidach, ja pamietam ze w pytaniu chodzilo nie o transformowane po prostu, tylko transformowane rekombinowanym)
a)niewrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę (-- to jest ok przy transformowanych wektorem NIErekombinowanym (samoligacja)
b) niewrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
c) wrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
d) wrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę (-- to jest ok przy transformowanych wektorem rekombinowanym
e)nie wiadomo

15.Kolista cząsteczka Dna posiada n-miejsc restrykcyjnych EcoRI.ile fragmentów DNA powstanie po całkowitym jej strawieniu?
a)n-1
b)n OK bo kolista, jak jest liniowa to jest wtedy n+1
c)n+1
d)2n-1
e) zależy od liczby powtórzeń

16.w analizie Southern fragment sekwencji genu z drożdzy zostal uzyty jako sonda do analizy fragmentow powstałych w wyniku trawiania EcoRI DNA genowowego z jalpa. Na autoradiogramie zaobserwowano zadioaktywne pasmo odpowiedajace fragmentowi DNA o dłudości 4 kb.Oznacza to ze:
a)gen jalpa ma 4kb NIE, bo nie wiadomo czy to caly gen czy jego fragment
b)gen japla jest takisam jak gen drozdzy NIE, mogą miec wspolne sekwencje ale ne musza byc cale takie same
c)gen japla jest obcy (NIE OBCY YLKO OBECNY BYŁO !!!) w preparacie poddanym analizie jesli obecny to ok - TU JESZCZE BYLO NAPISANE ZE GEN CZEGOŚTAM JALPA I TO JEST WAZNE BO GEN KODUJACY TO SAMO BIALKO Z DROZDZY BYL SONDĄ, GENY KODUJACA BIAŁKA Z TEJ SAMEJ RODZINY MAJĄ CZĘSTO PODOBNĄ SEKWENCJĘ (SEKWENCJE WSPOLNE) W ROZNYCH ORGANIZMACH
d)gen japla jest obecny w 4ch kopiech w genomie bez sensu zupelnie
e) gen japla ma taka sama sekwencje jak gen drożdzy no niby prawda ZAWIERA taka sama sekwencje ale nie zaznaczylam tego bo to brzmi tak jakby mial CAŁĄ sekwencję taka samą

Skład pożywki minimalnej M9 dla E. coli
skład na 1000 ml pożywki
Na2HPO4 x 12 H2O 15,2 g
KH2PO4 3 g
NaCl 0,5 g
NH4Cl 1 g
po wyjałowieniu pożywki trzeba dodać jeszcze jałowe roztwory:
1M MgSO4 x 7 H2O 1 ml
0,1M CaCl2 1 ml
20% r-r glukozy 10 ml
po zmieszaniu wszyskich składników pH pożywki wynosi około 7,0

do pytania z pozywka m9
- zawiera ampicyline
- zawiera same substnacje organiczne
- zawiera same substancje nieorganiczne


- ds dna ulegnie denaturacji do jednej nici;
- w tym ph koliste dna nie ulegaja dysocjacji
- po zakwaszeniu do ph 7.0 dna plazmidowy asocjuje z dna bakteryjnym;
- po zkwaszeniu do ph 7.0 dna chromosomalny bakteryjny asocjuje z DNA plazmidowym



przy wektorze zastepczym wartosci wynosily
8kb
22kb
20kb
40kb
a jego ramiona lacznie mialy 30 kb - do wektore dodano fragmenty - stworzono biblioteke i pytana jakiej dlugosci beda inserty

tam z pozywkami chodzilo o to ze najpierw nukleaza tniemy gen kodujacy za odpornosc na ampicyline potem ligujemy go z fragmentami odpowiedizalnymi za kodowaniem odpornosci na erytromycyne i cos tam jeszcze-pytali co musi byc w podlozu zeby wychodowac bakterie ktore beda produkowac zwiazek przeksztalcajacy jedna z tych substancji w nietoksyczna;

do knock outu
posiada oba allele typu dzikiego

do elektorforezy
dna posiada ladunek dodatni
dna wedruje do katody ujemnej
superhelikalne porusza sie wolniej niz niciowe

pytano tez jakie czynnosci maja miejsce tylko przy mapowaniu konca3'

z 50 mM
mamy 14 ul dna dodajemy 2ul enzymu 2 ul buforu(nacl) i 2 ul czegos jeszcze - jezeli stezenie calego r-ru chyba wynosi 50mM to ile wynosi stezenie wyjsciowe nacl

przy rysunku z wektorem
- jest kosmiedem
- zawiera gen markerowy
- mozna stosowac polimerazy faga
- mozna go uzyc do tworzenia biblioteki

Kinaza polinukleotydowa: żywcem chyba z zeszlego roku:

Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu DNA o końcach tępych?
a) dATP znakowany P32 w pozycji g
b) ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a
d) [g-P32] -ATP
e) [a-P32]-dATP

2. Ile klonów przeżyje? Jak wyzej
Dwie próbki E.coli poddano transformacji plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na ampicylinę). Do pierwszej próbko dodano niewielka ilośc pozywki i po 2 min wylano na podłoze z ampicyliną .do drugiej również dodano niewielka ilosc pozywki i wylano na podłoze po inkubacji przez 30 min w 37'C. Który wynik jest najbardziej prawdopodobny?
a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :25 klonów
c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów
d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z próbka II :30 klonów

3. Elektroforeza
a) ds Dna porusza się tym szybciej im jest krótsze
b) liniowe ds. DNA porusza się szybciej niż odpowiadające mu koliste sdDNA
c) można rozdzielic w celu preparacji DNAo długości 1007 i 1008 pz
d)
e)

4. Charakterystyka wektora (http://www.geneservice.co.uk/products/cdna/datasheets/Dros_cDNA/clones.jsp)
a) wektor może być użyty do transkrypcji in vitro przy pomocy polimeraz fagowych
b) zawiera geny markerowe
c) jest kosmidem
d)
e)

5. Eksperyment restrykcyjny:
14µl DNA + 2 wody + 2 r-ru rur enzymem + 2 buforu. Wiedząc ze enzym preferuje 50 mM NaCl można przypuszczac ze w buforze jest
a) 50 mM NaCl
b) 500 mM
i inne jaies pierdoly

6. Neurospor haploid ma lucyferazę. Krzyzujemy go ze szczepem dzikim bez lucyferazy. Askospory zbadano PCR pod katem obecności lucyferazy. Można przypuszczac ze gen znajdziemy w
0%
25%
50%
75%
100 %
askospor

7. M9
a) tylko organiczne
b) tylko nieorganiczne
c) umożliwia hodowle w ściśle zdefiniowanych warunkach
d)
E)

8. FISH
gen wystepuje w pojedynczej kopii. W profazie przeprowadzono FISH w cel jego znalezienia. Zaobserwowano:
a) 4 pary sygnałow
b) 2 blisko siebie położone sygnaly
c) 2 pary sygnalów
d) 2..
e) 4…

9. trawienie' konce 5' wystające' nukleaza s1' terminalna transferaza + DTP' jaki będzie charakter końców?
Ja dalam ze 3' wystające

10. ramiona wektora zastępczego z faga lambda maja 30kb. Ile możę mieć insert?
20kb
22kb
…
…
…

11. chcemy chcemy plazmidu gen odporności na chloramfenikol. Wektor ma marker amp®. Czego uzyjemy do selekcji klonu z genem odpornic\sci na chloramfenikol
amp + erytromycyna
amp + chloramfenikol
neomycyna +…
…
…



12. chyba ze 4 restryktazy.
a- A i B to izokaudamery
b- produkty trawienia przez A i B mogą być ligowa\ne przez ligazę T4
c- A i C to izoschizomery
d- produkt ligacji z punktu b może być efektywnie trawiony przez A i B
e- …

13. student : nie wiem czy czegos nie zamieszam
wektor miał amp® i msc w lacZ' tak ze możliwa była ekspresja aktywnego lacZ'.
Wklonowano do MSC w ramce odczytu cDNA genu X i w celu przeprowadzenia metagenezy kasetowej enzymem jakimstam wycieto ze srodka 35-nukleotydowy fragment
Oddielono to elektroforetycznie
Fosfataza defosforylowano konce
Syntetyczny oligonukleotyd prosto z syntezy (czyt nieufosforylowany) dodano i zlitowano
Transformacja i selekcja
a- klonow bylo zaskakujaco malo - 1-2% w stosunku do kontroli w ktorej ligacji ulegla sam niedefosforylowany wektor
b- klony - rekombinanty byly niebieskie
c- nie byly niebieskie
d- ...
e- ...

14. Anemia sierpowta
dziecko z 25% prawdopodobienstwem będzie mialo anemie badanie u rodziców musialo wykazac:
fragment 1.3 u jednego i 1,1 oraz 0,2 u drugiego
1,3 1,1 i 0,2 u obojga
1,1 u jednego i 0,2 u drugiego
1,1 i 0,2 u obojga
…

15. mapowanie 3' konca
Które czynosci wykonujemy
-Uzywany rekombinowanego enzymu o aktywności enzymu uzywanego przez retrowirusy do syntezy dna na rna
- denaturacja i elektroforeza dna
- ciecie czegos tam nukleaza S1
-..
-..

16 ukladanie klonow po kolei STS

17. chrmosome walking. Które czynności wybierzesz (niektóre) i w jakiej kolejności je ułożysz żeby otrzyn\mac klony reprezentujące odcinek dna o długości 200kb. Na 1 koncu ma być gen A do którego już masz klon i możesz z niego zrobic sonde, na drugim koncu ma być gen odp za nowotwor piersi
izolacja ludzkiego dna
izolacja dna E.coli
sporządzenie biblioteki w fagu lambda
całkowite trawienie dna ecorI
częściowe trawienie dna bamhI w celu otrzymania klonow~ 20kb
sporządzenie sondy z A przeszukanie biblioteki i subklonowanie w celu otrzymania innej sondy
znow przeszukanie
powtarzamy 2 ostatnie etapy az otrzymamy odpowiednia ilość klonow
…
…
…
…
…

18 knockout genu. Chcemy zrobic nokaut w myszy. Komorki macierzyste którym (no wlasnie. Dla mnie to brzmiało tak jakby mialo znaczyc: ) mamy zamiar znokautowac gen:
maja gen tk
maja 1 allel dziki i jeden zmutowany
SA odporne na neomycyne
…
…  

)1. Kinaza polinukleotydowa: żywcem chyba z )zeszlego roku:
)Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do )enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu )DNA o końcach tępych?
)a dATP znakowany P32 w pozycji g
)b) ATP znakowany w pozycji a
)c) dGTP znakowany w pozycji a
)d) [g-P32] -ATP
)e) [a-P32]-dATP

Tak jak to bylo mowione tylko [g-32] - ATP.

)2. Ile klonów przeżyje? Jak wyzej
)Dwie próbki E.coli poddano transformacji )plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na )ampicylinę). Do pierwszej próbko dodano niewielka )ilośc pozywki i po 2 min wylano na podłoze z )ampicyliną .do drugiej również dodano niewielka )ilosc pozywki i wylano na podłoze po inkubacji )przez 30 min w 37'C. Który wynik jest najbardziej )prawdopodobny?
)a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka )II :300 klonów
)b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka )II :25 klonów
)c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka )II :400 klonów
)d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka )II :300 klonów
)e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z )próbka II :30 klonów

Pytanie dlugie a tresc w sumie krotka. Zaznaczylem
c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów
Bo wydaje mi sie ze po pierwsze dlatego pisze ze po 2 min. dopiero je wylano zeby uswiadomic nam ze jednak jakis czas uplynal i istnieje niezerowe prawdopodobienstwo tego ze czesc bakterii juz sobie to bialko zsyntetyzowala.

)3. Elektroforeza
)a) ds Dna porusza się tym szybciej im jest )krótsze
)b) liniowe ds. DNA porusza się szybciej niż )odpowiadające mu koliste sdDNA
)c) można rozdzielic w celu preparacji DNAo )długości 1007 i 1008 pz
)d)
)e)

TO bylo apropo elektroforezy w zelu agarozowym i byly tam jakies glupotki tez ze dna wedruje do dodatniej elektrody i tak dalej. Jedna odpowiedz byla oczywiscie poprawna i ja zaznaczylem ale nie pamietam jak brzmiala (nie byla to odpowiedz c)

)4. Charakterystyka wektora (http://www.)geneservice.co.uk/products/cdna/datasheets/)Dros_cDNA/clones.jsp)
)a) wektor może być użyty do transkrypcji in vitro )przy pomocy polimeraz fagowych
)b) zawiera gen markerowy (jeden gen nie geny!)
)c) jest kosmidem
)d)
)e)

a) tak bo ma promotory tychze, b) rzecz jasna tez bo ma ampR, reszte uznalem za bledna (nie ma COS wiec nie jest cosmidem).

)5. Eksperyment restrykcyjny:
)14µl DNA + 2 wody + 2 r-ru rur enzymem + 2 )buforu. Wiedząc ze enzym preferuje 50 mM NaCl )można przypuszczac ze w buforze jest
)a) 50 mM NaCl
)b) 500 mM
)

To wydawalo mi sie podchwytliwe i pomimo ze wydawalo mi sie poczatkowo ze 50mM potem stwierdzilem ze to zbyt oczywiste i po glebszym namysle doszedlem do wniosku ze: nie da sie tego okreslic bez dodatkowych danych (byla taka odpowiedz). Poniewaz oprocz tego ze dodajemy buforu sam enzym w roztworze tez znajduje sie w jakims roztworze (zapewne buforowym) ktorego stezenia NaCl nie znamy wiec nie da sie okreslic.

)6. Neurospor haploid ma lucyferazę. Krzyzujemy go )ze szczepem dzikim bez lucyferazy. Askospory )zbadano PCR pod katem obecności lucyferazy. Można )przypuszczac ze gen znajdziemy w
)0%
)25%
)50%
)75%
)100 %

Tu moja odpowiedz wam nie potrzebna poniewaz strzelalem i dalem 50%.

)7. M9
)a) tylko organiczne
)b) tylko nieorganiczne
)c) umożliwia hodowle w ściśle zdefiniowanych )warunkach
)d)

tylko c) rzecz jasna

)8. FISH
)gen wystepuje w pojedynczej kopii. W profazie )przeprowadzono FISH w cel jego znalezienia. )Zaobserwowano:
)a) 4 pary sygnałow
)b) 2 blisko siebie położone sygnaly
)c) 2 pary sygnalów
)d) 2..
)e) 4…

Dalem 2 pary sygnalow, ale moze ktos mnie oswieci czy na chromaydach siostranych wystepuja te same geny? ja uznalem ze tak wiec dalem dwie pary (wiem ze to wstyd o to pytac).

)9. trawienie' konce 5' wystające' nukleaza s1' )terminalna transferaza + DTP' jaki będzie )charakter końców?
)Ja dalam ze 3' wystające

Nie DTP' tylko dNTP (to oczywiscie szczegol) ja dalem taka sama odpowiedz.

)10. ramiona wektora zastępczego z faga lambda )maja 30kb. Ile możę mieć insert?
)20kb
)22kb
)…

Dalem 22, pamietajac ze max pojemnosc kapsydu lambda jest 52kb. Czy to jest dobrze nie jestem pewien ale chyba tak (to znaczy okreslenie wektor zastepczy oznacza ze chcieli8 go potem wpakowac do kapsydu).

)11. chcemy chcemy plazmidu gen odporności na )chloramfenikol. Wektor ma marker amp®. Czego )uzyjemy do selekcji klonu z genem odpornic\sci na )chloramfenikol
)amp + erytromycyna
)amp + chloramfenikol
)neomycyna +…

Troche inaczej bylo sformulowane pytanie: byla biblioteka (czyli pokrojony wektor) genow powstala z pewnego plazmidu ktory mial opornosc na chloramfenikol erytromycyne i jakies inne badziewia. Pytanie jakiej pozywki nalezalo uzyc aby wyselekcjowac bakterie syntetyzujace acetylotransferaze chloramfenikolu?
pierwsza odpowiedz oczywista pozywki z udzialem chloramfenikolu
druga pozywka z ampicylina i chloramfenikolem (tu mialem watpliwosci bo w pytaniu nie bylo napisane w ktorym miejscu zostal przeciety wektor i gdzie wklonowano fragment, ale pytalem sie i gosc powiedzial ze moge przyjac ze plazmid-nosnik zostal przeciety poza obrembem genu AmpR - mcs bylo gdzie indziej tak wiec rekombinanty bede oporne i na amp i na chl.

)12. chyba ze 4 restryktazy.
)a- A i B to izokaudamery
)b- produkty trawienia przez A i B mogą być )ligowa\ne przez ligazę T4
)c- A i C to izoschizomery
)d- produkt ligacji z punktu b może być efektywnie )trawiony przez A i B

Ciezko bez rysunku, ale chyba odpowiedz z izokaudamerami byla dobra, dlugo rozmyslalem nad odpowiedzia b i nie pamietam czy ja zaznaczylem nie wiem czy ligaza T4 laczy tylko konce tepe czy zwykle lepkie tez.

)13. student : nie wiem czy czegos nie zamieszam
)wektor miał amp® i msc w lacZ' tak ze możliwa )była ekspresja aktywnego lacZ'.
)Wklonowano do MSC w ramce odczytu cDNA genu X i w )celu przeprowadzenia metagenezy kasetowej enzymem )jakimstam wycieto ze srodka 35-nukleotydowy )fragment
)Oddielono to elektroforetycznie
)Fosfataza defosforylowano konce
)Syntetyczny oligonukleotyd prosto z syntezy (czyt )nieufosforylowany) dodano i zlitowano
)Transformacja i selekcja
)a- klonow bylo zaskakujaco malo - 1-2% w stosunku )do kontroli w ktorej ligacji ulegla sam )niedefosforylowany wektor
)b- klony - rekombinanty byly niebieskie
)c- nie byly niebieskie
)d- ...
)e- ...

wybralem ktorys z logicznie wynikajacych kolorow juz nie pamietam ktory i ze bylo ich zaskakujaco malo (chyba bo nie bylem pewny) bo tam na pewno byl nick (nik?). ktos wie jak dziury w postaci braku wiazania fosfodiestrowego wplywaja na transkrypcje? Ja nie, ale pewnie nie najlepiej.

)14. Anemia sierpowta
)dziecko z 25% prawdopodobienstwem będzie mialo )anemie badanie u rodziców musialo wykazac:
)fragment 1.3 u jednego i 1,1 oraz 0,2 u drugiego
)1,3 1,1 i 0,2 u obojga
)1,1 u jednego i 0,2 u drugiego
)1,1 i 0,2 u obojga

To bylo proste, oboje rodzicow musi byc heterozygotami czyli
1,3 1,1 i 0,2 u obojga

)15. mapowanie 3' konca
)Które czynosci wykonujemy
)-Uzywany rekombinowanego enzymu o aktywności )enzymu uzywanego przez retrowirusy do syntezy dna )na rna
)- denaturacja i elektroforeza dna
)- ciecie czegos tam nukleaza S1
)-..

Nie mam pojecia. cos tam kombinowalem.

)16 ukladanie klonow po kolei STS

tak trzeba bylo poszeregowac, bylo do zrobienia tylko powoli i wszystko sobie rozpisac.

)17. chrmosome walking. Które czynności wybierzesz )(niektóre) i w jakiej kolejności je ułożysz żeby )otrzyn\mac klony reprezentujące odcinek dna o )długości 200kb. Na 1 koncu ma być gen A do )którego już masz klon i możesz z niego zrobic )sonde, na drugim koncu ma być gen odp za nowotwor )piersi
)izolacja ludzkiego dna
)izolacja dna E.coli
)sporządzenie biblioteki w fagu lambda
)całkowite trawienie dna ecorI
)częściowe trawienie dna bamhI w celu otrzymania )klonow~ 20kb
)sporządzenie sondy z A przeszukanie biblioteki i )subklonowanie w celu otrzymania innej sondy
)znow przeszukanie
)powtarzamy 2 ostatnie etapy az otrzymamy )odpowiednia ilość klonow

Moja kolejnosc byla mniej wiecej taka:
izolacja ldzkiego dna
czesciowe trawienie
chyba sporządzenie biblioteki w fagu lambda
sporządzenie sondy z A przeszukanie biblioteki i subklonowanie w celu otrzymania innej sondy
znow przeszukanie
powtarzamy 2 ostatnie etapy az otrzymamy odpowiednia ilość klonow

)18 knockout genu. Chcemy zrobic nokaut w myszy. )Komorki macierzyste którym (no wlasnie. Dla mnie )to brzmiało tak jakby mialo znaczyc: ) mamy )zamiar znokautowac gen:
)maja gen tk
)maja 1 allel dziki i jeden zmutowany
)SA odporne na neomycyne

dalem ze maja dwa dzikie allele ale strzelalem.

Z nei wymienionych wyzej pytan:
Pytanie a denaturacje alkaliczna dna, tam byla odpowiedz chyba poprawna choc brzmiala dziwnie
ze po obnizeniu pH zdenaturowane dna chromosomowe mozna latwo oddzielic od DNA plazmidowego.

Odnośnie pytania 5 - eskperyment restrykcyjny:
Enzymy nie są przechowywane w byforach tylko w r-rach zapewniających maksymalną stabilność w zamrażarce:) Profesor mowił o tym na wykładzie. W roztworach tych może być np glicerol itp. Jeśli jakiś idiota stwierdzi, że skoro enzym jest stary=mniej aktywny wiec lepiej dać go wiecej, to zwieksza się ilość glicerolu w mieszanienie reakcyjnej i pojawić się może STAR ACTIVITY.
Bufory do reakcji sa ileś razy bardziej stężone niż wymaga tego enzym. Skoro enzym lubi 50mM, a buforu w mieszaninie jest 1/10 objętości, to znaczy że bufor był 10x. Czyli w buforze było 500mM.
Przestrzegam przed zakuwaniem testu na pamięć. Moim zdaniem dobrze że są testy z tego względu, że wiemy model pytań preferuje profesor. Jednak uczyć się należy z wykładu. I też nie na pamięć a na zrozumienie! Jeśli dobrze poszukać i się zastanowić to wszystkie odpowiedzi potrzebne do zaliczenia powinny się znaleźć w notatkach z wykładu.
Pozdrawiam i życzę powodzenia!

1. Kinaza polinukleotydowa: żywcem chyba z zeszlego roku:
   Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu DNA o końcach tępych?
   a) dATP znakowany P32 w pozycji g
   b) ATP znakowany w pozycji a
   c) dGTP znakowany w pozycji a
   d) [g-P32] -ATP- to i tylko to
   e) [a-P32]-dATP
   
   2. Ile klonów przeżyje? Jak wyzej
   Dwie próbki E.coli poddano transformacji plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na ampicylinę). Do pierwszej próbko dodano niewielka ilośc pozywki i po 2 min wylano na podłoze z ampicyliną .do drugiej również dodano niewielka ilosc pozywki i wylano na podłoze po inkubacji przez 30 min w 37'C. Który wynik jest najbardziej prawdopodobny?
   a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
   b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :25 klonów
   c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów- prawda
   d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
   e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z próbka II :30 klonów
   
   Zaznaczyłam d, ale to chyba było żle- powinno chociaż troche się namnożyć, po dyskusji z wami obstawiam c
   
   3. Elektroforeza w żelu agarozowym:
   a) ds Dna porusza się tym szybciej im jest krótsze- tak
   b) liniowe ds. DNA porusza się szybciej niż odpowiadające mu koliste sdDNA
   c) można rozdzielic w celu preparacji DNAo długości 1007 i 1008 pz
   d) superzwinięte porusza się szybciej- tak
   e)
   
   4. Charakterystyka wektora (http://www.geneservice.co.uk/products/cdna/datasheets/Dros_cDNA/clones.jsp)
   a) wektor może być użyty do transkrypcji in vitro przy pomocy polimeraz fagowych
   b) zawiera geny markerowe
   c) jest kosmidem
   d)
   e)
   
   Każdy miał inny rysunek, grupa e miała kosmid
   
   
   5. Eksperyment restrykcyjny:
   14µl DNA + 2 wody + 2 r-ru rur enzymem + 2 buforu. Wiedząc ze enzym preferuje 50 mM NaCl można przypuszczac ze w buforze jest
   a) 50 mM NaCl
   b) 500 mM , bo jest 10 razy bardziej stężony- tp jest ok
   i inne jaies pierdoly
   
   6. Neurospor haploid ma lucyferazę. Krzyzujemy go ze szczepem dzikim bez lucyferazy. Askospory zbadano PCR pod katem obecności lucyferazy. Można przypuszczac ze gen znajdziemy w
   0%
   25%
   50%
   75%
   100 %
   askospor
   
   Dałam że 100, bo w pytaniu było powiedziane, że startery sa zrobione dla genu lucyferazy- wiec tylko tam się polacza. Ale reki sobie odciac nie dam.
   
   7. M9
   a) tylko organiczne
   b) tylko nieorganiczne
   c) umożliwia hodowle w ściśle zdefiniowanych warunkach- prawda
   d)
   E)
   
   
   8. FISH
   gen wystepuje w pojedynczej kopii. W profazie przeprowadzono FISH w cel jego znalezienia. Zaobserwowano:
   a) 4 pary sygnałow
   b) 2 blisko siebie położone sygnaly
   c) 2 pary sygnalów
   d) 2 sygnały
   e) 4…
   
   
   Dałam d, ale to był strzał
   
   
   9. trawienie' konce 5' wystające' nukleaza s1' terminalna transferaza + DTP' jaki będzie charakter końców?
   Ja dalam ze 3' wystające
   *Ja też
   
   10. ramiona wektora zastępczego z faga lambda maja 30kb. Ile możę mieć insert?
   20kb
   22kb- prawda
   …
   …
   …
   
   11. chcemy chcemy plazmidu gen odporności na chloramfenikol. Wektor ma marker amp®. Czego uzyjemy do selekcji klonu z genem odpornic\sci na chloramfenikol
   amp + erytromycyna
   amp + chloramfenikol chyba(?)
   neomycyna +…
   …
   …
   
   12. chyba ze 4 restryktazy. Eco r1, xal, nhl, i cos tam
   a- A i B to izokaudamery
   b- produkty trawienia przez A i B mogą być ligowa\ne przez ligazę T4
   c- A i C to izoschizomery
   d- produkt ligacji z punktu b może być efektywnie trawiony przez A i B
   e- …
   
   Chyba rysunki były poprzestawiane. U mnie te 2 środkowe były izokaudamerami- cięły tak, że to co powstało, dało się potem zligować.
   Ale: przeciąć się tymi sami enzymami po zligowaniu nie dało, bo różniły się nukleotydy leżące dalej.
   
   13. student : nie wiem czy czegos nie zamieszam
   wektor miał amp® i msc w lacZ' tak ze możliwa była ekspresja aktywnego lacZ'.
   Wklonowano do MSC w ramce odczytu cDNA genu X i w celu przeprowadzenia metagenezy kasetowej enzymem jakimstam wycieto ze srodka 35-nukleotydowy fragment
   Oddielono to elektroforetycznie
   Fosfataza defosforylowano konce
   Syntetyczny oligonukleotyd prosto z syntezy (czyt nieufosforylowany) dodano i zlitowano
   Transformacja i selekcja
   a- klonow bylo zaskakujaco malo - 1-2% w stosunku do kontroli w ktorej ligacji ulegla sam - to zaznaczyłamniedefosforylowany wektor
   b- klony - rekombinanty byly niebieskie
   c- nie byly niebieskie
   d- ...
   e- ...
   
   Może coś jeszcze, ale zmęczyłam się czytaniem pytania ;)
   I nie mam pojęcia czy będzie niebieski.
   
   14. Anemia sierpowta
   dziecko z 25% prawdopodobienstwem będzie mialo anemie badanie u rodziców musialo wykazac:
   fragment 1.3 u jednego i 1,1 oraz 0,2 u drugiego
   1,3 1,1 i 0,2 u obojga bo rodzice SA heterozygotami (Aa Aa)
   1,1 u jednego i 0,2 u drugiego
   1,1 i 0,2 u obojga
   …
   
   15. mapowanie 3' konca
   Które czynosci wykonujemy mapując 3', a nie wykonujemy mapując 5'?
   -Uzywany rekombinowanego enzymu o aktywności enzymu uzywanego przez retrowirusy do syntezy dna na rna
   - denaturacja i elektroforeza dna
   - ciecie czegos tam nukleaza S1
   -znakowanie polimerazą 1 - prawda
   -..
   -..
   
   16 ukladanie klonow po kolei STS
   
   1 2 3 4 5
   A+ + +
   B + +
   C + +
   D + +
   I co w związku z tym a) ABCD b) DABC- prawda c) ABDE i c nie pasuje d) DABC e) DACB
   te plusiki to tak mniejwięcej są nie jestem pewna czy to tak wyglądało
   
   
   17. chrmosome walking. Które czynności wybierzesz (niektóre) i w jakiej kolejności je ułożysz żeby otrzyn\mac klony reprezentujące odcinek dna o długości 200kb. Na 1 koncu ma być gen A do którego już masz klon i możesz z niego zrobic sonde, na drugim koncu ma być gen odp za nowotwor piersi
   
   izolacja ludzkiego dna
   izolacja dna E.coli
   sporządzenie biblioteki w fagu lambda
   całkowite trawienie dna ecorI
   częściowe trawienie dna bamhI w celu otrzymania klonow~ 20kb
   sporządzenie sondy z A przeszukanie biblioteki i subklonowanie w celu otrzymania innej sondy
   znow przeszukanie
   powtarzamy 2 ostatnie etapy az otrzymamy odpowiednia ilość klonow
   
   
   Dokładnie. Tylko zastanawiam się po co ecorI, skoro bamhI daje te 20kb kawałki?
   Ogólnie:
   1.Izolujemy DNA
   2.Tniemy enzymem restrykcyjnym
   3.Robimy starter
   4.Powielamy 1 nić
   5.Ten powielony fragmencik będzie się pokrywał z następnym fragmencikiem itp
   
   
   
   
   18 knockout genu. Chcemy zrobic nokaut w myszy. Komorki macierzyste którym (no wlasnie. Dla mnie to brzmiało tak jakby mialo znaczyc: ) mamy zamiar znokautowac gen:
   maja gen tk
   maja 1 allel dziki i jeden zmutowany- zaznaczylam
   SA odporne na neomycyne
   
   Ale nie jestem pewna.
   
   
   19.bylo pytanie dotyczace ph 12,35
   mielismy dna plazmidowe ktore chcieliśmy wyizolować
   
   - ds. całe chromosomalne dna ulegnie denaturacji do jednej nici;- tak, o to w tym chodzi, ale u tego pana z zasady nie zaznaczam żadnej odpowiedzi, która zawiera w sobie słowo `całe', `wszystkie', `zawsze' itp. ;)
   - w tym ph wszystkie koliste dna nie ulegaja dysocjacji
   - po zakwaszeniu do ph 7.0 dna plazmidowy asocjuje z dna bakteryjnym;
   - po zkwaszeniu do ph 7.0 zdenaturowany dna chromosomalny bakteryjny będzie można łatwo oddzielić od plazmidowego- na pewno ok
   
   20. pytanie dotyczylo metody dideoksy sangera ;byla podana sekwencja nici matrycowej i pytali jaka bedzie do niej komplementarna;
   
   
   Dideoksy Sanger przykładowo
   odczyt od góry 5' ATC 3'
   matryca 3' TAG 5'

Większe cząsteczki DNA migrują wolniej niż cząsteczki małe ze względu na większe opory ruchu oraz większe trudności w penetrowaniu porów żelu będącego rodzajem sita molekularnego. Tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu dziesiętnego ilości par zasad.

Zwiększając stężenie agarozy zwalnia się tempo migracji DNA w żelu

http://zguw.ibb.waw.pl/~knbm/bmwi/podrek/biotech/biotech2.html to link dotyczacy restryktaz



Ujemnie naładowane cząsteczki DNA przemieszczają się w kierunku dodatniej elektrody, a szybkość ich ruchu zależy od długości fragmentów badanych kwasów nukleinowych

Obecność bromku etydyny w buforze do elektroforezy (i żelu) lub w barwniku do próbek zwalnia tempo przemieszczania się cząsteczek o ok. 15%
W buforze o niskiej sile jonowej DNA przemieszcza się bardzo wolno.

Żele poliakrylamidowe stosuje się zazwyczaj do rozdziału małych fragmentów (5 - 500 par zasad), ich zdolność rozdzielcza jest bardzo wysoka i pozwala rozdzielić fragmenty różniące się między sobą o 1parę zasad (np. w trakcie elektroforezy sekwencjonującej).

Żele agarozowe o różnym stężeniu stosuje się do rozdziału fragmentów DNA od 200 pz do 50 000 pz (50 kb - kilo base pairs). Większe fragmenty DNA (do 10´106 ) mogą być rozdzielane w żelu agarozowym metodą elektroforezy pulsacyjnej.

KOLEJNY

1.Charakterystyka wektora (TYLKO RYSUNKU NIE MA)
a) wektor może być użyty do przygotowania biblioteki genomowej
b) zawiera geny markerowe
c) może replikować w komórkach bakteryjnych w sposób charakterystyczny dla plazmidów
d) zawiera COS -pakowanie do wektora
e) zawiera polilinker(sekwencje wielokrotnego klonowania)

(ja tu mialam inne odpowiedzi i bez rysunku nie wiem o co chodzi)

2.Nukleaza SI
a) może być użyta do lokalizacji sekwencji intronowych - tak
b) może degradować DNA i RNA i powstają produkty posiadające sekwencje P-5' - tak
c) DNA:DNA, RNA:RNA i DNA:RNA są odporne na działanie tego enzymu - tak
b) jest egzonukleazą - endo!
e) używana do odtrawiania fragmentów kw.nukleinowych ,które maja forme pojedynczej nici - tak

Bal 31:
zaliczana do end, ale zachowuje siejak egzonukleaza
Rzeczywista:
- endonukleaza
- substrat:ssDNA
- produkty:5'-p(Np)n-N
Pozorna:
- egzonukleaza
- substrat:dsDNA
- produkty: 5'-NMP

Informacje o enzymie Bal31 ze strony firmy Fermentas:
Bal31 - katalizuje degradację ssDNA, liniowego dsDNA i RNA do 5'-mononukleotydów.
Liniowe dupleksy DNA:DNA i RNA:RNA są degradowane jednocześnie od końców 5' i 3' (z obu stron odtrawiane są mononukleotydy).

Bal31 jest także endonukleazą, która przecina nicki i regiony ss dupleksów DNA:DNA i RNA:RNA.

Nukleaza S1:
- endonukleaza
- preferuje pojedyńcze nici
- substraty: DNA, RNA
- produkty 5'-p(Np)n-N

Rzecz o nukleazie S1, z podręcznika 'Genomes 2':

Nukleaza S1 - enzym degradujący ssDNA i RNA.
Nie ma wpływu na DNA:DNA, RNA:RNA, DNA:RNA.
Degraduje jednak regiony jednoniciowe (np. nicki) ww. dupleksów.
Jednym słowem, degraduje wszystko, co jednoniciowe.

Z tego, co widzimy Bal31 działa tak samo jako S1, ale potrafi dodatkowo degradować liniowe dupleksy.

5. jaki produkt powstanie, gdy strawimy dna nukleaza ktora tworzy lepkie konce, a pozniej potraktujemy to s1, a nastepnie bal31 Było zadanie na egzaminie, w którym użyto obu enzymów. IMHO wynikiem powinna być mieszanina mononukleotydów (na skutek działania Bal31), a więc nie ma poprawnej odpowiedzi :/ No chyba, że Fermentas się myli, w co wątpię.

Może lepiej na rysunku pokażę, o co mi chodzi i jak może działać Bal31:

stan początkowy:
ATGCGTTC
TACGCAAG

1.
ATGCGTT C
TACGCAAG

2.
ATGCGTT C
TACGCAA G

3.
ATGCGT T C TACGCAA G

4.
ATGCGT T C
TACGCA A G

5...

…

Po wielu krokach dostajemy mieszaninę nukleotydów.

Była poprawna odpowiedź. Bowiem powiedziane zostało, że najpierw działano endonukleazą S1, która odtrawiła lepkie końce, a następnie ten dwuniciowy kompleks był nadtrawiany enzymem Bal31 (działa tak jak egzonukleaza symetrycznie odtrawiająca nukleotydy zarówno od 3' jak i 5' końca DNA). W wyniku tego powstał zatem fragment o końcach tępych.   ]

[ Majuma : tak, przy założeniu, że reakcja jest przeprowadzona do końca. Lecz moim zdaniem należało przyjąć, że reakcja została w jakiś sposób przerwana. Zresztą, był tylko 1 fragment o tępych końcach, co sugerowało takie, a nie inne spojrzenie na to wszystko. ]

3.Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu DNA o końcach  tępych(ja pamietam ze tu bylo dodane ze chodzi o zn. 5')?
a) dATP znakowany P32 w pozycji g
b) ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a
d) [g-P32] -ATP
e) [a-P32]-dATP 

[ to sie robi kinaza polinukleotydowa wiec moze byc jakikolwiek ale zeby byw pozycji GAMMA, bo to kinaza i ona nie wbudowuje do lancucha tylko przenosi tą grupe PO4 co jest najdalej cukru
nie ma chyba roznicy czy to bedzie dATP w pozycji gamma czy ATP bo one i tak maja chyba taka sama energie
wiec d i a ]

[ tyle mam w sowim zeszycku-prosto ze Stryerka :)
--)kinaza polinukleotydowa fosoryluje 5`-koniec=przyłącza 32P do 5`OH przenoszony z ATP'
a gdzie indziej mam napisane ze substratem dla kinazy jest dATP
wiec może rzeczywiścia bedzie zarówno ATP jak i dATP ]

[ Kinaza polinukleotydowa jest enzymem specyficznym dla ATP i tylko dla ATP. Żadne inne entepy albo inne deentepy nie wchodzą w grę.
Co innego Polimeraza DNA - bierze dNTP a także ddNTP. Najwyraźniej dla niej te podstawniki hydroksylowe są bez różnicy, skoro metoda Sangera działa.

Kinaza polinukleotydowa - dowód, że używa tylko ATP.

Pisałem już przecież, że TYLKO ATP i podawałem dowód ze strony firmy o światowej renomie - Fermentas. ]

4.Wektor plazmidowy poddano linearyzacji enzymem EcoRI został uzyty do ligacji z DNA powstałym w wyniku hybrydyzacji dwóch syntetycznych oligonukleotydów. Syntatyczny ds.DNA został tak zaprojektowany iż posiada konce identyczne z końcami wektora(EcoRI).Mieszanine poligacyjna poddano transformacji komórki bakteryjne i wylano je na podłoze zawierajace odpowiedni dla wekrota antybiotyk. Które z podanych ponizej twierdzen sa nieprawdziwe?
a)pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace wektor pozbawiony insertu

- tak bo mogle sie sam zamknac
b )pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace rekombinowany wektor z wbudowanym jednym fragmentem - tak
c)pośród powstałych klonów można było zaobserwowac wektor zawierajacy wiecej niż jeden fragment

- tak bo jak to oligonukleotyd (krotki) i ma takie same wszystkie konce to moze tak byc
d)ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 4ch wiazań fosfodiestrowych

- tak (po 2 wiazana na kazdej nici a to bylo dsDNA)
f) ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 2ch wiazań fosfodiestrowych - nie

[ Mam pytanko odnosnie liczby wiazan po ligacji:[do d i f]. przeciez po ligacji na kazdej nici powstaje po jednym wiazniu i zostaje jeden nick. Wiec ogolnie powstaja 2 wiazania.Tak mowiono na laborce. Ligaza bierze sobie 5`P z insertu, a od strony 3`OH insertu jest nick. Dlatego ja bym dala ze f jest prawdziwe....]

[ Jeżeli insertem jest syntetyczny oligonukleotyd, to wtedy powstaną dwa wiązania, bowiem on nie ma grup fosforanowych na swoich 5' końcach. ]

[ Madzia : No najwyraźniej zostaną. Nie sądzę, by miało to decydujący wpływ na przebieg eksperymentu. Jeżeli DNA z nickami jest stabilne to to tym bardziej (bo tutaj tylko nie ma 2 wiązań fosfodiestrowego, ale struktura jest usztywniona poprzez oddziaływania między zasadami. ]
[ Madziu, moze byc jak najbardziej tak zligowany insert ze bedą dziury czyli nicki i wtedy mamy 2 wiazania fosfodiestrowe. Jezeli sie wczesniej 5` konca nieufosforylowalo w tym sztucznym insercie to nic sie juz z tym nie da zrobic; zostaną 2 nicki. Kinaza przenosi reszte fosforanowa z dATP na 5` koniec. Pa ]

[ Te "dziury" są łatane przez system naprawy DNA gospodarza. Taki problem był na laboratorium podczas wklonowywania EcRDBD do pGEX-2T. W ten sposób można wklonować insert w dwóch orientacjach, z czego jedna tylko ma sens z punktu widzenia ekspresji produktu. Komórki z wektorami z nieprawidłowo wklonowanym insertem należy odrzucić :D ]

[ Oligonukleotydy syntetyczne oczywiście można ufosforylować, bo niczym się one nie różnią od normalnego DNA, ale w treści zadania nie ma słowa o tym, że coś takiego wykonano. Więc większość z nas (wszyscy) się na to złapała ]

5. Dwie próbki E.coli poddano transformacji plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na ampicylinę).Do pierwszej próbko dodano niewielka ilośc pozywki i wylano na podłoze.do drugiej również dodano niewielka ilosc pozywki i wylano na podłoze (najpierw bez antybiotyku) ,inkubowano przez 30 min w 37'C (a potem na antybiotyk):
a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :300 klonów NIE
b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :25 klonów NIE
c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów MOZLIWE, ZAKŁADAJĄC ZE SAME SIE TEZ MOGA ZMUTOWAC, ZWLASZCZA ZE TO MNIEJ NIZ 10% ALE NIE DAM SOBIE ZA TO GLOWY UCIAC
d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka II :300 klonów TO JEST NA PEWNO OK
e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z próbka II :30 klonów NIE
na pierwszej na pewno bedzie mniej niz na 2 bo opornosc na ant. daje produkt genu a nie sam gen wiec komorka musi miec czas na zrobienie tego bialka co daje opornosc

6.Dla elektroforezy nie jest prawdą: (chyba zalezy w jakim żelu )
a) superzwinięte cząsteczki DNA wędrują szybciej niż liniowe - prawda
b) cząsteczki DNA obdarzone ładunkiem ujemnym wędrują do elektrody dodatniej - prawda
c) mieszanina fragmentów Dna jest rozdzielana tym efektywniej im krótsze są fragmenty - prawda
d) małe cząsteczki Dna wedruja najczescoej szybciej niż wieksze [przy załozeniu ze stosunek  ładunku  do masy jest bardzo podobny dla różnych DNA] - prawda
e) cząsteczki o długości 302 i 303 pz mogą być rozdzielane

dla agarozowego nie prawda, bo to do duzych cz. jest i musza miec duza roznice masy, a dla poliakryloamidowego prawda
Lanii (19:47)

7.Enzym restrykcyjny ClaI rozpoznaje sekwencje AT CGAT i trawi wiazanie fosfodiestrowe pomiedzy resztami TiC.enzym restrykcyjny TaqI rozpoznaje sekwencje T CGA:
ClaI : AT CGAT TaqI : T CGA
TAGC TA AGC T
^^ i to sie pewnie rozjedzie
a)ktotsze (chyba wystające raczej) fragmenty DNA generowane przez enzymy sa końcami komplementarnymi

TAK
b) fragmenty powstałe po trawieniu enzymami sa tylko w czesci komplementarne - W CAŁOŚCI KOMPLEMENTARNE

c)ClaI i TagI sa izoschizomerami

IZOKAUDAMERAMI (TWORZĄ TAKIE SAME KOCE LEPKIE, IZOSCHIZOMERY TNA TĘ SAMĄ SEKWENCJĘ ALE NIE KONIECZNIE TAK SAMO)

d)dowolne fragmenty powstałe po trawieniu ClaI i TagI mogą być ligowane i następnie trawione ClaI

NIE bo przy Taq za T lub A moze być cokolwiek a przy Cla musi byc ATCGAT
e)dowolne fragmenty powstałe po ligowaniu produktu trawienia ClaI i TagI mogą być trawione TagI - tak

8.Klon może być użyty jako substrat do radioaktywnego znakowania fragmentu DNA przy  wykorzystaniu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA: (TO JEST BEZ SENSU BO KLON TO NIE SUBSTRAT DLA NICZEGO, ALE DLA POLMERAZY KLENOWA SUBSTRATEM DO ZNAKOWANIA SĄ dNTP ZNAKOWANE W POZ. ALFA - są wbudowywane do łancucha dlatego alfa - najblizej cukru)
a) dATP znakowany P32 w pozycji γ
b) ATP znakowany w pozycji α
c) dGTP znakowany w pozycji α -ok
d) [γ-P32] -ATP
e) [α-P32]-dATP -ok

9.Przy pomocy techniki primer extension mozna mapowac 5' koniec transkryptu.w tym celu mozna tez posłużyc sie techniką wykorzystujaca nukleazę SI.która z podanych ponizej informacji nie ma miejsca przy primer extension?
a)....
b) denaturacja DNA i elektroforeza
c) hybrydyzacja
d) wariant tej techniki może być uzyty do mapowania 3' końca,reakcja przy udziale rekombinowanego  enzymu
e) ....

[ czy ktos mi moze dac odpowiedz na to pytanie
tu tzreba bylo wskazac nieprawidlowa odp z tego co pamietam. I zaznaczylam d bo tak mis ie wydawalo. Inne procesy maja miejsce wiec sa prawdziwe.

Należy zaznaczyć b) i d).
B) dlatego, że 'denaturacja DNA' NIE zachodzi. Zachodzi za to denaturacja dupleksu DNA:RNA. ]

[ A zaznaczyliście, że przy primer extension nie zachodzi także denaturacja DNA (oprócz tego, że nie istnieje jej wariant dla okreslenia 3' konca)? Ja to zaznaczyłem, bo uważam, że DNA nie można utożsamiać z hybrydem DNA-RNA . Ale nie wiem czy to będzie mi uznane ]

10.Zakładajac ze polimeraza Tagi nie traci aktywności ani nie ulega rozkładowi substraty PCR można powiedzieć ze docelowa sekwncja DNA jest powielana po n-cyklach:
a) n2 cyklach
b) 2n cyklach
c) n razy
d) n2n razy
e) 2n-2 razy  -2 ^ (n-2) bo 2 pierwsze są bezuzyteczne

(kurcze. ja juz nie wiem czy w tym PCRze bedzie 2^n

czy jeszce -2. ale chyba zazanczylabym 2^n -2.)

11.Który z podanych wektorów jest najmniej przydatny

 do sekwencjonowania genomu  ssaczego?:
a) YAC
b) BAC
c) wektor bedacy pochodną faga l
d) kosmid
e) wektor plazmidowy (-- ten najmniej przydatny bo najmniej miesci

[ Okazuje się, że chromosomy YAC są równie bezużyteczne. Cytując za 'Genome 2':
The original plan was that the sequencing phase of the Human Genome Project would be based on YAC libraries, because this type of vector can be used with DNA fragments longer than can be handled by any other type of cloning system. This strategy had to be abandoned when it was discovered that some YAC clones contain non-contiguous fragments of DNA. The Project therefore turned its attention to BACs.
Więc nie tylko wektor plazmidowy, ale taże YAC należy zaznaczyć ]

[a co do bezużyteczności i YAC-ów, to masz racje, ale w pytaniu zapewne chodziło o to który z wymienionych jest NAJBARDZIEJ bezuzyteczny czyli jedna odpowiedz prawidłowa, a nie powiesz chyba ze taki plazmid mieszczący pare kbp jest bardziej uzyteczny przy sekwencjonowaniu genomu czlowieka niż YAC do ktorego mozna wsadzic duuuzo wiecej. poza tym jak wywali sie YAC-a to należałoby wywalic wszystko inne poza BAC-ami, nie? a maxymalnie mialy byc 2 prawidlowe]

[ Jeśli chodzi o BAC... to w mądrej książce jest napisane, że jest używany do klonowania fragmentów przynajmniej 300kb
notatek z wykładu: pojemnosci w [kb]: cosmid 40, wektor fagowy 20, ale M13 2, plazmid 8, BAC 300. ]

[ chmm...nie wiem o co chodzi...ale uwaga:
przy pytaniu dot. wektora....: Do tworzenia bibliotek genomowych są używane: YACi BACi i plazmidy (dla małych fragmentów)... pozdro

O tym, że YACi były chybionym pomysłem i nie są już używane też pisałem. Kurczę, czytajcie to forum ze zrozumieniem. Narka! ]

12.spośród podanych temperatur wybrac która z najwiekszym powodzeniem da wydajne otrzymanie produktów PCR  przeprowadzajac dla startera 5' GGTAATCGGTTAGGCTCC3':
a) 56°C
b) 72°C Tm=4*(ilość G +ilość C) +2*(ilość A + ilość T)
c) 59°C temp. hybrydyzacji jest o 1-2 st. niższa do Tm
d) 55°C tu chyba bylo 55 st ale przelicz sobie bo nie wiem czy ta sama sekwencja byla w obu gr.
e) żadna

13.Który z podanych czynników istotny dla jednej z metod pozwalających na otrzymanie cDNA jest głównym winowajcą odpowiedzialnym za brak cDNA inf reprezentującej 5' koniec  transkryptu:

a) 5'AGCAATGG3'
3'TCGT5'
b) 5'AGCAATGG3'
3'ACC5'
c) 5'AGCAATGG3'
3'TCGTTACC5'
d) 5'AGGAA3'
3'TCGTTACC5'
f) nie wiadomo

tu chyba kolezanka pomylila pytanie z odpowiedzią, bo odpowiedz na to pytanie jest w 1), a odpowiedzi są do tego gdzie najpierw starwiono DNA jakims e.r. co daje 5'konce lepkie a potem trawiono Bal31 i S1 wiec konce na pewno beda tepe (Bal31 i S1 sie o to postaraja), ale kij wie czy to nie byl hak i czy nie chodzi o odpowiez ze nie wiadomo bo nie wiadomo jaka byla sekwencja poczatkowa

14.Wektor plazmidowy zawiera gen markerowy odpowiedajacy za odpornośc na erytromycynę(EryR) i gen markerowy odpowiedzialny za opornośc na ampicylinę.Gen AmpR został przecięty enzymem restrykcyjnym a powstały w ten sposób plazmid połączono z fragmentem 1000pz o końcach komplemantarnych do wektora.Które z ponizsych fenotypów maja komórki transformowane:

(insercyjan inaktywacja AmpR w rekombinowanych plazmidach, ja pamietam ze w pytaniu chodzilo nie o transformowane po prostu, tylko transformowane rekombinowanym)

a)niewrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę

(-- to jest ok przy transformowanych wektorem NIErekombinowanym (samoligacja)
b) niewrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
c) wrażliwe na ampicylinę & wrazliwe na erytromycynę
d) wrażliwe na ampicylinę & niewrazliwe na erytromycynę

(-- to jest ok przy transformowanych wektorem rekombinowanym
e)nie wiadomo

15.Kolista cząsteczka Dna posiada n−miejsc restrykcyjnych EcoRI.ile fragmentów DNA  powstanie po całkowitym jej strawieniu?
a) n-1
b) n - OK bo kolista, jak jest liniowa to jest wtedy n+1
c) n+1
d) 2n-1
e) zależy od liczby powtórzeń

16.w analizie Southern fragment sekwencji genu z drożdzy zostal uzyty jako sonda do analizy fragmentow powstałych w wyniku trawiania EcoRI DNA genowowego z jalpa. Na autoradiogramie zaobserwowano zadioaktywne pasmo odpowiedajace fragmentowi DNA o dłudości 4 kb.Oznacza to ze:
a)gen jalpa ma 4kb - NIE, bo nie wiadomo czy to caly gen czy jego fragment
b)gen japla jest taki sam jak gen drozdzy - NIE, mogą miec wspolne sekwencje ale ne musza byc cale takie same
c)gen japla jest obcy (NIE OBCY YLKO OBECNY BYŁO !!!) w preparacie poddanym analizie jesli obecny to ok - TU JESZCZE BYLO NAPISANE ZE GEN CZEGOŚTAM JALPA I TO JEST WAZNE BO GEN KODUJACY TO SAMO BIALKO Z DROZDZY BYL SONDĄ, GENY KODUJACA BIAŁKA Z TEJ SAMEJ RODZINY MAJĄ CZĘSTO PODOBNĄ SEKWENCJĘ (SEKWENCJE WSPOLNE) W ROZNYCH ORGANIZMACH
d)gen japla jest obecny w 4ch kopiech w genomie - bez sensu zupelnie
e) gen japla ma taka sama sekwencje jak gen drożdzy - no niby prawda ZAWIERA taka sama sekwencje ale nie

zaznaczylam tego bo to brzmi tak jakby mial CAŁĄ sekwencję taka samą

Wektor trawiony jest przez EcoR1 (to chyba chodziło o faga lambda) i wstawiany jest do środka fragment 20 kbp:
a) mogą ze sobą ligować
b) dłuższy o 20 kbp
c) dłuższy o 40 kbp
d) łysinka zawiera cały genom wektorów
e) ?

wektor był na pewno substytucyjny i chodzilo o to że nie wejdzie więcej niż 20 kbp więc wektor nie będzie dłuzszy o 40 kbp, najwyzej o 20 kbp, sam genom faga też nie moze być bo one są tak konstruowane ze sie nie zapakuje i takich łysinek nie będzie też, a ostatniej odpowiedzi nie pamiętam

mam pytanie do tego zadania ze starterami, one byly komplementarne do siebie i moim zdaniem nie powinny byc urzyte. wiec odpowiedz to e czyli zadna?? jak Wy zaznaczyliscie?

Pod żadnym pozorem nie mogą być użyte. Nawet mała komplementarność jest wysoce niepożądana.

Zresztą ja obliczyłem temperatury topnienia i wyszły mi bardzo różne. Maksymalnie dopuszcza się 1 st. różnicy w Tm, a to i tak warunkowo.
Hmm, ciekawe czy się nie pomyliłem w obliczeniach. Ktoś z Was liczył Tm też?

temperatury wyszly mi takie same. jesli byly komplementarne to musi wyjsc taka sama temperatura przeciez. pisze jesli bo nie wiem czy byly. kolezanka powiedziala mi po egzaminie. moze ktos to wie??

Chyba nie zauważyłem jakiegoś nukleotydu i mi wyszły różne temp. :P Ale to i tak bez znaczenia. Należało zaznaczyć E) - zostały źle zaprojektowane i nie nadają się do niczego.

Hehe Marvin ;)
No ja też na tym padłem. Profesor zaszalał z tym pytaniem :)
Jedno podchwytliwe 'zmienione' też było przy elektroforezie, że DNA jest niby dodatnie. To już wychwyciłem na szczęście.

W metodzie selekcji przez komplementację transformanty są białe - powstaje tylko niekompletny fragment, powiedzmy LacZ' (bis), B-galaktozydazy. Komórki transformowane 'pustym' wektorem są niebieskie - insert nie rozrywa genu LacZ'. Komórki nietransformowane giną pod wpływem Amp.

Zapamiętaj tyle: kolonie rekombinantów są BIAŁE. Kolonie nierekombinantów (z "pustym" wektorem; bez insertu) są NIEBIESKIE. Komórki nietransformowane (w ogóle bez wektora) giną.

Fagemidy : najprościej rzecz ujmując plazmidy, które zawierają miejsce replikacji faga M13. Stosuje się je dlatego, że do samego faga M13 można wklonować bardzo małe fragmenty, chodzi o zwiększenie długości insertów. Aby mogło dojść do ich pakowania, należy nadkazić hodowlę fagami M13. A ssDNA jaki dzięki temu uzyskujemy możemy użyć np. dla celów sekwencjonowania metodą dideoksy.

Miejsca cos- skrót od cohesive sites , miejsca jednoniciowe w genomie faga lambda, umożliwiają tworzenie kolistej cząsteczki faga lambda, która jest konieczna do integracji z genomem. Poza tym mają duże znaczenie przy replikacji i pakowaniu faga lambda.

Kosmidy : plazmidy, które zawierają miejsca cos. Tym razem zależy nam na tym, żeby zwiększyć pojemność fagów lambda. Tak naprawdę, zauważono, że DNA , które zawiera miejsca cos może zostać pakowane do płaszcza białkowego fagów lambda np. przez pakowanie in vitro.
Wykorzystano tę własność do tworzenia kosmidów- są to małe plazmidy, nie zawierające zbędnych informacji strukturalnych o fagu lambda takich jak genów białek otoczki, genów odpowiedzialnych za cykl lizogeniczny itp. Mają tylko miejsca cos, miejsce restrykcyjne, i marker odporności na antybiotyk. Jeżeli do takiego kosmidu wklonujemy insert, to tylko jeżeli będzie on określonej długości (odpowiednio duży) zostanie upakowany do cząsteczek fagowych. Potem infekujemy takimi 'pseudofagami' komórki bakteryjne - wszystkie klony są rekombinantami, gdyż kosmidy, które uległy np. religacji są zbyt małe aby mogły być upakowane.
Oczywiście nie powstają łysinki ponieważ nie dochodzi do lizy komórek gospodarza.

Chromosomowe DNA :
Lizozym (osłabienie polimerów w ścianie kom)+ EDTA(kompleksuje Mg(2+), zapobiega trawieniu DNA przez DNazy kom) + SDS (detergent, interkaluje błony komórkowe ), należy to odwirować, potem jest ekstrakcja fenolem (strącenie białek), dodanie RNAzy. Następnie trzeba to wszystko zagęścić, wykorzystujemy tu precypitację DNA etanolem.

Plazmidowe DNA :
Analogicznie jak w etapie pierwszym, ale należy działać ostrożniej. Dodaje się Lizozym + EDTA i sacharozę (izotoniczność środowiska). Powstają sferoplasty. Następnie dodawany jest Triton X-100 jako delikatny detergent, by nie uszkodzić plazmidowego DNA, lizat komórki jest odwirowywany. W klarownym roztworze pozostaje plazmidowe DNA.
Należy to DNA chyba jeszcze oczyścić od zwykłego DNA, RNA i białek- można to zrobić przez denaturację alkaliczną lub wirowanie w gradiencie CsCl.

Fagowe DNA :
Fagi są dostępne w płynie hodowlanym z zainfekowanymi bakteriami. Aby uzyskać duże wydajności należy zaindukować przejście fagów do fazy litycznej (lub używa się w ogóle fagów, które są pozbawione genu cI czyli są od razu w fazie litycznej). Wystarczy to odwirować (osad bakteryjny się usuwa). A fagowe DNA się uzyskuje poprzez deproteinizację fagowego kapsydu.

RACE (rapid amplification of cDNA ends)=
Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości sekwencji,gdy znany jest tylko fragment.

1. czego sie uzywa do znakowania dna gdy uzywany jest fragment klenowa.
2. pytanie o nukleaze s1, do czego sluzy, jakie ma wlasciwosci.
3. pytanie pierwsze, dotyczace tego rysunku:
- czy wystepuja polilinkery,
- czy wystepuja dwa rozne markery,
4. podac najlepsza temperature do PCR gdy podana jedna nic,
5. jaki produkt powstanie, gdy strawimy dna nukleaza ktora tworzy lepkie konce, a pozniej potraktujemy to s1, a nastepnie bal31

jak transformowano bakterie pBR322 (chyba) otrzymano 108 kolonii. Ile otrzymamy jak transformujemy bakterie plazmidem z insertem o dl. (chyba) 2000pz.
2) Ktory enzym jest przede wszystkim odp. za utrate fragmentu 5' sekwencji cDNA
3) Ktory z procesow nie dotyczy techniki primer extension

bylo cos jeszcze o transformacji bakterii.
o ile pamietam to cos bylo o szalce o srednicy 12 cm, i do jednych bakterii dodano plazmid z genem opornosci na (bodajze) ampicyline i odrazu wysiano na pozywke zawierajaca tenze antybiotyk, a drugie bakterie zmieszano z plazmidami, inkubowano jakis tam czas i dopiero wysiano na pozywke z tym antybiotykiem

1) jak transformowano bakterie pBR322 otrzymano 108 kolonii. Ile otrzymamy jak transformujemy bakterie plazmidem z insertem o dl. (chyba) 2000pz.
odp. mniej bo im mniejsza cz. DNA tym lepiej bakteria ją łyknie (z insertem jest wiekszy niz sam plazmid)

2) Ktory enzym jest przede wszystkim odp. za utrate fragmentu 5' sekwencji cDNA
ja dalam polimeraza DNA I , bo odwrotna transkryptaza ma starter komplementarny do AAAAAA na 3' koncu mRNA a jak ona juz zrobi ta cz. DNA to pol.DNA I moze miec problem ze starterem

5-------------------------------AAAAAAAAAAA3 mRNA
_________TTTTTT (starter dla odw. transkryptazy)


5---------------------------------AAAAA3 (RNA)
3---------------------------------TTTTT5 (1szy DNA)
^^^ tu jest problem wlasnie (a to robi pol. DNA)

3) Ktory z procesow nie dotyczy techniki primer extension
tu nie pamietam co bylo

Metody otrzymywania ssDNA do sekwencjonowania:
1) klonowanie w plazmidzie a potem denaturacja (np. ciepłem czy alkaliami)
2) klonowanie za pomocą faga M13
3) użycie fagemidów + fagów pomocniczych - zakaża się E. coli jednym i drugim co prowadzi do powstania
ssDNA
4) klonowanie za pomocą techniki PCR

dpp genes kodują białka odpowiedzialne za prawidłowy rozwój osiowy krękowców (ale i nie tylko np u Drosophila melanogaster też) podczas embriogenezy.

Coś na temat wektorów (pochodnych fagowi Lambda):
a dokładnie o wektorach
1) insercyjnych;
2) zastępczych;

EMSA - test zmiany ruchliwości podczas elektroforezy (wywołany np związaniem białka do DNA)

Gene targeting - czyli wyłączanie genów. Po co? Żeby móc określić funkcję nieznanego genu tzn jego produktu!

PCR

Słuchajcie! Mam wątpliwość odnośnie poprawności obliczeń ilości fragmentów o zdefiniowanej długości . Wg. mnie nie było popr. odpowiedzi na to pytanie, gdyż :

Aby obliczyć liczbę powielonych fragmentów możemy zrobić to nie wprost.
Zdefiniujmy najpierw fragment DNA jako parę komplementarnych do siebie łańcuchów DNA o jednakowej długości.
Załóżmy, że na początku jest 1 fragment DNA. Wiadomo, że PCR działa w ten sposób, że w jednym cyklu całkowita liczba fragmentów (wszystkich, niezależnie od długości) się podwaja. Zatem po pierwszym cyklu będzie 2, po drugim 2^2,... po n cyklach całkowita liczba fragmentów wynosi 2^n. Fragmentów o pośredniej długości (między dł. fragmentu początkowego a dł. fragmentu docelowego) będzie więc n ( w każdym cyklu powstaje dokładnie 1 nowy fragment o pośredniej długości- powstaje on z pierwotnej matrycy! ). Po n cyklach PCR jest ciągle zawsze tylko 1 fragment o początkowej długości.
Wobec tego zdefiniowanych fragmentów po n cyklach jest 2^n-n-1.

Przyznacie, że to nie to samo co 2^(n-2).
To obliczenie, które sugeruje Lanii, milcząco przyjmuje założenie, że dopiero po drugim cyklu pojawia się produkt zdefiniowany. On potem zostaje powielony w n-2 cyklach co daje wartość 2^(n-2). No dobrze, ale w tym momencie nie doliczamy tych fragmentów, które powstają na każdym etapie z fragmentów o długości pośredniej.
Poprawne obliczenie jest definiuje następująca funkcja rekurencyjna :
ilosc(n+1) = ilosc(n)*2+n

Fakt, że należy dodać n bierze się stąd, że na każdym etapie powstaje z n fragmentów pośrednich dokładnie n fragmentów o zdefiniowanej długości.

Wobec tego możemy tę funkcję rozwinąć w ciąg :
(((1*2+2)*2+3)*2+4)...
Gdzie liczba 1*2+2 odpowiada n=3 cyklom.
Stąd mamy po n=5 cyklach (po obliczeniu wyrażenia w nawiasie) :
(4*2+3)*2+4=11*2+4=26
Podstawmy teraz n=5 do wzoru : 2^n-n-1=2^5-5-1=26
Widać zatem, że wzór ten jest poprawny.
PS. Nie jest to oczywiście dowód w sensie stricte matematycznym, ale mnie to przekonuje.

Nie chce mi się pisać odpowiedniego skryptu, bo interpreter Pythona odmówił mi posłuszeństa, ale na egzaminie zaznaczę 2^n (a nie 2^(n-2) jak na 1-szym terminie) i pójdę na wyniki z czerwoną księgą :D

Dokładny wzór na ilość produktu po PCR to:
N=N'*((1+Y)^n)
gdzie N' - to ilość cząsteczek matrycy, n - ilość cykli, Y - efektywność polimerazy (od 0 do 1)
(miałam to na laborce)
Zakładając, że mieliśmy 1 matrycę oraz wiedząc z treści, że polimeraza nie traci aktywności (czyli efektywność=1), wzór upraszcza się do 2^n! Zresztą to jedyny wzór, jaki Endrju podał na wykładzie - więc nad czym tak debatować.

jeśli chodzi o ten spór z produktami PCR to na bank jest to odpowiedź 2^(n-2) ponieważ w pytaniu chodziło o ZDEFINIOWANEJ długości odcinki. Potwierdzenie możecie znaleźć w którymś z moich linków który tu wisi!

5'---wektor----wiązanie----insert----wiązanie---wektor----3'
3'---wekto r----wiązanie----insert----wiązanie---wektor----5'
czaisz?

bo rozumiem ze mozna sobie inaczej liczyc cząsteczki po pcrze (chociaż tych o dł. od jednego primera do drugiego na pweno bedzie 2^(n-2)), ale tu to juz nie przesadzaj :)

Nicze : Zauważ, że jak podzielisz dane w Twojej tabelce przez 2 to otrzymasz dokładnie wyniki, zgodnie podanym przeze mnie wzorem : 2^n-n-1.
Oni bowiem podają całkowitą liczbę nici w sekwencjach docelowych, a powyższy wzór liczbę sekwencji docelowych (traktowanych jako dwuniciowe kompleksy).
Poza tym podpisy pod tabelką są nieprecyzyjne :
jest napisane np. double stranded target molecules, a tak naprawdę liczby odpowiadają ilościom pojedynczych nici sekwencji docelowych (a nie, jak sugeruje opis sekwencjom dwuniciowym).

Czyli wszystko się zgadza. Obowiązuje wzór 2^n-n-1.

kasiamal : Podany przez Ciebie wzór jest OK, dla dużej ilości cykli. Wtedy podany przeze mnie wzór przechodzi w Twój wzór, gdyż dla dużych n 2^n >> n+1.
Dla małych n się nie sprawdza. Mówię, sprawdź sobie dla n=3 :)
W wyprowadzeniu wzoru 2^n-n-1 również zakłada się efektywność polimerazy jako Y=1.

KOLEJNY

Gr. C

1.Charakterystyka wektora
a) wektor może być użyty do przygotowania biblioteki genomowej
b) zawiera geny markerowe
c) może replikować w komórkach bakteryjnych w sposób charakterystyczny dla plazmidów
d) zawiera COS -pakowanie do wektora
e) zawiera polilinker(sekwencje wielokrotnego klonowania)

2.Nukleaza SI
a) może być użyta do lokalizacji sekwencji intronowych
b) może degradować DNA i RNA i powstają produkty posiadające sekwencje P-5'
c) DNA:DNA, RNA:RNA i DNA:RNA są odporne na działanie tego enzymu
b) jest egzonukleazą
e) używana do odtrawiania fragmentów kw.nukleinowych ,które maja forme pojedynczej nici
3.Który ze zwiazków może byz użyty jako substrat do enzymatycznego znakowania izotopem P32 fragmentu DNA o końcach tępych?
a) dATP znakowany P32 w pozycji g
b) ATP znakowany w pozycji a
c) dGTP znakowany w pozycji a
d) [g-P32] -ATP
e) [a-P32]-dATP
 
4.Wektor plazmidowy poddano linearyzacji enzymem EcoRI został uzyty do ligacji z DNA powstałym w wyniku hybrydyzacji dwóch syntetycznych oligonukleotydów. Syntatyczny ds.DNA  został tak zaprojektowany iż posiada końce identyczne z końcami wektora(EcoRI). Mieszaninę poligacyjną poddano transformacji komórki bakteryjne i wylano je na podłoże  zawierające odpowiedni dla wekrota antybiotyk. Które z podanych poniżej twierdzeń są  nieprawdziwe?
a) pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace wektor pozbawiony insertu
b) pośród powstałych klonów można było zaobserwować klony zawierajace rekombinowany wektor z  wbudowanym jednym fragmentem
c) pośród powstałych klonów można było zaobserwowac wektor zawierajacy wiecej niż jeden fragment
d) ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 4ch wiazań fosfodiestrowych
f )  ligacji jednego fragmentu i czasteczki wektora towarzyszy powstanie 2ch wiazań fosfodiestrowych 

5. Dwie próbki E.coli poddano transformacji plazmidem zawierajacym gen AmpR (opornośc na ampicylinę).Do pierwszej próbko dodano niewielka ilośc pozywki i wylano na podłoze.do drugiej również dodano niewielka ilosc pozywki i wylano na podłoze,inkubowano przez 30 min  w 37'C.:
a) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
b) szalka z próbką I:300 klonów i szalka z próbka II :25 klonów
c) szalka z próbką I:30 klonów i szalka z próbka II :400 klonów
d) szalka z próbką I:0 klonów i szalka z próbka II :300 klonów
e) szalka z próbką I:3000 klonów i szalka z próbka II :30 klonów

6.Dla elektroforezy nie jest prawdą:

a) superzwinięte cząsteczki DNA wędrują szybciej niż liniowe
b) cząsteczki DNA obdarzone ładunkiem ujemnym wędrują do elektrody dodatniej
c) mieszanina fragmentów Dna jest rozdzielana tym efektywniej im krótsze są fragmenty
d) małe cząsteczki Dna wedruja najczescoej szybciej niż wieksze [przy załozeniu ze stosunek  ładunku  do masy jest bardzo podobny dla różnych DNA
e) cząsteczki o długości 302 i 303 pz mogą być rozdzielane

7.Enzym restrykcyjny ClaI rozpoznaje sekwencje ATŻCGAT i trawi wiazanie fosfodiestrowe pomiedzy resztami TiC.enzym restrykcyjny TagI rozpoznaje sekwencje TŻCGA:
a) krótsze fragmenty DNA generowane przez enzym sa końcami komplementarnymi
b) fragmenty powstałe po trawieniu enzymami sa tylko w czesci komplementarne
c) ClaI i TagI sa izoschizomerami
d) dowolne fragmenty powstałe po trawieniu ClaI i TagI mogą być ligowane i następnie trawione ClaI
e) dowolne fragmenty powstałe po ligowaniu produktu trawienia ClaI i TagI mogą być trawione TagI

8.Klon może być użyty jako substrat do radioaktywnego znakowania fragmentu DNA przy  wykorzystaniu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA:
a) dATP znakowany P32 w pozycji γ
b) ATP znakowany w pozycji α
c) dGTP znakowany w pozycji α
d) [γ-P32] -ATP
e) [α-P32]-dATP

9.Przy pomocy techniki primer extension mozna mapowac 5' koniec transkryptu.w tym celu mozna tez posłużyc sie techniką wykorzystujaca nukleazę SI.która z podanych ponizej informacji nie ma miejsca przy primer extension?
a)....
b) denaturacja DNA i elektroforeza
c) hybrydyzacja
d) wariant tej techniki może być uzyty do mapowania 3' końca,reakcja przy udziale rekombinowanego  enzymu
e) ....

10.Zakładajac ze polimeraza Tagi nie traci aktywności ani nie ulega rozkładowi substraty PCR można powiedzieć ze docelowa sekwncja DNA jest powielana po n-cyklach:
a) n2 cyklach
b) 2n cyklach
c) n razy
d) n2n razy
e) 2n-2 razy
 
11.Który z podanych wektorów jest najmniej przydatny do sekwencjonowania genomu  ssaczego?:
a) YAC
b) BAC
c) wektor bedacy pochodną faga l
d) kosmid
e) wektor plazmidowy

12.spośród podanych temperatur wybrac która z najwiekszym powodzeniem da wydajne otrzymanie produktów PCR przeprowadzajac dla startera 5' GGTAATCGGTTAGGCTCC3':
a) 56°C
b) 72°C
c) 59°C
d) 55°C
e) żadna

13.Który z podanych czynników istotny dla jednej z metod pozwalających na otrzymanie cDNA jest głównym winowajcą odpowiedzialnym za brak cDNA inf reprezentującej 5' koniec  transkryptu:
a) 5'AGCAATGG3'
3'TCGT5'
b) 5'AGCAATGG3'
3'ACC5'
c) 5'AGCAATGG3'
3'TCGTTACC5'
d) 5'AGGAA3'
3'TCGTTACC5'
f) nie wiadomo

14.Wektor plazmidowy zawiera gen markerowy odpowiadający za odporność na erytromycynę (EryR) i gen markerowy odpowiedzialny za oporność na ampicylinę.Gen AmpR został przecięty enzymem restrykcyjnym a powstały w ten sposób plazmid  połączono z fragmentem 1000pz o  końcach komplementarnych do wektora.Które z poniższych fenotypów maja komórki transformowane:
a) niewrażliwe na ampicylinę & niewrażliwe na erytromycynę
b) niewrażliwe na ampicylinę & wrażliwe na erytromycynę
c) wrażliwe na ampicylinę & wrażliwe na erytromycynę
d) wrażliwe na ampicylinę & niewrażliwe na erytromycynę
e) nie wiadomo

15.Kolista cząsteczka Dna posiada n−miejsc restrykcyjnych EcoRI.ile fragmentów DNA  powstanie po całkowitym jej strawieniu?
a) n-1
b) n
c) n+1
d) 2n-1
e) zależy od liczby powtórzeń

16.w analizie Southern fragment sekwencji genu z drożdży został użyty jako sonda do analizy  fragmentów powstałych w wyniku trawienia EcoRI DNA genowowego z jalpa. Na  autoradiogramie zaobserwowano radioaktywne pasmo odpowiadające fragmentowi DNA o  dłudości 4 kb. Oznacza to ze:
a) gen jalpa ma 4kb
b) gen japla jest taki jak gen drozdzy
c) gen japla jest obcy w preparacie poddanym analizie
d) gen japla jest obecny w 4ch kopiech w genomie
e) gen japla ma taka sama sekwencje jak gen drożdzy

Dokładny wzór na ilość produktu po PCR to:
N=N'*((1+Y)^n)
gdzie N' - to ilość cząsteczek matrycy n - ilość cykli
Y - efektywność polimerazy (od 0 do 1)
(miałam to na laborce)
Zakładając, że mieliśmy 1 matrycę oraz wiedząc z treści, że polimeraza nie traci aktywności (czyli efektywność=1), wzór upraszcza się do 2^n!

---