1. Metoda barwienia Grama:

• na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść bakterie (opalić ezę!) i po ewentualnym dodaniu płynu fizjologicznego (dodać tylko z kolonii na pożywce stałej!) wykonać rozmaz

• do całkowitego wyschnięcia, utrwalić (3x nad palnikiem)

• fioletu krystalicznego (1-2 min), zlać wodą

• zalać preparat płynem Jugola (1-2 min), zlać wodą

• odbarwić całość w etanolu przez ok. 15-30 sek.,spłukać preparat wodą

• dobarwić fuksyną zasadową przez ok. 15-30 sekund

• dobrze spłukać preparat wodą i oglądać pod mikroskopem (olejek immersyjny, 100x)

Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram-ujemne, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

Barwienie metodą Ziehla-Neelsena (diagnostyka gruźlicy)

1. Na utrwalony preparat nalewa się karbolowy roztwór fuksyny i podgrzewa szkiełko trzykrotnie

nad płomieniem palnika, nie dopuszczając do wrzenia.

2. Po ostudzeniu preparat spłukuje się dokładnie wodą i nakrapla odbarwiacz (kwaśny alkohol

etylowy) na 1 minutę.

3. Po odbarwieniu preparat spłukuje się wodą i dobarwia błękitem metylenowym przez 1 minutę.

4. Preparat spłukuje się wodą, suszy w temperaturze pokojowej i ogląda w mikroskopie.

W wyniku takiego postępowania bakterie kwasooporne przybierają kolor czerwony pochodzący od fuksyny (nie odbarwiają się one bowiem w kwaśnym alkoholu). Natomiast bakterie niekwasooporne są wrażliwe na działanie kwaśnego alkoholu, odbarwiają się w nim z fuksyny i mają kolor niebieski od błękitu metylenowego.

Barwienie preparatów metodą Neissera (C. diphteriae charakterystyczne dla niego ziarnistości wolutynowe Ernsta Babesa, wybarwiające się na fioletowo, same komórki są żółte)

1. Barwnik I (błękit metylenowy) i barwnik II (fiolet krystaliczny) mieszamy objętościowo

w stosunku 2:1.

2. Zalewany utrwalony preparat mieszaniną barwników na 10 minut.

3. Spłukujemy wodą.

4. Dobarwiamy chryzoidyną przez 30 sekund.

5. Zlewamy barwnik. NIE SPŁUKUJEMY!!!

Barwienie Trujillo - barwienie spor zielenią malachitową (C. tetani)

1. Nalać zieleń malachitową

2. Podgrzać do trzech par

3. Zostawić do ostygnięcia, spłukać wodą

4. Dobarwić fuksyną

Barwienie tuszem chińskim na otoczki - negatywowe (Cryptococcus neoformans)

1. nakroplić tusz, przykryć szkiełkiem i oglądać

Barwienie pozytywowo - negatywowe (C. perfringens)

1. najpierw Gram

2. potem tusz

Posiewy

1. posiew redukcyjny (metoda ta polega na zanurzeniu ezy w probówce z drobnoustrojami, naniesieniu pobranego materiału na podłoże agarowe umieszczone zwykle na szalce Petriego. Sposób naniesienia nie jest obojętny. Posiew należy zacząć wykonywać od górnego brzegu szalki i ruchem esowatym nanosić drobnoustroje kierując się do środka szalki, pozostawiając jednak znaczną część powierzchni wolną. Po wykonaniu tego zabiegu należy koniecznie ezę wyżarzyć w płomieniu palnika, obrócić szalkę o 45° w lewo i wykonać podobną operację na drugiej połowie szalki, zahaczając raz lub dwa o starszy posiew. Następnie znowu wyżarzyć ezę, obrócić szalkę o 45° i ruchem esowatym wykonać ostatnią część posiewu redukcyjnego. Po inkubacji, w miejscach z ostatnich etapów posiewu redukcyjnego powstaną osobne kolonie bakterii!!!)

2. itd.

Podłoża

1. Płynne

1. BHI - wzbogacone o wyciąg z serc wołowych i hydrolizat mózgów cielęcych

2. Schedlera - drobnoustroje tlenowe rosną na powierzchni podłoża płynnego; względne beztlenowce powodują zmętnienie całej pożywki, a beztlenowce tworzą osad na dnie próbówki

3. Bulion cukrowy (do sprawdzenia skuteczności sterylizacji)

Podłoże płynne przed inokulacją (zakażenie bakteriami) - regeneracja: (10-20min we wrzącej H2O, żeby usunąć O2)

2. Stałe

1. Agar zwykły (Muller-Hintona, do sprawdzania lekowrażliwości, nie zawiera peptonu, więc nie hamuje stref oporności)

2. Agar krwawy (5% krew barania, rosną prawie wszystkie drobnoustroje), C. poerfringens podwójna hemoliza

3. McConkeya - wybiórcze dla pałeczek G(-) z laktozą, laktozo(+) - rozkładają laktozę, kolonie różowe np. E. coli, Klebsiella, Enterobacter, laktozo(-) - nie rozkładają laktozy, kolonie bezbarwne np. Proteus spp, Salmonella, Shigella (oprócz agona i typhicum), Pseudomonas

4. Chapmana - wybiórczo-różnicujące dla gronkowców (zawiera mannitol), mannitolo(+) - gronkowiec rozkłada mannitol, kolonie żółte np. S. aureus, mannitolo(-) - kolonie szaro-białe, bezbarwne np. S. epidermidis

5. Podłoże z eskuliną (CocoGel) - dla enterokoków, wyjściowo bezbarwne, jeśli rosną enterokoki - czarne kolonie i zaczernione podłoże

6. Sabourauda - dla drożdżaków np. Candida albicans

7. Columbia agar - praktycznie wszystko rośnie

8. KULB - kanamycyna + wankomycyna do izolacji G(-)

9. BBE - zółć (hamuje wzrost innych bakt., stymuluje wzrost Bacteroides fragilis) + eskulina (jest rozkładana, kolonie są czarne) + gentamycyna (hamuje inne bakt.)

10. CCCA - Columbia agar z cykloseryną (hamuje g+), cefoksytyną (hamuje g-) i amfoterycyną B (hamuje grzyby), na C. difficile

11. SS - Salmonella jasne kolonie z czarnym środkiem (Proteus może przypominać Salmonellę)

12. SF - bulion seleninowo-fosforanowy, namnażający dla Salmonelli

13. Loefflera - na Corynebacterium diphteriae, pobudza tworzenie ziarnistości metachromatycznych (jasne kremowe kolonie)

14. Clauberga - maczugowce błonicy, czarne kolonie

15. Tindalea - zawiera tellurek potasu, wybiórcze, na podst. wyglądu można odróżnić diphteriae od innych Corynebacterium

16. Lowensteina-Jensena - na prątki, zawierające jaja i zieleń malachitową (inne bakterie giną, prątki przeżywają)

17. Agar czekoladowy - Neisseria, Moraxella, H. influenzae wymagają zwiększonego CO2 i zmniejszonego O2

18. Chromogenne CPS - Podłoża chromogenne pozwalają wykrywać aktywność enzymatyczną drobnoustrojów. W zależności od produkowanych enzymów drobnoustroje rosnące na płytkach rozkładają odpowiednie substraty chromogenne, co powoduje wybarwianie rosnących kolonii na odpowiednie kolory - hodowla i identyfikacja drobnoustrojów w moczu

19. Wilson-Blaira - podłoże z solami bizmutu, wybiórcze dla Salmonelli, czarne kolonie, błyszczące jak lustro, zaczernione podłoże

20. Hektoen - wskaźniki fermentacji laktozy i produkcji H2S, inhibitory wzrostowe dla gram(+), kolonie Salmonelli zielone, E. coli - łososiowe

21. PRAS

22. Chrom agar - wybiórczo-różnicujące dla Candida (różne gatunki - różne kolory: albicans - zielony, tropica - niebieski, brusei - myszowaty, jasnoróżowy, glabrata - ciemnoróżowy)

23. King B - do wykrywania pałeczek fluorescencyjnych (zawiera properdynę)

24. Charcoal agar - wybiórcze dla Bordatella - diagnostyka krztuśca!

Hodowla dla bezwzględnych beztlenowców - 25% N2, 10% H2, 5% CO2

Hodowla dla mikroaerofilnych bakterii - 85% N2, 10% CO2, 5% O2

API 32 E - Enterobacteriaceae

Antybiogram ATB Ur

API 20A - identyfikacja beztlenowców

API 20Strep - identyfikacja paciorkowców

Test na katalazę - dodatni dla gronkowców (ujemny dla paciorkowców)

Test na koagulazę - dodatni dla S. ureus, ujemny dla innych gronkowców

Odczyn lateksowy - zwany także aglutynacją lateksową (LA) to metoda wykrywania antygenów w płynach ustrojowych. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu mikrocząsteczek lateksu opłaszczonych specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi. Tak opłaszczone cząsteczki inkubuje się z pobranym płynem ustrojowym. Jeżeli zawiera on podejrzewany antygen, następuje widoczna makroskopowo aglutynacja.

Aglutynacja szkiełkowa - polega na tym, że używając swoistej surowicy poszukuje się antygenów

Test aglutynacji szkiełkowej dla Salmonella sp. - określenie serowaru w oparciu o schemat Kauffmana-White'a

Wykorzystuje bud. antygenową pow. pałeczek Salmonella uwzględniając antygeny O - somatyczny, H - rzęskowy, VI - zjadliwości (aminocukier powierzchniowy). W wyniku przeprowadzonego postępowania zostaje ustalona przynależność badanego szczepu do określonej odmiany serologicznej - serowaru. Surowica HM zawiera p/wciała dla wszystkich antygenów rzęskowych Salmonella. Aglutynacja komórek świadczy o przynależności do rodzaju Salmonella. Surowice grupowe zawierają mieszaninę p/wciał dla antygenów somatycznych w obrębie poszczególnych grup. AO, BO, CO, DO, EO. Aglutynacja komórek świadczy o przynależności do określonej grupy serologicznej

Metoda dyfuzyjno-krążkowa - metoda jakościowa

MIC - minimalne stężenie hamujące, najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego (antybiotyku lub chemioterapeutyku), wyrażone w mg/l, hamujące wzrost drobnoustrojów. Płynne: Do probówek dodaje się badanego środka bakteriobójczego w odpowiednich, malejących stężeniach (zazwyczaj rozcieńczonych o połowę). Następnie do każdej probówki dodaje się taką samą ilość zawiesiny danego drobnoustroju z hodowli. Po 16-18 godzinnej inkub.w 35°C obserwuje się zmętnienie w probówkach. Pierwsza probówka bez zmętnienia to MIC

Stałe: to samo na płytkach, pierwsza płytka bez kolonii to MIC

E-test - met. ilościowa, pasek z różnym stężeniem antybiotyku, łezka z hodowli (tam gdzie się kończy - MIC)

VITEK - met. ilościowa

TEST ATB - sprawdzenie wrażliwości na antybiotyki, ilościowe dla grzybów i S. pneumoniae (?), ogólnie jakościowa

ESBL - betalaktamazy o rozszerzonym spektrum działania u Enterobaceriacae , rozkładają: penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, wrażliwe na penicyliny z inhib. i karbapenemy, test dwóch krążków: środek augmentin, boki ceftazidim i cefotaksim, dół aztreonam, myszka Mickey - ESBL(-), zniekształcone - ESBL(+), jeśli ESBL(+) sprawdzić czy MBL, KPC (oporność na karbapenemy, Enterobacteriacae, P. aeruginosa, Acinetobacter spp.)

MBL - metalobetalaktamazy z cynkiem w centrum aktywnym, najczęściej P. aeruginosa, Acinetobacter spp., test z ceftazidimem, imipenemem, EDTA (chelatuje cynk), niewrażliwy na enzymy aztreonam

KPC - karbapenemazy w centrum aktywnym seryna, oporne na wszystko, test: dwie płytki: 1. - imipenem, 2. - imipenem + kw. Fenyloboronowy, wynik (+): strefa 2. - strefa 1. => 5mm

MRSA - metycylinooporny S. aureus, oporny na wszystkie betalaktamy, wrażliwy na: glikopeptydy, linezolid, ceftobiprol, sinercid (chinupristyna i dalfopristyna), sprawdzenie wrażliwości z krążkiem z cefoksytyną, wrażliwy jeśli strefa zahamowania > 22mm

HLAR - high level aminoglycoside resistance, enterokoki, naturalnie oporne na cefalosporyny i aminoglikozydy, klinicznie oporne na klindamycynę i biseptol (sulfametoksazol + trimetoprim), E. faecium oporny na imipenem (betalaktamy + aminoglikozydy = wzrost efektu bakteriobójczego), leczenie HLAR: linezolid, glikopeptydy, sinercid (na E. faecium) i ceftobiprol (na E. faecalis), test: streptomycyna (300μg) + gentamycyna (120μg)

MLS-B - wykrywanie indukcyjnej oporności u opornych na erytromycynę i wrażliwych na klindamycynę Staphylococcus i Streptococcus, oporność może być konstytutywna i indukcyjna, test z erytromycyną i klindamycyną, w przyp. oporności indukcyjnej nie stosuje się tych antybiotyków

VRE - wankomycynooporne enterokoki + oporne na teikoplaninę, test z wankomycyną

PRSP - S. pneumoniae oporne na penicyliny, test z penicyliną, cefotaksimem i ceftriaksonem

Dochodzenie epidemiologiczne jest jednym z podstawowych i rutynowych działań zespołu zakażeń zakładowych. Ma ono na celu rozpoznanie ogniska epidemicznego, ustalenie czynnika etiologicznego, źródła i wrót zakażenia oraz wykrycie i przecięcie dróg transmisji a w rezultacie jego wygaszenie.

W odniesieniu do zakażeń zakładowych ogniskiem epidemicznym jest pojawienie się w szpitalu:

• drobnoustroju alarmowego w powiązaniu z objawami klinicznymi,

• dwóch przypadków zachorowań powiązanych w łańcuch epidemiologiczny,

• statystycznego wzrostu liczy zachorowań (wzrost ponad spodziewaną ilość).

Określenie wzrostu liczby zachorowań jest trudnym do ustalenia zawłaszcza, gdy mamy do czynienia z ogniskiem pełzającym, kiedy liczba zachorowań narasta długo
i powoli. Prowadzenie analizy porównawczej utrudnia różnorodność przypadków leczonych w szpitalu a także różny czasookres leczenia wpływający na liczbę hospitalizowanych. W takich okolicznościach w celu ustalenia liczby zakażeń posługujemy się pojęciami:

• gęstość zachorowań - jest to liczba nowych przypadków zachorowań przeliczona na 1000 osobodni,

• gęstość zachorowań z procedurą - jest to liczba nowych przypadków choroby na 1000 osobodni u chorych poddanych tej samej procedurze np. u chorych wentylowanych.

Z chwilą pojawienia się pojedynczego zachorowania dochodzenie epidemiologiczne ma na celu ustalenie czy zakażenie zostało zawleczone do szpitala czy jest ono zakażeniem zakładowym. W tym celu należy przeprowadzić wywiad
z chorym a także przeprowadzić badanie chorych z otoczenia zwłaszcza z tzw. grupy ryzyka, tzn. poddanych tej samej procedurze diagnostycznej lub leczniczej. Jeśli wystąpiło kilka przypadków zachorowań należy szukać nosicielstwa wśród personelu szpitalnego.

Do czynników wywołujących najczęściej zachorowania ogniskowe w polskich szpitalach należą:

• Acinetobacter baumani - drobnoustrój ten kolonizuje rury respiratorów stąd ogniska zakażeń zakładowych w oddziałach intensywnej terapii.
  W oddziałach tych jako czynnik etiologiczny równie często stwierdzane są Psedomonas aeruginosa i Klebsiella ESBL,

• Proteus mirabilis jest przyczyną zakażeń związanych z cewnikowaniem pęcherza moczowego,

• Serratia sp. - wykrywane najczęściej w oddziałach kardiochirurgii. Ten rodzaj bakterii często kolonizuje dozowniki do mydła zwłaszcza, gdy pojemnik
  z mydłem nie jest wymienny tylko ponownie napełniany,

• Rotawirusy - najczęstsza przyczyna zakażeń w oddziałach dziecięcych. Obserwuje się sezonowość zachorowań. Zachorowania mają gwałtowny przebieg z tendencją do samoograniczenia. Z uwagi na prostą diagnostykę czynnik jest stosunkowo łatwy do wykrycia.

Tok badania mikrobiologicznego

1. Pobranie materiału od chorego:

• materiał powinien być typowy dla określonego procesu chorobowego np. zmiana w płucach - plwocina

• materiał powinien być pobrany z miejsca najbliższego ogniska infekcji

• technika pobierania powinna gwarantować otrzymanie dostatecznej ilości materiału

• należy stworzyć warunki by podczas pobierania zabezpieczyć materiał przed zanieczyszczeniem innymi drobnoustrojami

• jałowe narzędzie

• przestrzeganie zasad aseptyki

• materiał o istotnym znaczeniu (np. krew) należy pobrać (w miarę możliwości) przed rozpoczęciem leczenia

2. Przesyłanie pobranego materiału:

• zabezpieczenie przed uszkodzeniem

• naczynie do transportu z odpowiedniego materiału, a jego wielkość dostosowana do ilości materiału

• cały proces przesyłania powinien być przeprowadzony jak najszybciej

• muszą być zachowane warunki transportu (szczególnie ważne gdy podejrzenie zakażenia beztlenowcami)

• naczynie z materiałem musi być czytelnie i trwale oznaczone nazwiskiem i imieniem chorego

• do materiału musi być dołączone skierowanie

3. Diagnostyka:

Materiał



preparat bezpośredni izolacja i hodowla bakterii na podłożach badanie surowicy

chorego na obecność

badanie mikroskopowe przeciwciał przeciwko

ocena mikroskopowa wyhodowanych kolonii czynnikowi zakaźnemu

wstępna diagnoza (np. Lateks, ELISA)

określenie lekowrażliwości (antybiogram)

określenie właściwości biochemicznych

(szeregi biochemiczne)

określenie przynależności serologicznej

wykrywanie czynników zjadliwości

(np. toksyny)

próby biologiczne (testy biologiczne np. na

żywych organizmach)

DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ GRZYBICZYCH

1.badania mikroskopowe

badamy płyn mózg-rdz. (kryptokoki), mocz, plwocinę(np. Aspergillus), kał (C.albicans), wysięki, treść żołądkową, dwunastniczą, żółć, skóra, paznokcie, włosy, materiały z biopsji…

- test z KOH- wykrywanie dermatofitów, skóra w KOH pod mikroskop, KOH rozpuszcza keratynę ale nie rozpuszcza grzyba

- dla orientacji, Gram

- barwienie metodą Gomoriego (GMS) - grzyb na czarno

- immunofluorescencja bezpośrednia

2. hodowla i izolacja

2-3 dni, niektóre dermatofity, grzyby dymorficzne do 3 tygodni i dłużej

Podłoża:

Sabourauda (4% glukoza z dodatkiem chloramfenikolu lub cykloheksamidu, ph=5,6), najczęściej dwie hodowle (temp. Pokojowa i 37C- żeby odróżnić dymorficzne od reszty)

Kukurydziane

Płynne Sabourauda, BHI + glukoza

selektywne

Charakterystyka morfologiczna- np. wymiary grzybni, przegrody, rozgałęzienia, pigmentacja,

obecnośc zarodników, konidiów

Morfologia kolonii:

Drożdżaki- gładkie z równymi brzegami, z powierzchnią gładką lub szorstką, śluzową czasem kremową

Pleśniowe- powierzchnia welwetu, zabarwione

Aspergillus flavus- zielona oliwka

Aspergillus Niger- brązowo-czarny

Testy biochemiczne

Test kiełkowania (filamentacji)- zdolność do tworzenia kiełków z komórki drożdży, dodatni

dla Candida albicans

3. Testy skórne (test nadwrażliwości skórnej)

Odpowiedź komórkowa, używa się obecnie do badania stanu odporności pacjenta na zakażenia grzybicze, badania epidemiologiczne

4. Inne

Szczególnie przy grzybicach układowych

W płynach ustrojowych wykrywa się antygeny grzybicze (wielocukry) - glukan (Candida, Trichosporon), galaktomannan (Aspergillus, Penicillium) - test lateksowy.

Aglutynacja lateksu (IgM)- np. kryptokoki, metody immunodyfuzyjne (np. Aspergillus), odczyn wiązania dopełniacza(IgG), immunofluorescencja pośrednia ELISA, sondy z kwasów nukleinowych

5. Antybiogram

Zawsze MIC! (Etesty), podłoże RPMI

Kał zatruciowy - Salmonella, Shigella (McConkeya, SS, podłoże ilson-Blaira), Yersinia, S. aureus (Chapmana), E. coli, Bacillus cereus (toksyny - specjalne podłoże dla Bacillusa, nie siejemy normalnie), Campylobacter

Kał biegunkowy - E.coli (EHEC, EPEC, agregacyjne), C. difficile/perfringens, Candida albicans, u dzieci enterokoki, rotawirusy (odczyn lateksowy)

Płyn z jamy otrzewnej - kierunek: tlenowce i beztlenowce, B. fragilis vs. E. coli; na Columbia agar z krwią (beztlenowce), MacConkeya, Sabourauda, podłoże płynne Shedlera

Mocz - mocz można pobierać na 3 sposoby:

1. metoda środkowego strumienia (mocz trzeba przetrzymywać w lodówce)

2. poprzez cewnik (po zmianie cewnika)

3. nakłucie nadłonowe

można pobrać na podłoże Unicum (MacConkey + podłoże Cled agar) - zanurzyć podłoże w zbiorniku z moczem i zamknąć; posiew ilościowy ezami kalibrowanymi (mała eza 1µl - McConkey, duża eza 10µl - agar z krwią), G(-): E. coli (UPEC, najczęstszy O4 H12 K5), Klebsiella, Proteus, Enetrobacteriacae, P. aeruginosa G(+): S. aureus, enterokoki, S. epidermidis + grzyby, S. saprophiticus - u mlodych kobiet McConkey (+)

Próba Goulda.

Oznaczanie czvnnika hamuiacego wzrost bakterii w moczu. Próba przydatna do prawidłowej interpretacji wyników badania ilościowego moczu, oraz w badaniach kontrolnych po leczeniu. Obecność czynnika hamującego wzrost bakterii świadczy o utrzymywaniu się dużego stężenia leków przeciwdrobnoustrojowych w drogach moczowych. Wykonuje się w następujący sposób. Na 2 płytki z podłożem Muellera-Hinton należy posiać zawiesiny szczepów wzorcowych S.aureus ATCC 25gf3 i E'coli ATCC 25922 (gęstość 0,5 w skali MacFarlanda). Na tak przygotowanym podłożu należy umieścić krążki bibułowe nasycone próbką badanego moczu, ogrzaną wcześniej w temperaturze 60"C przez 1 godzinę w celu zabicia bakterii. Próbki inkubuje się 18 - 24 godziny w temperaturze 35 - 37 "C. W obecności czynnika hamującego wzrost świadczy każda strefa zahamowania wzrostu szczepów wzorcowych wokół krążka. W przypadku obecności czynnika hamującego wzrost bakterii badanie ilościowe rnoczu należy powtórzyć ponieważ po ustąpieniu działania tego czynnita może nastąpić szybki wzrost bakterii.

Krew - pałeczki G(-), paciorkowce, etc., posiew: „1 próbka”: posiew na podłożu tlenowym i beztlenowym, umyć skórę mydłem w płynie, wytrzeć ręcznikiem papierowym, zdezynfekować środkiem do dezynfekcji, pobiera się krew żylną z różnego wkłucia (2 próbki), nie robi się preparatu bezpośredniego poza malarią, szczepy wskaźnikowe Streptococcus bovis i Clostridium septicum, wskazania: posocznica, bakteriemia (3 próbki z trzech różnych wkłuć po sobie), zap. wsierdzia, gorączka o nieustalonej etiologii, ZOMR, ciężkie zap. płuc, kości, szpiku, nagłośni u dzieci, dur brzuszny, dury rzekome, niektóre odzwierzęce: tularemia, bruceloza

PROB. TLENOWA: posiew na agar z krwią, McConkeya, agar czekoladowy, Sabourauda, podłoże płynne (BHI), preparat

PROB. BEZTLENOWA: agar z krwią, Columbia agar, podł. płynne Schedlera, preparat

ZAP. WSIERDZIA (OSTRE I PODOSTRE): 3x na dobę lub 3 próbki w ciągu 1h lub 2 próbki co 12h

GORĄCZKA O NIEZNANEJ ETIOLOGII: 3 próbki w odstępie 45-60min, jeśli nic po 24h, powtórzyć po 48h

ZAK. ODCEWNIKOWE: krew z cewnika 2h wcześniej powinno wyrosnąć (wtedy od tego zakażenie) lub krew nie z cewnika + końcówka z cewnika (4cm - po 2 cm na agar z krwią i Sabourauda), inkub. na 48h w 37 st. (po 24h - sprawdzenie), >15 kolonii przyczyna zakażenia, lub krew nie z cewnika + końc. Cewnika (fragment cewnika do NaCl, wytrząsanie, po 100μl na podł. Agar z krwią i Sabouraud), >100 kolonii (10^3 bakt.) wynik dodatni

Wymaz z razy pooperacyjnej - pałeczki G(-)

Wymaz z rany pooparzeniowej - P. aeruginosa, S. ureus, bakt. beztlenowe

Fagotypowanie - na posiane bakterie dodaje się bakteriofagi, które zżerają swoiste tylko dla siebie bakterie - powstanie łysinki mówi nam o tym jaka to była bakteria (test służy do identyfikacji bakterii)

Wymaz z rany zgorzelinowej - C. perfringens (toksynotyp A), C. novyi (typA), C. septicum, C. histolyticum, C. sordelli, S. aureus

Diagnostyka:

- barwienie Grama

- hodowla na agarze z krwią (podwójna hemoliza)

- preparat tuszowy (wykrywanie otoczek C. perfringens)

- test na lecytynazę (toksyna alfa, fosfolipaza C, powoduje lizę erytrocytów, leukocytów, płytek krwi i komórek śródbłonka)

- badanie cech biochemicznych (probówkowy szereg biochemiczny)

- antybiogram ATB ANA

Leczenie:

- opracowanie chirurgiczne

- antybiotykoterapia (penicylina, metronidazol, klindamycyna)

- komora hiperbaryczna

Plwocina - Klebsiella, Acinetobacter, S.pneumoniae (test wrażliwości na optochinę - w sposób wybiórczy hamuje wzrost Streptococcus pneumoniae, co odróżnia te dwoinki od innych paciorkowców - α hemolizujących wrażliwych na znacznie większe stężenia tego związku. Zahamowanie wzrostu wokół krążka uważa się za wynik dodatni)

Punktat z zatok - H. influenzae, S. pneumoniae, Moraxella catharralis

Wymaz z gardła - S. pyogenes (test z bacytracyną, strefa zahamowania > 15 mm dodatni, jeśli nie to potwierdzić innymi testami)

C. diphteriae - dwa wymazy, jeden na preparaty: jeden met. Grama, drugi met. Neissera; drugi wymaz na posiew - podłoże Loefflera (bulion z dodatkiem glukozy i surowicy końskiej) - jasne kremowe kolonie, i na podłoże Clauberga (z telurynem potasu) - różnicujące na podtypy, generalnie małe, czarne kolonie; test Eleka - wykrywanie toksyny; podanie w ciągu 48h surowicy antytoksycznej! (surowicę antytoksyczną podaje się również w tężcu i botuliniźmie)

B. pertussis - wymaz z tylnych nozdrzy przez nos, wymazówka nie może być bawełniana (zabija bakterię), posiew na podłoże Charcoal agar

Żółć - G(-), enterokoki

Plwocina w kierunku gruźlicy - sporo materiału, najlepiej rano (gromadzenie się prątków w nocy) Rozmazy wykonane z materiału klinicznego barwi się na prątki kwasooporne najczęściej m-dą Ziehla-Nielsena (alkoholowy r-twór fuksyny)-prątki mają zbarwienie różowe. Stosuje się też barwniki fluorochromowe(rodamina,auramina),obserwację przeprowadza się w mikroskopie fluoroscencyjnym. Ta metoda jest badaniem przesiewowym. Na podłoże (bulion - namnażające, podłoże Lowensteina-Jensena - 2 - 6 tyg.)

PMR - pobrany nie może być ochłodzony poniżej 37 st.! Makroskopowo płyn ropny(rozmaz 20% limfocyty, 80% neutrofile)/nieropny(limfocytarny, rozmaz 80% limfocytów)/gruźliczy(wytrąca się siatka włóknika)

Poszukiwanie bakterii - odwirowanie płynu i posianie (agar z krwią, czekoladowy, MacConkey, Sabourauda, Columbia agar z krwią (beztlenowce), płynny Schedlera)

Poszukiwanie antygenów rozpuszczalnych w płynie, surowicy i moczu - antygeny otoczkowe metodą lateksową (dla N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae)

Poszukiwanie przeciwciał w płynie i surowicy (znalezienie p/ciał tu i tu - neuroinfekcja - p/ciała zostały wytworzone w płynie)

Preparat - błękit metylenowy i Grama (widoczne leukocyty wielojądrzaste)

Krew na posiew przy zapaleniu opon!

Wymaz ze zmian skórnych - gronkowce, grzyby

Odczyn lateksowy dla rotawirusów - sprawdzenie obecności antygenów wirusa w kale

Odczyn lateksowy do diagnostyki zapalenia opon MR - diagnoza kryptokokowego zap. OMR

PMR + surowica + mocz - legionelloza (w moczu antygen, w surowicy i PMR - p/wciała)

Kontrola sterylizacji

Urządzenia sterylizacyjne muszą być kontrolowane systematycznie. Do tego celu służy preparat biologiczny- Sporal. Każde opakowanie sporalu zawiera 10⁸- 10⁹ spor (Bacillus stearothermophilus - sporal A lub Bacillus subtilis - sporal S) osadzonych na krążkach z bibuły. Użyty szczepy posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji co pozwala na dokładne zbadanie funkcjonowania urządzenia sterylizującego.

→ Sporal A - (służy do kontroli autoklawów) ulega całkowitemu wyjałowieniu tylko wtedy, gdy temperatura wewnątrz autoklawu wynosi nie mniej niż 121C, a czas ogrzewania preparatu nie mniej niż 20 min.

→ Sporal S- (służy do kontroli suszarek) ulega całkowitemu wyjałowieniu gdy temperatura wewnątrz urządzenia wynosi nie mniej niż 160C i czas działania tej temperatury nie był krótszy niż 2 godz.

Torebki papierowe z krążkiem sporalu wyjęte z opakowań foliowych należy umieścić w różnych miejscach urządzenia sterylizującego lub we wnętrzu sterylizowanych naczyń czy opakowań. Po zakończeniu sterylizacji zawartość torebek należy przenieść do probówek zawierających po 10 ml bulionu cukrowego i inkubować przez 7 dni sporal S w temp. 37C, sporal A w temp. 55C.

• jeżeli sterylizacja była skuteczna bulion w probówkach pozostaje klarowny

• w przypadku nieskutecznej sterylizacji w bulionie wystąpi zmętnienie i kożuch.

VDRL - na kiłę, odczyn kłaczkujący, niekrętkowy. Wykorzystywany do wykrywania reagin kiłowych. Jako antygen służy kardiolipina (ekstrakt z m. serca wołu, podobny do antygenu krętka). Wykrywa przeciwciała antykardiolipinowe (IgG, M, A). Badaną surowicę trzeba najpierw podgrzać w celu unieczynnienia dopełniacza. Modyfikacja - odczyn USR (dodatek chlorku choiny unieczynnia dopełniacz, nie trzeba podgrzewać, test może być wykonany szybciej).

TPHA - test hemaglutynacji T. pallidum. Do uczulonych antygenami T. pallidum erytrocytów baranich jest dodawana surowica pacjenta (kolejno rozcieńczana) - obecność przeciwciał T. pallidum powoduje aglutynację erytrocytów na powierzchni (`czapeczka'). Brak przeciwciał - erytrocyty opadają (`guziczek').

Schemat postępowania w kile

1. USR (odczyn screeningowy, przeprowadzany wśród pracowników i u kobiet w ciąży)

2. jeżeli dodatni USR VDRL (jakościowy)

3. jeżeli dodatni VDRL VDRL (ilościowy - dodatnie przy rozcieńczeniu 16x - czynne zakażenie)

4. FTA (odczyn immunofluorescencji pośredniej, świecące na zielono sprężynki)

5. jeśli pacjent się wypiera > FTA-Abs - adsorpcja przeciwciał z surowicy pacjenta, potem te przeciwciała FTA ilościowe

FTA-Abs IgM - u dzieci podejrzanych o kiłę wrodzoną

TPI - odczyn immobilizacji krętków, po 9 tyg., wykrywanie p/ciał immobilizyny, liczy się unieruchomione krętki, jeżeli => 81% wynik dodatni

ASO - odczyn antystreptolizynowy - badanie diagnostyczne w kierunku zakażeń paciorkowcami (S. pyogenes). Badaniem tym stwierdza się w surowicy obecność przeciwciała przeciwko antygenom powierzchniowym paciorkowców - streptolizynie O (czynnik zjadliwości pyogenesa, powoduje lizę erytrocytów). Odczyn typu neutralizacji - przeciwciała z badanej surowicy będą hamowały streptolizynę, więc erytrocyty opadną.

ELISA - test immunoenzymatyczny, polega na tym, że przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznawać dane białko (zawarte w materiale biologicznym), które wcześniej zostało unieruchomione na podłożu. Po dodaniu przeciwciał następuje utworzenie kompleksów immunologicznych, zatem przeciwciało także zostaje unieruchomione. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała i dodaniu substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem zajdzie reakcja enzymatyczna, czemu z kolei będzie towarzyszyło pojawienie się produktu.

Legionelloza:

Można badać surowicę (przeciwciało), lub mocz (antygen)

Borelioza:

Przeciwciała IgM, IgG w surowicy/płynie m.-r./płynie stawowym, badanie mało swoiste, wymaga potwierdzenia Western-Blott

WZW

WZW A: przeciwciała IgM (utrzymują się przez kilka miesięcy)

WZW B:

Podstawowym badaniem serologicznym w kierunku wykrycia zakażenia wirusem HBV jest test na wykrycie antygenu powierzchniowego tego wirusa, czyli HBsAg. Badanie to powinno być wykonane jako pierwsze w każdym przypadku podejrzenia WZW typu B.

Zakażenie HBV wywołuje odpornościową odpowiedź humoralną i komórkową (synteza homologicznych przeciwciał: anty-HBc, anty-HBe, anty-HBs i anty-preS). HBcAg u osób zakażonych wykrywa się w jądrach hepatocytów. HBeAg w dużych ilościach występuje w okresie wiremii i to prawie zawsze w surowicach HBsAg-dodatnich. [1].

Powyższe oznacza między innymi to, że szereg ogólnie dostepnych badań może pomóc w wykryciu zakażenia oraz w określeniu jego fazy (ostra, przewlekła, zakażenienie przebyte, nabyta odporność na zakażenie).

ELISA na HBsAg, HBeAg, anty-HBs, anty-HBe, anty-HBc

Opis markerów serologicznych HBV.

HBs Ag - antygen powierzchniowy (otoczkowy, (od surface - powierzchnia) ) HBs-Ag (hepatits B surface antigen), kodowany przez fragment genu C, tzw. pre-core (HBSAg, HBs-Ag), świadczą o : nosicielstwie HBS, ostrej lub przewlkełej fazie WZW B. Pojawia się w okresie 1 do 10 tygodni od ekspozycji na zakażenie. Przetrwanie HBsAg ponad 6 miesięcy jest klasyfikowane jako nosicielstwo.

HBe Ag - (od early - wczesny) wydzielnicza postać antygenu rdzeniowego (hepatitis B e antigen). Pojawia się zaraz po ujawnieniu HBsAg lub około tygodnia później w surowicy. Najszybciej zanika w okresie zdrowienia. Jego zanikowi towarzyszy zanik HBV DNA. Obecność tego antygenu u osób zakażonych HBV wskazuje na wysoką zakaźność.

Anty-Hbe - przeciwciała skierowane w kierunku wydzielniczemu antygenowi HBe (HBe Ag). Ich pojawienie po zaniku HBeAg oznacza zazwyczaj tak zwaną dobrze rokującą "serokonwersję w układzie e" - jest to dobra oznaka prognostyczna (poza powstawaniem mutantów e-minus, gdzie replikacja trwa nadal pomimo braku HBe Ag i ppojawieniu się Anty-HBe).

Anty-HBc IgM - przeciwciała przeciw antygenowi rdzeniowemu. HBc-Ag (od core - rdzeń, hepatitis B core antigen) - nie wystepuje w wolnej formie w surowicy, jest "ukryty" w cząstce Dane'a, stąd nie ma testów diagnostycznych na jego wykrycie. Wykrywany w fazie wczesnej i późnej ostrego WZW B. Zazwyczaj stwierdza się ich zanik po upływie kilku tygodni. Przy brak Anty-HBc IgM u chorego spełniającego kliniczne kryteria zapalenia wątroby przyczyną nie jest wirus HBV.

Anty-HBc IgG - przeciwciała przeciw antygenowi rdzeniowemu świadczące o przebytym zakażeniu HBV, mogą utrzymywac się w surowicy przez wiele lat po przebytym zakażeniu HBV (WZW B). Pojawiają się kilka tygodni od zakażenia, wykrywane w testach komercyjnych w oznaczeniu "AntyHBc - Total".

Anty-HBs - przeciwciała świadczące o uodpornieniu (szczepienie lub przebyte WZW B) . Pojawiają się w okresie 3-4 miesięcy po ustąpieniu objawów chorobowych i po zaniknięciu HBsAg - w okresie rekonwalescencji. Zanik może nastąpić w okresie do 6 lat od zakażenia. U osób przewlekle zakażonych HBV nie wytwarzają się te przeciwciała.

Interpretacja wzorów serologicznych (wzór serologiczny : interpretacja)

Wzorce typowe.

HBsAg+ HBeAg+ AntyHBcIgM+ : Ostre WZW B. Okres wczesny.

HBsAg+ HBeAg- AntyHBcIgM+ : Ostre WZW B. Okres późny.

HBsAg- AntyHBcIgM+ : Ostre WZW B. Okres późny.

HBsAg- AntyHBcIgM- AntyHBc+ AntyHBs- : Przebyte WZW B bez anty-HBs lub nosiciel HBs (niskie miano antygenu)

HBsAg- AntyHBcIgM- AntyHBc+ AntyHBs- : Przebyte WZW B. Odporność.

HBsAg+ HBeAg+ AntyHBcIgM- : Nosiciel HBsAg. Wysoka zakaźność.

HBsAg+ HBeAg- AntyHBcIgM- : Nosieciel HBsAG. Mała zakaźność.

HBSAg- AntyHBcIgM- AntyHBc- AntyHBs+ : Osoba szczepiona antyHBV

Wzorce nietypowe.

HBsAg+ AntyHBs+ : Wynik fałszywie dodatni? / Formowanie kompleksów / Zakażenie dwoma różnymi podtypami HBsAg. Jeden wywołał nosicielstweo, a drugi uległ eliminacji (np. HBsAg/ad, antyHBs/ay)

HBeAg+ AntyHBe+ : Wynik fałszywie dodatni? / Formowanie kompleksów / HBeAg i antyHBe wykazują różne determinanty

WZW C:

Przeciwciała anty-HCV w surowicy.

HIV:

Wykrywanie przeciwciał anty-HIV (przeciw białku en HIV-1) w surowicy (trzeba odczekać 3 miesiące od domniemanego zakażenia) i antygen p24 w surowicy, wynik dodatni potwierdzenie Western-Blott

Odczyny neutralizacji w diagnostyce wirusologicznej

Odczyn neutralizacji, czyli zobojętniania (NT) - jest najczulszym testem odzwierciedlającym stan funkcjonalny odpowiedzi immunologicznej na zakażenie wirusowe. Istotą odczynu jest zobojętnienie wirusa przez swoiste przeciwciała, co objawia się utratą jego właściwości zakaźnych. Wynik reakcji zobojętniania ocenia się przez zakażenie wrażliwej hodowli komórkowej lub zwierząt laboratoryjnych mieszaniną wirusa poddaną działaniu przeciwciał. Odczyn uznaje się za dodatni, jeżeli stwierdzi się brak efektu cytopatycznego lub brak objawów chorobowych u zakażonych zwierząt, przy wystąpieniu efektu działania wirusa w grupie kontrolnej, zakażonej tylko zawiesiną wirusa.

Próba kolorowa -w diagnostyce polio- surowica pacjenta połączona jest z wirusem, następnie mieszanina jest dodana do probówki zawierającą kolonię komórek wraz ze wskaźnikiem (np. czerwień obojętna). Komórki wytwarzają kwaśnie środowisko. Jeśli w surowicy pacjenta znajdowały się przeciwciała anty-polio, zneutralizowały one wirusa, więc dodanie tej mieszanki do komórek nie spowoduje ich lizy, a kolor pożywki się nie zmieni (wynik dodatni). Jeśli przeciwciał nie było, wirus zabije komórki, tym samym pH zmieni się na bardziej zasadowy - zmiana koloru wskaźnika (wynik ujemny).

Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA) - stosuje się w diagnostyce tych wirusów, które posiadają hemaglutyninę, zdolną do aglutynowania (zlepiania) erytrocytów, np. wirusy grypy, różyczki, paramyksowirusy. W tym celu do rozcieńczonej surowicy dodaje się antygenu wirusowego. Obecne w surowicy przeciwciała łączą się z określoną hemaglutyniną, blokując jej działanie. Po dodaniu krwinek czerwonych nie obserwuje się ich zlepiania.

Odczyn hemadsorpcji - wykorzystuje zjawisko przylegania erytrocytów różnych gatunków zwierząt lub ludzkich „0” Rh(-) do powierzchni komórek zakażonych wirusem posiadającym hemaglutyninę. Efekt ten pojawia się w hodowli komórkowej zanim wystąpi efekt cytopatyczny. Hamowanie odczynu hemadsorpcji przez swoiste przeciwciała umożliwia identyfikację gatunkową wirusa.

Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)

1. Do probówek lub studzienek płytki wlewa się kolejne (najczęściej podwójne) rozcieńczenia antygenu i stałą ilość inaktywowanej (pozbawionej dopełniacza) surowicy (źródła przeciwciał).

2. Jeśli w badanym materiale występuje poszukiwany antygen - powstają kompleksy antygen - przeciwciało.

3. Następnie dodajemy źródło komplementu (świeża surowica świnki morskiej) - ilość, która jest potrzebna do lizy krwinek dodawanych w ostatnim etapie. Jeżeli w mieszaninie znajdują się kompleksy antygen-przeciwciało to dopełniacz zostaje związany czyli "zużyty".

4. Dodajemy erytrocyty baranie i inaktywowaną surowicę królika jako źródło przeciwciał dla nowo wprowadzonych antygenów. Dochodzi do opłaszczenia erytrocytów przeciwciałami. Obserwowany efekt daje wynik testu. Jeśli zachodzi hemoliza oznacza to, że kompleks antygen (tu:erytrocyt) - przeciwciało dołączył dopełniacz. A więc wolny dopełniacz był obecny = nie został "zużyty" wcześniej. Nie powstały kompleksy antygen przeciwciało. Zatem w badanym materiale brak poszukiwanych antygenów.Wynik testu określamy jako UJEMNY.

5. Odwrotnie jeśli nie obserwujemy hemolizy, znaczy to, że dopełniacz został związany wcześniej przez kompleks poszukiwanego antygenu z przeciwciałem obecnym w surowicy. Wynik testu jest DODATNI.

Odczyny do mianowania wirusów

PFU - jednostka tworząca łysinkę - wirusy mogą wzrastać jedynie w żywych komórkach, niezbędne jest zastosowanie hodowli tkankowych. Do tego celu najczęściej używa się tchawicy człowieka lub nerki małpy. Po wniknięciu do komórek wirusy namnażają się w nich, a po ich zniszczeniu przenoszą na sąsiednie, w wyniku czego pojawiają się tzw. łysinki (ang. plaque) na tle niezmienionej warstwy komórek. Powstają łysinki, które się zlicza.

Odczyn hemaglutynacji (nie jest testem serologicznym, a diagnostycznym!) - służy do wykrycia wirusa, który powoduje aglutynację krwinek czerwonych. Dzięki niemu można określić miano (ilość) wirusa w jednostkach hemaglutynacji - największe rozcieńczenie wirusa, które powoduje zlepianie krwinek - odczyn dodatni - tzw czapeczka, odczyn ujemny - tzw guziczek.

Inne odczyny

Odczyn hemolizy radialnej - w diagnostyce różyczki

1. wirusy przyłącza się za pomocą chlorku chromowego do erytrocytów baranich lub ludzkich

2. krwinki miesza się z płynną agarową i rozlewa do płytek

3. po zakrzepnięciu wycina się w agarozie małe dołki, do każdego wlewa się próbkę badanej surowicy

4. inkubacja przez noc (dyfuzja p/ciał i połączenie z antygenami obecnymi na erytro)

5. na powierzchnię wylewa się roztw. Dopełniacza, który powoduje lizę tych krwinek, na których powstał komplek antygen - p/ciało

6. te dołki, w których badana surowica zawierała p/ciała, otoczone są przezroczystą strefą zlizowanych krwinek - średnica tej strefy odpowiada ilości obecnych p/ciał









---