Zestaw 8

1. Co to są linie DH, jak powstają, do czego są wykorzystywane.

DH - linia podwojonych haploidów

Homozygotyczne linie rodzicielskie

niespokrewnione, często trzeba dobierać odmiany z odległych miejsc

P1 x P2

.

.

F1

heterozygoty --->zróżnicowane genetycznie

gamety

.

.

Z gamet otrzymujemy zróżnicowane genetycznie haploidy

.

.

Zróżnicowane genetycznie podwójne haploidy (DH) homozygoty

Zastosowaniem haploidów jest otrzymywanie z nich podwojonych haploidów, w wyniku kolchicynowania lub działania innymi mutagenami podwajającymi materiał genetyczny. Podwojone haploidy zawierają w komórkach somatycznych diploidalną liczbę chromosomów, ale od zwykłych diploidów istotnie się różnią - są homozygotyczne pod względem wszystkich występujących w nich genów (bo powstają w wyniku wiernej replikacji genomu haploidalnego).

Skoro każdy gen występuje w nich w dwóch identycznych kopiach, to poddane rozmnażaniu generatywnemu (przez samozapylenie), nie wykazują rozszczepienia cech i wiernie przekazują swoje właściwości potomstwu. Linie podwojonych haploidów wykazują więc właściwości typowe dla ulubionych przez hodowców czystych linii, a przy tym dają się otrzymać w czasie znacznie krótszym, niż w metodzie chowu wsobnego (wielokrotnie powtarzanego samozapylenia).

Populacja podwojonych haploidów (różnych linii) wykazuje podobny zakres zmienności fenotypowej jak populacja diploidów, z których je wyprowadzono, jest jednak znacznie mniej zróżnicowana pod względem genotypowym (odpadają wszystkie heterozygoty). Łatwiej jest więc znaleźć interesujący, rzadki genotyp w populacji podwojonych haploidów niż (zwykłych) diploidów, bo jego częstość wśród podwojonych haploidów musi być większa.

Dzięki wykorzystaniu podwojonych haploidów w hodowli roślin, czas niezbędny do otrzymania nowej odmiany uległ skróceniu, bo skrócił się okres wyprowadzania czystych linii (można to obecnie osiągnąć w ciągu roku). Pozostaje jednak konieczność przeprowadzenia agrobotanicznej oceny wyselekcjonowanych form i to w kilku pokoleniach, w związku z tym cykl hodowany nadal trwa kilka lat (np. 4), lecz nie około dziesięciu, jak to jest przy stosowaniu metod bardziej tradycyjnych.

2. Populację mapującą stanowi 1200 roślin. Wśród nich jest 302 rośliny odporne (O) i 988 wrażliwych (W).Marker DNA  znajduje się u 8 roślin O i jest go brak u 8 roślin W. Jak determinowana jest analizowana cecha. W jakiej odległości od genu i z którą cechą sprzężony jest prążek(marker )DNA

Jak determinowana jest analizowana cecha?

Analizowana cecha - odporność

988 wrażliwych W + 302 odporne O = 1200

Stosunek W do O wynosi 3:1 (dziedziczenie całkowite/pełne)

W jakiej odległości od genu i z którą cechą sprzężony jest prążek(marker )DNA?

Prążek DNA sprzężony jest z cechą determinująca odporność.

8+8=16

1200 - populacja mapująca

16/1200*100%=1,3 ???

Zestaw 2

1. Wymień zasadnicze cechy markerów molekularnych DNA.

• monogamiczne

• posiadająca przeciwstawne formy

• przekazywane potomstwu bez zmian

• gen ją kodujący nie może mieć efektu plejotropowego

• nie są modyfikowane przez środowisko

• bez epistazy i współdziałania genów

• dziedziczą się kodominacyjnie

2. Populacje mapującą stanowi 320 roślin. Wśród nich są 82 rośliny odporne (O) i 238 wrażliwych (W). Jak determinowana jest analizowana cecha. W jakiej odległości od genu z którym jest sprzężony jest prążek (marker DNA)?

3. Przedstaw kompletny schemat procedury NILs (otrzymywanie linii i generowanie markerów)

A wrażliwe x B odporne

F1

BC1: (AxB)x A

BC2: [(AxB)x A]x A

.

.

.

BC6: Linie bliskoizogeniczne

Osobniki różnią się wyłącznie odpornością

wrażliwe (rr) odporne(RR)

rośliny identyczne fenotypowo

pozyskujemy DNA

wzory prążkowe

RAPD

wrażliwe odporne

- - - - - -

- - - - - -

- - -

- - - - - -

- - - - - -

1. Wymień z jakich materiałów roślinnych (populacji) wykorzystywane jest DNA do poszukiwania markerów molekularnych cechy odporności na patogeny.

• Zróżnicowane pokolenie BC1

• Pokolenie F2

• RiLs Rekombinowane linie wsobne

• Zróżnicowane genetycznie podwójne haploidy (DH)? ( tego ostatniego nie jestem pewna)

2. Wymień cechy jakimi powinny charakteryzować się mapy genetyczne, aby były w pełni użyteczne i informatywne.

1. Wymień jakie materiały roślinne (populacje) wykorzystywane są do sporządzania map genetycznych.

BC1,F2, RiLs(rekombinowane linie wsobne) i DH (podwojone haploidy)

2. Populacje mapującą stanowi 600 roślin. Wśród nich są 152 rośliny odporne (O) i 448 wrażliwych (W). Marker DNA znajduje się u 4 roślin O i jest go brak u roślin W. Jak determinowana jest analizowana cecha? W jakiej odległości od genu i z którą cechą sprzężony jest prążek (marker) DNA?

6+6=12

12/600*100%=2cM

152/448= 1:3 -mendlowskie (?)

1. Wymień jakie materiały roślinne i(populacje) wykorzystuje się do sporządzania map genetycznych.

2. Przedstaw kompletny schemat procedury BSA (otrzymywanie populacji i generowanie markerów).

A wrażliwy x B odporny

F1

F2

Segregująca populacja; Osobniki różnią się wieloma cechami, m.in odpornością.

Rośliny wrażliwe Rośliny odporne

Z tych dwóch grup roślin pobierane jest DNA

DNA zbiorcze roślin wrażliwych DNA zbiorcze roślin odpornych

Wzór prążkowy RAPD

Najczęściej wykorzystywane systemy markerowe w BSA - RFLP i SSR ze względu na ich kodominacyjny charakter umożliwiający identyfikację najbardziej wartościowych rekombinantow wykorzystywanych w hodowli

MARKERY MOLEKULARNE

1) Wymień etapy reakcji PCR:

PCR => do maszyny => próbkę wyjmujemy i prowadzimy elektroferezę w żelu agarowym z DNA => wyciągamy żel z DNA => kładziemy na lampę UV => obserwujemy prążki DNA => robimy zdjęcie

Namnożenie PCR:

95-98^oC - rozdwojenie DNA na 1-3`(denaturacja, odwracalna)

60^oC - przyłączenie starterów

72^oC - przyłącza się polimeraza i dobudowywuje (synteza) 2-gą nić DNA do tej rozplątanej

Standardowy program reakcji:

1- wstępna denaturacja 2-5, 10 min 93-95^oC

2- denaturacja 30-60 sek. 93-95^oC}

3- przyłączanie starterów 30-60 sek. 37-65^oC} 25 - 35 x

4- wydłużanie matrycy 60+30 sek.(500pz) 72^oC }

5- końcowe wydłużanie 2-10 min 72^oC

6- schładzanie b/o 4^oC

Przyrost liczby kopii matrycy: 2ⁿ [n- liczba cykli]

7- obserwacja produktów amplifikacji na żelu agarozowym lub poliakryamidowym.

2) Jak na emigrację DNA w żelu wpływa koncentracja agarowy?

=> dłuższe cząsteczki wędrują wolno

=> krótsze cząsteczki wędrują szybciej

3) Który z poznanych typów markerów bazuje na reakcji PCR, a który na trawieniu restrykcyjnym?

RFLP: restrykcja

RAPD: PCR

SSR: PCR

AFLP: restrykcja+PCR

4) Czy 1 cM to stała odległość fizyczna? Dlaczego?

Jednostka mapowa nie równa się 1 stałej odległości fizycznej, ponieważ crossing over zachodzi z różną częstością:

• w różnych rejonach w obrębie chromosomów

telomery - c/o zachodzi częściej

centromery - c/o zachodzi rzadziej

• w różnym czasie i organach na chromosomach

• 1cM=1% rekombinacji crossing-over

5) Które markery molekularne rozpoznają kodominację, a które dominację?

kodominacja- RFLP, SSR
dominacja- AFLP, RAPD

6) W jakim celu stosuje się żele poliakrylamidowe? Wskaż metody markerowania, które te żele wykorzystują.:

SSR i AFLP

Są to żele wysokorozdzielcze, dają nam dokładniejsze wyniki niż żele agarozowe.

7) Wymień poznane metody systemów markerowych na ćwiczeniach i przypi…, w której uwidacznia się polimorfizm DNA?

PCR: RAPD i SSR

Restrykcja: RFLP

Restr.+PCR: AFLP

Niw wiem o co chodzi z tym polimorfizme? Ale to chyba będą te które dają możliwość analizy wielu loci: RFPL (wysoce polimorficzny), RAPD (3-10), SSR (?), AFLP (do 100 miejsc w genomie)

Pod pojęciem polimorfizmu rozumie się całokształt rożnic występujących między poszczegolnymi gatunkami, odmianami, osobnikami, a także komorkami organizmu, ktore potencjalnie mogą być ujawniane za pomocą odpowiednio dobranego systemu markerowego.

System markerowy o wysokiej użyteczności powinien nie tylko ujawniać szeroki

zakres zmienności analizowanej cechy, ale także nie powinien ulegać wpływowi czynnikow

środowiskowych.

Użyteczność systemu analiz uzależniona jest rownież od wysokiej

powtarzalności wynikow, łatwości detekcji oraz możliwości szczegołowego poznania

mechanizmow warunkujących

8) Który z poznanych typów markerów bazuje na reakcji PCR?

RAPD, SSR

(restr.+PCR: AFLP)

9) Co wiesz o sekwencjach mikrosatelitarnych DNA.

proste, tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronikletydowych sekwencji zwanych motywami, są to odcinki niekodujące, duże zróżnicowanie ilości powtórzeń motywu podstawowego, dzięki temu duży polimorfizm, równoniernie rozsiane w genomie, wykorzystywane w SSR

10) Czy amplifikacja DNA pozaustrojowo jest możliwa i dlaczego?

11) Wymień w punktach i krótko opisz etapy reakcji RFLP:

1-izolacja DNA

2-trawienie DNA enzymem restrykcyjnym (nukleaza, enzym EcoRI)

3-frakcjonowanie DNA (ż. agarozowy)

4-transfer DNA na membranę (przeniesienie prążków z żelu na membranę)

5-detekcja (sondą do hybrydyzacji jest wyznakowana cząsteczka DNA o sekwencji komplementarnej do matrycy DNA; hybrydyzacja membrany z sondą; odpłukanie resztek sondy, która nie związała się z DNA na membranie)

12) Jaka jest relacja pomiędzy mapą fizyczną a genetyczną?

Mapy fizyczne różnią się od map genetycznych tym, że ich konstrukcja jest oparta na długości fragmentów restrykcyjnych i sekwencjonowaniu DNA; skala map fizycznych to liczba par zasad dzielących geny. Mapy genetyczne porządkują geny w sposób orientacyjny, podając odległości w oparciu o przybliżoną miarę frakcji rekombinacji.

a) Genetyczne [cM]:

=> odległość genetyczna między genami (markerami) na chromosomie (grupa sprzężeń), wyrażana częstością zachodzenia rekombinacji mejotycznej między nimi.

Co to jest mapa genetyczna?

Mapy genetyczne wskazują na względne położenie specyficznych markerów wzdłuż chromosomu - informacja na temat struktury, funkcji i ewolucji genomu.

b) Fizyczne [pz]:

=> fizyczna odległość między markerami wyrażona w tysiącach lub w milionach par zasad.

Co to jest mapa fizyczna?

=> Mapa fizyczna mierzona jest w parach zasad (pz) i określa odległość między 2 punktami

=> Dwa markery mogą być genetycznie bardzo blisko siebie, np. mały współczynnik rekombinacji między nimi, ale jak daleko fizycznie się od siebie znajdują? - tysiące pz (zależy od gatunku)

=> 1 cM u różnych gat. ma różną długość

• rzodkiewnik 139 kpz = 1 cM

• pomidor 510

• kukurydza 2140

=>Mapując ważne jest ustalenie czy w gatunku badanym między markerami genetycznymi 1cM to:

• 1kpz (1.000pz)

• 1Mpz (1.000.000 pz)

13) Wyjaśnij czym jest starter arbitralny i zakotwiczający, podaj metody w której…

Arbitralny: RAPD (nie wszystkie zasady muszą hybrydyzować do komplementarnych (nie

jest w 100% komplementarny)

Zakotwiczający: AFLP (selektywny)

14) W jakim celu stosuje się marker zakotwiczający? Wskaz metodę, w której się go wykorzystuje. => AFLP

Cel: Daje nam możliwość analizowania wielu loci, ale jast czasochłonny, a wyniki nie zawsze są powtarzalne.

15) Która ze znanych Ci map jest właściwa do analizy sprzężeń genów i …(pewnie: odległości genet. między nimi/rekomb. mejotycznej między nimi)

to chyba ogólnie chodzi o mapy genetyczne

16) Wskaż parę, która będzie miała zbliżoną mapę genetyczną i parę która będzie miała zbliżoną mapę fizyczną:

1. burak, melon, truskawka, ziemniak, pomidor, dynia

2. fasola, ziemniak, truskawka, wiśnia pomidor, ogórek, banan

3. burak, melon, truskawka, wiśnia, pomidor, dynia, banan, rzodkiewka

Wyjaśnij dlaczego.

Spokrewnione gatunki zazwyczaj mają podobną zawartość i lokalizację genów i markerów.

17) Jak pobrać materiał do izolacji DNA?

18) Co to jest elektroforeza?

Ruch jonów i makromolekuł obdarzonych ładunkiem elektrycznym (DNA, RNA, białko „-„) poprzez  żel w wyniku przyłożonego napięcia.

19) W jakim celu stosuje się ligację adapterów. Wskaż metodę w której znajduje się ten etap. => AFLP

Cel: Ligacja ma za zadanie połączenie dwóch fragmentów lub końców nici DNA za pomocą ligazy. Adaptor to w ogólnym rozumieniu białko które nie ma aktywności enzymatycznej. So what?!

Prawdopodobnie ma za zadanie rozdział materiału genetycznego na homozygoty recesywne i dominujące oraz heterozygoty (AA,aa,Aa)

20) Na jakim żelu należałoby rozdzielić fragmenty DNA dł. 200-500pz?

Na żelu agarozowym, który służy do rozdziału długich cząsteczek DNA.

21) W jakim celu stosuje się sondy do hybrydyzacji? Ws… wykorzystuje.

Do wyznakowania cząsteczek DNA o sekwencji komplementarnej do matrycy DNA.

RFLP (AFLP?)

22) W jakim celu tworzymy mapy fizyczne i genetyczne?

W celu schematycznego odwzorowania genomu organizmu lub elementu genetycznego (np. plazmidu) przedstawiającego wzajemne położenie poszczególnych genów i innych elementów genetycznych.

Mapowanie to określenie kolejności (ustalenie położenia) specyficznych sekwencji - markerów i genów na chromosomach i ustalenie odległości między nimi (genetyczne - cM (odległości na tej mapie są względne); fizyczne - pz)

23)Do jakich typów markerów poznanych na zajęciach stosuję się jakie żele?

RFLP i RAPD => agarozowe

SSR i AFLP => poliakrylamidowe

24)Jakie typy markerów poznaliśmy na zajęciach: wymień i napisz sposoby ich generacji.

Markery genetyczne:

-morfologiczne

-molekularne:

Markery DNA(restrykcja, restrykcja +PCR, PCR)

Markery białkowe (izozymy,allozymy) Jednakże markery izoenzymatyczne nie sprawdziły się w badaniach nad całościową charakterystyką genomów roślinnych oraz w konstruowaniu map genetycznych. Wynika to z faktu małego polimorfizmu białek enzymatycznych oraz konieczności opracowywania osobno dla każdego enzymu metodyki rozdziału, barwienia lub ekstrakcji.

25)Startery arbitralne - w jakiej technice się je używa i czym są.

26)W jakim celu i w jakiej metodzie używamy sond?

Polimorficzna sonda używana jest w metodzie RFLP.

Hybrydyzacja DNA z radioaktywną sondą

Fragmenty DNA, po wyznakowaniu radioaktywnymi atomami jako sondy do wykrywania pokrewnych sekwencji w DNA innych komórek.

Inkubacja filtru, na którym jest DNA z radioaktywną sondą, umożliwia związanie się sondy z fragmentami zawierającymi sekwencje do niej komplementarne i uwidocznienie ich położenia.

---