Obawa przed eugenicznymi konsekwencjami medycyny molekularnej.

- Eugenika jest nauką z pogranicza genetyki, pragnącą praktycznie wykorzystać wiedzę o dziedziczeniu w celu poprawy gatunku.

- Jeśli gromadzone w wielu laboratoriach próbki DNA pacjentów pozwalają już dziś ustalić nosicielstwo mukowiscydozy, skłonność do zakrzepicy czy neurasteniczne cechy osobnicze, to w najbliższej przyszłości dołączy do tych rozpoznań ryzyko zawału serca, miażdżycy, nadciśnienia tętniczego, cukrzycy, nowotworów itd.

diagnostyka cytogenetyczna - obejmuje badania za pomocą chromosomów - ocena morfologii chromosomów (analiza pozwalająca na określenie liczby i struktury chromosomów w komórce badanego osobnika)
diagnostyka molekularna - obejmuje badania na poziomie kwasów nukleinowych DNA i RNA , mechanizmy cząsteczkowe przekaźnictwa sygnałowego i molekularną regulację ekspresji genów.

Diagnostyka cytogenetyczna

- narodziny cytogenetyki - sformułowanie w pierwszej dekadzie XX wieku chromosomowej teorii dziedziczenia - za jej twórców uznaje się W.S. Sutton i T. Morgan

- wcześniejsze odkrycia - opis chromosomów i podział jądra komórkowego (przełon lat 70. I 80. IX wieku)

- termin chromosom został wprowadzony przez W.G. Waldayera w 1888 roku.

- rok 1956 - ustalenie diploidalnej liczby chromosomów człowieka (2n=44XY)

- przełom - opracowanie techniki pozaustrojowej hodowli limfocytów i odkrycie funkcji kolchicyny - zatrzymanie podziałów w stadium metafazy

Diagnostyka cytogenetyczna człowieka

- pierwsza choroba genetyczna

- w 1958 roku wykazano, że zespół wrodzonych wad rozwojowych człowieka, znanych jako zespół Downa, jest spowodowany wystąpieniem trzech chromosomów autosomalnych nr 21 (trisomia chromosomu 21 pary)

- w 1960 roku w Denver (USA) uzgodniono pierwszy system identyfikacji chromosomów człowieka, opisujące ich wielkość i morfologię (położenia centromeru).

Diagnostyka cytogenetyczna zwierząt

- rok 1964 - identyfikacja fuzji centrycznej (translokacja Robertsona) u bydła. Wkrótce okazało się, że mutacja ta jest szeroko rozprzestrzeniona w wielu rasach bydła.

Lis polarny ma od 48 do 50 chromosomówLis pospolity(34+B), jenot chiński(54+B) i jenot japoński(38+B) oprócz podstawowego zestawu chromosomów (A) mają jeszcze zestaw B w różnej liczbie. Zestaw chromosomów B może wpływać na procesy spermatogenezy bo mają podobny wzór do Y.

Kot - 38 chromosomów

Królik - 44

Pies - 78

Lata 60. I 70. XX wieku - odkrycie procedur prowadzących do uzyskania barwień prążkowych:

- prążki Q (1968), G (1971), C (1972), R (1975), Ag-I (1975) - Różnica w wybarwianiu euchromatyny i heterochromatyny.

Perspektywy rozwoju diagnostyki molekularnej:

- zmniejszenie czasu analiz

- zwiększenie wydajności

- czułości

- dokładności, skierowania w kierunki analizy ilościowej

- wykonywanie testów na miejscu - w szpitalach lub poza nimi

- stosowanie sprzętu przenośnego

- obniżenie kosztów analiz

Zastosowanie metody PCR w badaniach diagnostycznych dotyczących człowieka. Genetyka człowieka, z której wywodzi się diagnostyka molekularna, ustąpiła miejsce badaniom chorób nowotworowych oraz zakażeń (dane na 2008r.):

- diagnostyka

- nowotwory

- bakterie

- wirusy

- genetyka człowieka

- mitochondria

- farmakogenetyka

Diagnostykę molekularną możemy podzielić na:

- diagnostyka bezpośrednia - obejmuje wykrywanie mutacji w DNA oraz wykrywanie DNA patogenów

- diagnostyka pośrednia - o występowaniu zmutowanych genów wnioskuje się na podstawie analizy sprzężeń z określonym locus.

Sprzężenie - gdy 2 loci leżą bardzo blisko siebie na chromosomie.

Diagnostyka molekularna:

- analiza kwasów nukleinowych (DNA, RNA) - badanie sekwencji nukleotydów

- można przyjąć, że lata 90-te przejdą do historii, jako okres rozpowszechnienia diagnostyki molekularnej

- techniki analiz DNA:

• Klonowanie

• Technika PCR-RFLP

• Sekwencjonowanie

• Real - time PCR

• Technika mikromacierzy

• Amplifikacja DNA metodą PCR - zwiększenie czułości i specyfiki badań - uproszczenia procedur badawczych umożliwiające automatyzację wytworzenie wielu rodzajów testów dostępnych w handlu

Pra…. przełom nastąpił z chwilą poznania genomu ludzkiego.

Ile razy można zakończyć mapowanie ludzkiego genomu?

- rok 2000 - zakończenie mapowania ludzkiego genomu

- rok 2001 - publikacje

• Nature - pod kierunkiem przewodniczącego HGP (Human Genom Project) Francisa Collinsa

• Science - prof. J. Craig Vanter (Celera Genomics)

- zgromadzone dane zawierały informację o sekwencji 90% euchromatyny (większość aktywnych genów)

- rok 2002 - prywatna firma deCODE pod kierunkiem dr Kari Stefanssona udostępniła wyniki badan przedstawiając mapę genomu człowieka 5 razy dokładniejszą

- pod koniec 2001 roku (HGP) zakończono sekwencjonowanie pierwszego chromosomu meta centrycznego nr 20

- w 2003r. znano sekwencje 7 chromosomów w tym Y

- w marcu 2005r. - ogłoszono zakończenie sekwencjonowania chromosomu X

- w 2006r. - odczytano chromosom nr 1 (największy)

Znane jest położenie genów na poszczególnych chromosomach

Chromosom 1 jest największy spośród ludzkich chromosomów

- zawiera niemal 2 razy więcej genów niż pozostałe

- zawiera w przybliżeniu 8% całej informacji genetycznej człowieka

- niektóre z jego 3141 genów wiążą się z powstawaniem 350 różnych chorób

- pełne sekwencjonowanie go zajęło 10 lat, 150 brytyjskim i amerykańskim naukowcom

- druga połowa 2005r. wystartował międzynarodowy program katalogowania zmian genetycznych pomiędzy poszczególnymi ludźmi

- wiadomo, że ludzki materiał genetyczny w przypadku niespokrewnionych osób jest w 99, 9% identyczny

- wg International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) genom człowieka zbudowany jest z 3,08mld nukleotydów

- około 99% euchromatyny genomu obejmującej 2,85mld nukleotydów dokładnie sekwencjonowano, przy zakładanym błędzie 1 na 100tys. Nukleotydów

- pozostała część genomu występuje w przerwach, z których 200mln nukleotydów znajduje się w heterochromatynie

- szacowana liczba genów kodujących białka u człowieka wynosi ok. 20tys. Do 25tys.

- w 2004r IHGSC sklasyfikowało 21 626 genów z czego 19 438 jest już znanych a 2 188 przewidywalnych

- IHGSC określiło ze w genomie człowieka występuje 231 667 eksonów, średnio 10,4 w locus i 9,1 w transkrypcie

- genomy nie są jednorodne - warianty sekwencji stanowią do 0,1% euchromatyny człowieka i obejmują insercje, delecje i polimorfizmy SNP(punktowe)

- termin polimorfizm - dotyczy sekwencji DNA, dla której najrzadszy allel występuje w populacji z częstotliwością 1% lub większą, w innym przypadku wariant sekwencji jest mutacją (mniej niż 1%)

- innym kryterium odróżniającym polimorfizm od mutacji jest towarzysząca mutacji zmiana fenotypu

- najczęstszymi polimorfizmami są polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) występujące co 1000 nukleotydów, przy czym zwykle występują 2 allele. Spośród ok. 10 mln SNP występujących w genomie człowieka ponad połowa została już opisana

Markery molekularne wykorzystywane w badaniach ekologicznych.

W ciągu ostatniego dwudziestolecia niezwykłe osiągnięcia biologii molekularnej wywołały rewolucję w badaniach ekologicznych

Dzięki użyciu markerów genetycznych możemy między innymi:

- mierzyć zmienność genetyczną

- śledzić przemieszczanie się osobników

- oceniać efekty inbredu (wsobności)

- identyfikować szczątki roślin i zwierząt

- badać nowe gatunki i śledzić historyczne drogi ich migracji

Znaczenie poznawcze, oraz rozwiązywanie problemów ekologicznych o znaczeniu praktycznym:

- ocena stopnia zagrożenia gatunków na skutek występowania zjawiska inbredu

- ocena stopnia hybrydyzacji pomiędzy genetycznie zmodyfikowanymi roślinami uprawnymi a ich dziko żyjącymi krewnymi

Inbred (chów wsobny) wzrasta homozygotyczność ujawniają się choroby genetyczne (bo najczęściej są uwarunkowane recesywnymi genami)

Markery molekularne jako źródło informacji:

- generowanie zmienności w nieskończenie zmiennych cząsteczkach kwasu DNA

- niewyobrażalnie wysoki stopień zmienności genetycznej u większości gatunków

- metody molekularne pozwalające na identyfikację informacji zapisanej w DNA

Ekologia molekularna - dziedzina biologii, która zajmuje się badaniem wzajemnych oddziaływań pomiędzy organizmami, a także między nimi i środowiskiem ich życia.

- wykorzystywanie samych informacji dotyczących zmienności fenotypowej stwarza wiele ograniczeń (zanikająca populacja motyli - utrata zmienności genetycznej zwiększenie jej podatności na szkodliwe działanie patogenów i wrogów naturalnych)

- problem z przekładaniem danych dotyczących zmienności fenotypowej na zmienność genetyczną

- wpływ czynników środowiskowych powoduje, że często nie ma ścisłej i bezpośredniej reakcji między genotypem a fenotypem organizmu.

• Np. rysunek na skrzydłach amerykańskich motyli z rodzaju Bicyclus może być różny w zależności od występowania opadów deszczu w okresie wzrostu larwalnego. W rezultacie osobniki o tym samym genotypie będą fenotypowo różne w zależności od tego, czy w okresie rozwoju trafiły na okres suchy, czy też wilgotny (Roskam i Brakefield, 1999).

Plastyczność fenotypowa - zjawisko polegające na możliwości fenotypowego różnicowania się tych samych genotypów pod wpływem działania różnych warunków środowiska.

• Np. Gąsienica (Nemoria arizonaria) motyla występującego w południowe-wschodniej części USA. Wygląd gąsienicy różni się w zależności od tego, w jakiej części drzewa żerują (wygląd zależy wyłącznie od jej diety).

Przykłady plastyczności fenotypowej pokazujące, jak zmienność czynników środowiskowych może powodować zmienność cech fenotypowych organizmów

Cecha	Czynnik środowiska	Przykład
Płeć	Temperatur w okresie rozwoju embrionalnego	Z jaj amerykańskiego żółwia jaszczurowatego Chelydra serpenntina wylęgają się wyłącznie samice, jeśli inkubacja odbywa się w niskiej temperaturze. W temperaturach średnich wylęgają się samce, w wysokich - znów tylko samice
Rodzaj wzrostu u roślin	Dostępność pierwiastków biogennych i wilgotność podłoża	Na glebach ubogich zwiększa się biomasa części podziemnych fiołka Viola septemloba
Wielkość liści	Intensywność światła	Liście mniszka pospolitego są większe w warunkach silnego oświetlenia
Wygląd w zależności od odżywiania się	Dostępność pokarmu	Larwy jeżowców Strongylocentrotus purpuratu i S. franciscanus mają dłuższe przydatki i mniejsze żołądki w warunkach małej dostępności pokarmu
Barwa upierzenia	Zawartość karotenoidów w pokarmie	Upierzenie samców meksykańskiej dziwonii ogrodowej Carpodacus mexicanus wykazuje różne odcienie kolorów czerwonego, pomarańczowego i żółtego w zależności od zawartości karotenoidów w diecie

Czego poszukujemy?

Markerów genetycznych

Użytecznych w ……

Wpływających na ……

Polimorfizm markerów genetycznych

Jeśli sekwencje DNA dwu lub więcej allelach z tego samego locus są nieco inne, odpowiednie trójki zasad RNA będą kodowały inne aminokwasy i w konsekwencji powstają różne formy tego samego białka. Takie różne formy białka odpowiadające różnym allelom noszą nazwę ALLOZYMÓW.

Allozymy jako markery genetyczne:

- próbki tkanki, całe osobniki (małe)

- ekstrakcja białek

- rozdzielanie białek (elektroforeza)

- wnioskowanie o zróżnicowaniu genetycznym badanych osobników

• ocena zróżnicowania genetycznego populacji

• porównanie różnych populacji

Allozymy jako markery genetyczne - ograniczenia:

- różnice w sekwencji DNA nie zawsze znajdują swoje odzwierciedlenie w zróżnicowaniu białek

- Pełna informacja zawarta jest w genomie każdego organizmu, analiza allozymów zaś pozwala dotrzeć jedynie do części tej informacji

• u człowieka informacja o sekwencji łańcuchów białkowych (kodowaniu białek) zawarta jest jedynie w niecałych 2% genomu

- próbki tkanki, całe osobniki (małe) - zabicie osobnika

- pozyskane próbki powinny być przechowywane w bardzo niskich temperaturach (do -70°C)

Żeby uniknąć tych niedogodności zaczęto stosować markery DNA

Markery genetyczne - dowolne cechy jakościowe organizmu, które podlegają dziedziczeniu według praw Mendla, tzn. są warunkowane przez jeden gen i które można identyfikować prostymi metodami laboratoryjnymi i analitycznymi.

Jedną z głównych trudności do poszukiwania dobrych markerów genetycznych do badan ekologicznych jest właśnie wybranie takich regionów genomu, w których poziom zmienności jest odpowiedni.

W klasycznym ujęciu marker genetyczny

- to cecha jakościowa uwarunkowana w sposób prosty - tzn. przez jedną parę alleli, przydatna do celów analizy genetycznej

- przydatność markera zależy od tego, czy jest on polimorficzny, co zachodzi wówczas, gdy w populacji występują przynajmniej dwa allele z locus tego markera

Markery genetyczne
-antygeny erytrocytarne (grupa krwi) - białka surowicy krwi(allotypy) i leukocytów - białka mleka - białka jaj - główny kompleks zgodności tkankowej MHC - sekwencje kodujące (geny)	- niekodujące sekwencje DNA tandemowo powtarzające się sekwencje mikrosatelitarne minisatelitarne elektroforeza DNA
Polimorfizm wykrywany jest poprzez analizę produktów genów (metody serologiczne i technikę elektroforezy białek) lub badanie DNA tych genów (metody Rflp, SSCP, PCR-HD, sekwencjonowanie, Q-PCR i in.)	grupa markerów związanych z polimorfizmem chromosomów

Cechy, którymi powinien charakteryzować się dobry marker genetyczny:

- silny polimorfizm (obecność wielu form allelicznych)

- dziedziczenie kodominujące

- wysoka frekwencja i równomierne rozłożenie w genomie

- neutralność sekwencyjna (brak sprzężenia lub związku plejotropowego z genami obniżającymi płodność i przystosowanie do środowiska)

- powtarzalność

- prosta i szybka metoda wykrywalności

Budowa fizyczna genomu człowieka

• Genom jądrowy (nrDNA)

3 200 000 000 bp (pz lub kz) - par zasad

= 3 200 000 kb - tysięcy par zasad

= 3 200 Mb - milionów par zasad

• Genom mitochondrialny (mtDNA)

Czy wiesz, że…?

- rozplątany i rozciągnięty łańcuch DNA jednej komórki osiągnąłby długość niemal 183cm

- połączone łańcuchy DNA ze wszystkich komórek naszego ciała można by rozciągnąć na odległość od Ziemi do Słońca i z powrotem prawie 600 razy

- aby zapisać kod całego ludzkiego genomu, trzeba by zatrudnić na 50 lat osobę piszącą z prędkością 60 słów na minutę, przez osiem godzin dziennie.

GEN - jest podstawową jednostką dziedziczenia i zajmuje ściśle określone miejsce (locus) w chromosomie lub też występuje poza jądrem komórkowym, wewnątrz mitochondriów i chloroplastów (dotyczy roślin).

Pod względem molekularnym gen jest regionem DNA, który podlega transkrypcji.

Wielkość genu, a konkretnie jego części strukturalnej, mieści się w bardzo szerokich granicach od kilkuset par nukleotydów (pz) do ponad dwóch milionów pz.

- gen SRY - zawiera tylko jeden ekson, składający się z 669 nukleotydów

- produktem tego genu jest białko o długości 223 aminokwasów, odpowiedzialne za ukierunkowanie rozwoju niezróżnicowanej gonady płodowej w jądro.

- gigantycznym genem jest ludzki gen DMD (Duchenne muscular dystrophy) kodujący białko dystrofinę, które jest zbudowane z 3685 aminokwasów

- gen ten jest zbudowany z ok. 2, 5 mln pz i w jego skład wchodzi 79 eksonów i 78 intronów, ale tylko 0, 6% długości tego genu obejmuje część kodującą.

- mutacje w tym genie odpowiedzialne są za rozwój groźnej choroby genetycznej człowieka - dystrofii mięśniowej Duchenne'a. która prowadzi do zaniku mięśni.

GENOM - zbiór informacji genetycznej zawartej w gamecie

- składa się na nią przede wszystkim DNA jądra komórkowego oraz DNA występujący w mitochondriach (modna)

- ponieważ długość cząsteczki modna jest niezmiernie małą w porównaniu z DNA haploidalnego zestawu chromosomów, dlatego pojęcie genomu odnoszone jest do DNA jądrowego.

GENOM

transkrypcja

Transkryptom

RNowe kopie aktywnych genów kodujących białka

translacja

Proteom

Zestaw białek komórki

Organizacja genomu jądrowego człowieka

*jednokopiowy jądrowy DNA (scnDNA) - występuje tylko raz w genomie i w nim zlokalizowana jest większość genów ulegających transkrypcji

DNA powtórzony tandemowo

DNA mini satelitarny:

- występujący subtelomerycznie

- powtarzający się motyw od 8 do 80pz

- zgrupowania długości od 500pz do 20 000pz

- metoda detekcji - hybrydyzacja Southerna

Zmienność sekwencji zarówno kodującego, jak i niekodującego DNA powoduje, że z wyjątkiem klonów nie ma dwóch osobników o identycznym genomie.

DNA ulega zmienności podczas replikacji dzięki procesom rekombinacji i mutacji.

Błędy w replikacji DNA mogą prowadzić do:

• Substytucja nukleotydowa

- tranzycja - to zamiana puryn (A i G) lub pirymidyn (C i T) - częstsze

- transwersja - to zamiana puryny na pirymidynę lub odwrotnie - rzadsze

• W przypadku, gdy substytucja nie powoduje zmiany kodowanego aminokwasu, nazywana jest substytucją synonimiczną. W tym przypadku zmienia się sekwencja kodonu w DNA, ale produkt białkowy pozostaje ten sam.

• Substytucja niesynonimiczna zachodzi wtedy, gdy zastąpienie jednego nukleotydu innym zmieni kodon tak, że będzie on kodował inny aminokwas. W tym przypadku nastąpi zmiana funkcji DNA, gdyż mutacja taka będzie powodowała zmianę sekwencji aminokwasów w białku.

• Insercja - wbudowanie dodatkowych nukleotydów

• Delecja - utrata części sekwencji DNA

- insercje lub delecje zachodzące w rejonie kodującym DNA powodują często przesunięcie ramki odczytu. Mutacje powodujące przesunięcie ramki odczytu zazwyczaj powodują utratę funkcji przez zmutowany fragment DNA

• Błędne parowanie nici opóźnionej

• „niemendlowskie” rozdzielenie materiału genetycznego - rozdział alleli nie 2-2, lecz 1-3

• Transpozycja - Barbara McClintock wykryła jeszcze jeden rodzaj mutacji

• Transfer poziomy- czyli horyzontalny

DNA mitochondrialny (mtDNA) ssaków stanowi zaledwie 1/10 000 długości najmniejszego znanego genomu jądrowego u zwierząt

Bezkręgowce

- Caenorhabditis elegans: 97 Mb

- Drosophila melanogaster: 180 Mb

Kręgowce

- Homo sapiens: 3 200 Mb

- Mus musculus: 3 300 Mb

Genom jądrowy i organellowy (mitochondrialny)

- potomstwo organizmów rozmnażających się płciowo dziedziczy w przybliżeniu połowę DNA po każdym z rodziców

- dziedziczenie dwurodzicielskie - gatunki diploidalne → w jądrze danego osobnika znajduje się jeden allel pochodzący od matki, a drugi od ojca

- dziedziczenie jednorodzicielskie - genomy organellowe mitochondriów (mtDNA) i chloroplastów (cpDNA) [dziedziczy się w linii żeńskiej].

Najważniejszy z wielu powodów wykorzystywania mtDNA w badaniach:→ większa wytrzymałość na warunki środowiskowe, w porównaniu z DNA jądrowym.

- gdzie nie wyizolujemy DNA jądrowego tam możemy wyizolować modna (np. z pojedynczego włosa bez cebulki nie wyizolujemy DNA jądrowego, modna natomiast tak)

- z pojedynczego włosa z pochewką korzenia można wyizolować około 7 tysięcy kopii jądrowego DNA i tysiąc razy więcej (7 milionów) kopii modna

- z 1 cm trzonu włosa nie można uzyskać jądrowego DNA, ale można otrzymać około 600 000 kopii modna

- sekwencja dwuniciowego modna jest kolista, co sprawia, że struktura ta jest bardziej odporna na degradację w porównaniu z DNA jądrowym. W przypadku niektórych tkanek (włosy, kości, zęby) można uzyskać matryce modna nawet po upływie stuleci (mumie, szczątki archeologiczne).

Funkcja mitochondriów:

- wytwarzanie energii w postaci ATP

- udział w regulacji procesów termogenezy

- miejsce zachodzenia procesów metabolicznych i produkcji wolnych rodników

- homeostaza wapniowa

- apoptoza

Rok 1963 → wykryto w mitochondriach obecność DNA (mtDNA)

- każda komórka posiada setki lub tysiące kopii mtDNA, po 2-10 kopii w pojedynczej organelli

- większość białek mitochondrialnych kodowana jest przez genom jądrowy

- są syntetyzowane na rybosomach cytoplazmatycznych i transportowane przez błony do mitochondriów

Pochodzenie genomów organellowych - teoria endosymbiozy

- opiera się na obserwacji, że procesy ekspresji genu zachodzące w organellach są pod wieloma względami podobne do odpowiednich procesów u bakterii

- geny organellarne są bardziej podobne do odpowiednich genów bakterii, niż eukariotycznych genów jądrowych

- mitochondria i chloroplastu są reliktami wolnożyjących bakterii, które dawno temu, na bardzo wczesnym etapie ewolucji, weszły w związek symbiotyczny z przodkiem komórki eukariotycznej

Wielkość genomu mitochondrialnego (mtDNA)

- zwierzęta - 16-20 kz

- drożdże(Saccharomyces cerevisiae) - około 80 kz (występowanie intronów)

- rośliny wyższe - 200-2500 kz

Mitochondria - dziedziczenie wyłącznie od matki

Liczba czasteczek modna (mitochondrialnego DNA)

- komórka jajowa 100 000

- Plemik 100

Mitochondria plemnika wnikają wprawdzie do komórki jajowej podczas zapłodnienia, ale od około 3 podziału po zapłodnieniu zanikają - w wyniku nie wyjaśnionego jeszcze procesu selektywnej degradacji.

DNA mitochondrialny wyjatki od rególy

- niewszystkie mitochondria u zwierząt dziedziczą się w linii matecznej

- bardzo rzadkie przypadki tak zwanego przeciekania ojcowskiego (przekazywania mitochondriów na potomstwo przez ojca) Si\twierdzono u;

• Myszy

• Ptaków

• Ludzi

- podwójne dwurodzicielskie dziedziczenie - małże z rodzin Mytilidae, Veneridae i Unionida -> samice dziedziczą mitochondria od matek, ale samce zarówno w linii matecznej, jaki i ojcowskiej, będąc typowym przykładem heteroplazmii (wstępowanie więcej niż jednego haplotypu u jednego osobnika)

Komórki somatyczne -> kilkaset cząsteczek modna (średnio po pięć na jedno mitochondrium)

- Homoplazmia - wszystkie modna są dokładnie takie same

- Heteroplazmia - Mieszanina róznych modna

Mechanizm heteroplazmii

• Podczas podziału komórki rozdział mitochondriów między komórki potomne ma charakter przypadkowy

• Skutkiem takiej biernej segregacji może być znaczne zróżnicowanie komórek potomnych pod względem proporcji zmienionych mitochondriów między:

- różnymi tkankami 1 osoby

- między osobami z mutacją należącymi do tej samej rodziny

* Sekwencja DNA obecnego w mitochondriach ludzkich - znana od lat 80

* DNA ten jest dwuniciową, kolistą cząsteczką złożoną zaledwie z 16 569 par zasad, w której jest zapisana informacja o 37 genach:

• 13 z około 80 białek biorących udział w procesie fosforylacji oksydacyjnej (kompleks I, III, IV i V; kompleks II nie zawiera peptydów kodowanych w mtDNA)

• 22 rodzajach tRNA biorących udział w syntezie tych 13 białek na rybosomach mitochondrialnych,

• 2 rodzajach cząsteczek rybosomowego RNA - 12S w małej i 16S w dużej podjednostce rybosomowej

- mitochondria komórek ssaczych - zbudowane z około 1000 białek

- jedynie 13 z nich - kodowane w genomie mitochondrialnym

- inne białka mitochondrialne są kodowane w genomie jądrowym, syntetyzowane w cytoplazmie i importowane do mitochondriów

Przyczyny częstego wykorzystania markerów modna w badaniach genetycznych:

* łatwe do analizy - genom mitochondrialny ma niewielkie rozmiary, co w połączeniu z konserwatywnym układem genów umożliwia opracowanie uniwersalnych starterów, amplifikujących różne fragmenty modna u wielu kręgowców i bezkręgowców

- bardzo często udaje się uzyskać informacje genetyczne bez wcześniejszej wiedzy o sekwencji modna danego gatunku

* mimo konsekwentnego układu genów - duże tempo mutacji

* w przypadku modna ssaków tempo podstawień synonimicznych szacuje się na 5,7x10^-8 podstawienia na pozycję na rok

- tempo podstawień synonimicznych w jądrowych genach kodujących białka jest mniej więcej dziesięciokrotnie mniejsze

* brak rekombinacji - potomstwo ma zazwyczaj (pomijając mutacje) dokładnie taki sam genom mitochondrialny jak matka. W efekcie mtDNA jest pojedynczym haplotypem, przekazywanym przez matkę na dzieci. Dzięki temu mitochondrialne linie genealogiczne mogą być łatwiej odtworzone niż genologie DNA jądrowego.

Cechy charakterystyczne genomu mitochondrialnego

• Czasteczka kolista u większości organizmów - genomy mitochondrialne niektórych organizmów eukariotycznych (np. Paramecium, Chlamydomonas i szeregu drożdży) są zawsze liniowe

• Geny mitochondrialne nie zawierają intronów

• Brak w niektórych genach kodonów „stop”

• Transkrypcji podlegają obie nici kolistego DNA, a niektóre geny nawet nakładają się na siebie (niektóre nukleotydy pełnią podwójną rolę jako ostatnia zasada jednego genu i pierwsza zasada następnego)

• Brak sekwencji rozdzielających geny (ang. spacers), których rolę pełnią geny tRNA, występujące na końcach prawie każdej sekwencji genu. Jedyną niekodującą sekwencją w mtDNA człowieka jest pętla D (ang. Displacement loop; ok. 1000 pz), zawierająca sygnał rozpoczęcia replikacji nici ………………promotory transkrypcji nici H i L.

Mitochondrialny DNA u ssaków ewoluuje kilkakrotnie szybciej niż DNA jądrowy mimo to, że mtDNA jest obecny w wielu kopiach w każdej komórce.

Przyczyny:

• Niesprawny aparat naprawiający uszkodzony mtDNA

• Nie jest on chroniony przez chromatynę (brak białek histonowych)

• Powstanie wolnych rodników w czasie procesów utleniania (mogą powodować uszkodzenia DNA)

Zwiększona akumulacja somatycznych mutacji mtDNA występuje:

• W starzejących się tkankach

• W wielu stanach chorobowych (schorzenia neurologiczne, metaboliczne i towarzyszące procesowi starzenia się)

• Częste w stanach przed nowotworowych oraz w rakach: piersi, jajnika, jelita grubego, żołądka, wątroby, przełyku, gruczołu krokowego i tarczycy

Sugeruje się iż mutacje mtDNA mogą służyć jako biomarkery chorób: w tym chorób nowotworowych a także jako czynniki predykcyjne przebiegu choroby

Termin „choroba mitochondrialna”

• Stosowany jest w odniesieniu do dysfunkcji łańcucha oddechowego

• Został wyodrębniony w patologi człowieka na przełomie lat 60 i 70 XX wieku.

• Pierwszy w pełni opisany przypadek pochodzi z roku 1962, gdy u chorej z zaburzeniami metabolizmu w testach biochemicznych potwierdzono bezpośredni udział mitochondriów w tych zaburzeniach, a badania mikroskopowe wykazały nieprawidłowości w budowie komórek mięśniowych, oraz zmiany strukturalne mitochondriów.

Rok 1988 - Holt i Wallace po raz pierwszy opisali choroby dziedziczone tylko w linii żeńskiej (możliwość wytłumaczenia odchylenia pewnych dziedzicznych chorób od praw mendlowskich)

Choroby mitochondrialne można podzielić na grupy, związane z :

• Defektami w jądrowym DNA

• Defektami w mitochondrialnym DNA

• Defektami w komunikowaniu się genomu jądrowego z mitochondrialnym

Segregacja mitotyczna

* Jeżeli w komórce współistnieją mitochondria posiadające prawidłowe i zmutowane mtDNA, to w czasie podziału mitotycznego są one losowo przekazywane do komórek potomnych, a zatem ich wzajemne proporcje mogą ulegać zmianom, prowadząc również do zmian fenotypu komórkowego. Ten fenomen, zwany segregacją mitotyczną, wyjaśnia między innymi w jaki sposób u pacjentów z chorobami mitochondrialnymi wraz z wiekiem chorego może zmienić się rodzaj i nasilenie objawów klinicznych.

* Większość patogennych mutacji mtDNA występuje w stanie heteroplazmi; takie mutacje homoplazmatyczne byłyby letalne

* Objawy chorób mitochondrialnych są bardzo zróżnicowane i obejmują postępujące zmiany w mózgu, mięśniach, gruczołach wydzielania wewnętrznego, narządach zmysłu (głuchota, oftalmoplegia), a heterogenne, wielosystemowe objawy kliniczne utrudniają ich nazewnictwo

Wykrywania mutacji: dorosli 50%, dzieci 5% pacjentów kwalifikowanych do badań. Pierwsza mutacja wykryta w mtDNA: mutacja w nukleotydzie 11 778- zespół Lebera. *Łącznie trzy mutacje- w nukleotydach 11 778, 3460 i 14 468, umiejscowione w genach kodujących białka kompleksu I łańcucha oddechowego, są odpowiedzialne za 90% przypadków zespołu Lebera (w populacjach europejskich). Mutacje te nie są na pewno jedyną przyczyną choroby, której przebieg i objawy kliniczne mogą się różnić między sobą. * W przypadku stwierdzenia mutacji 11 778 obserwuje się występowanie wyłącznie ślepoty albo ślepoty z dystonią. *Ta sama mutacja powoduje chorobę u 10% kobiet, ale u 50% mężczyzn. Z mutacjami w genach tRNA powodującymi MELAS i MERFF związane jest wyst. różnych objawów, ale w zasadzie żaden z nich nie jest naprawdę różnicujący.

Objawy: miopatia, MERFF(%pacjentów):70; MELAS (%pacjentów):53.

Ataksja, MERFF(%pacjentów):50; MELAS (%pacjentów):24.

Głuchota; MERFF(%pacjentów):39; MELAS (%pacjentów):44.

Jednostki chorobowe spowodowane dlecjami -brak komponenty genetycznej *zespół Keamsa-Styre'a *CPED (Progressive extermal ophthalmoplegia). Delecje w obszarze między nukleotydem 3300 i 12000 są one na ogół duże- ponad płowa to delecje od 4000 do 9000 par zasad. Cząsteczki z delecjami współistnieją w komórce z prawidłowymi cząsteczkami modna. Korelaje genotyp- fenotyp: *ze wzgl. na losową segregację mitochondrialnego DNA w każdym podziale komórkowym objawy choroby mitochondrialnej nawet w danej rodzinie mogą się różnić stopniem nasilenia lub wręcz mogą być odmienne. *uzależnione jest to od: procentu zmutowanych cząsteczek, od tego do jakich tkanek trafią większe ilości defektywnego mitochondrialnego DNA. * objawy kliniczne mogą dotyczyć w zasadzie wszystkich układów i narządów: nerwowego, mięśniowego, wątroby, szpiku kostnego, gruczołów wydzielniczych itp. * wykazanie że dana choroba dziedziczy się wyłącznie w linii matczynej, nie zawsze jest łatwe (rodziny niezbyt liczne, brak możliwości sporządzenia rodowodu) * zmiany fenotypowe na ogół stwierdza się dopiero wtedy gdy procent zmutowanych cząstek mtDNA będzie większy niż pewna wartość która jest różna dla różnych mutacji( -musi być zmutowanych ok. 95% cząst. mtDNA jeśli zmiana dotyczy genów kodujących tRNA w których wyst. tylko mutacje punktowe. -60% jeśli rodzajem defektu SA delecje) *efekty danej mutacji zal. w której tkance wystąpi najwięcej zmutowanych cząst. mtDNA *najbardziej podatne na niedobory tlenu są mózg, mięśnie szkieletowe i gruczoły wydzielnicze, ale może tez występować upośledzenie funkcji wątroby, nerek, itp. *ze wzgl. na to, że podczas podziału komórki mitochondria rozdzielają się losowo do dwóch komórek potomnych, nie zawsze brak mutacji w jednej tkance świadczy o jej nieobecności w innej *w przypadkach heteroplazmii niektóre zmutowane cząst. mtDNA mogą ulegać eliminacji w tkankach dzielących się (krew), ale nie np. w tzw. tk. postmitotycznych, takich jak mięśnie czy mózg. *wiele zaburzeń funkcjonowania mitochondriów pojawia się dopiero u osób dorosłych. U dzieci może wystąpić m.in. głuchota, najczęściej izolowana, związana z mutacją genu 12S rRNA. * mutacja ta zawsze powoduje głuchotę jeśli osobie u której wyst. poda się antybiotyki aminoglikozydowe (średni wiek utraty słuchu wynosi 5 lat). Głuchota może też wystąpić jeśli antybiotyki nie były stosowane. W takim przypadku średni wiek wystąpienia objawów jest oceniany na 20 lat. Współzależność mtDNA -DNA jądrowy: * zaburzenia funkcji mitochondriów mogą być powodowane przez mutacje w DNA jądrowym, w genach kodujących białka strukturalne lub regulacyjne obecne w mitochondriach. *dotychczas poznano niewiele mutacji jądrowych powodujących upośledzenie działania mitochondriów , choć ich liczba szybko się zwieksza. *Z zespołem Leigha są związane mutacje dwóch z przypuszczalnie kilku różnych genów jądrowych (-geny kodujące dehydrogenazę bursztynianową, -gen którego produkt bierze udział w biogenezie oksydazy cytochromu c. *niedawno wykryto mutację w genie jądrowym którego produkt bierze udział w transporcie białek do mitochondriów, w głuchocie z dystonią. *przypuszcza się że genów jądrowych związanych z funkcjonowaniem mitochondriów jest przynajmniej kilkaset. *Wymienione choroby należy zaliczyć do zaburzeń jednogenowych lub chromosomalnych. *coraz częściej uzyskujemy też dowody na związek zaburzeń mitochondrialnych z wyst. chorób wieloczynnikowych (powiązanie z procesem starzenia), *choroby nowotworowe, *choroby metaboliczne np. cukrzyca, * choroby degeneracyjne ukł. krążenia i nerwowego. Medycynę mitochondrialną dzielimy na dwa działy: *pierwszy koncentruje się na identyfikacji patogenicznych mutacji które w sposób bezpośredni odpowiadają za wyst. dysfunkcji łańcucha oddechowego i związanej z tym choroby. *drugi wynika z założeń: -że zmiany mtDNA mogą być czynnikami ryzyka w powstawaniu choroby wieloczynnikowej. -że choroba nie wynika z uszkodzenia mitochondriów ale jej rozwój prowadzi do takich zmian w funkcjonowaniu mitochondriów, że stają się one markerem choroby. Choroby nowotworowe: * hipoteza Warburga wskazuje na kluczową rolę uszkodzenia oddychania komórkowego w procesie nowotworzenia, *wszelkie defekty łańcucha oddechowego mogą wiązać się z tworzeniem wolnych rodników, *wzmożona produkcja wolnych rodników w komórkach nowotworowych, *występowanie mutacji mtDNA w raku piersi, gruczołu krokowego, jelita grubego, żołądka, przełyku, wątroby, jajnika, tarczycy i w białaczkach. Choroby neurodegeneracyjne: *tworzą hetrognną grupę zaburzeń wrodzonych lub nabytych, charakteryzującą się stopniowym i selektywnym uszkodzeniem ukł. nerwowego w następstwie utraty neuronów (choroba Alzheimera i Parkinsona), *wiele publikacji wskazuje na istotna rolę zaburzeń mitochondrialnych jak tez genów jądrowych związanych z funkcjonowaniem mitochondriów w procesie obumierania i zanikania komórek nerwowych. Choroby układu krążenia: *reakcje wolnorodnikowe mają znaczący wpływ na rozwój chorób układu sercowo-naczyniowego co sugeruje potencjalne znaczenie zaburzeń mitochondrialnych, *w mitochondriach mięśnia sercowego ważna jest ich rola w zachowaniu homeostazy jonów Ca ²⁺. Uszkodzeniom w niedokrwieniu /reperfuzji towarzyszy zwiększenie zaw. Jonów Ca ²⁺ w mitochondriach, mogące prowadzić do ich dysfunkcji a nawet śmierci komórki. Diagnostyka chorób mitochondrialnych: *Badania są prowadzone na (-DNA izolowanym z krwi obwodowej, -bioptatów mięśni). *dla NARP uzyskuje się właściwą zgodnośc wyników niezależnie od tkanki z której izolowano DNA. *Przy wskazaniach w kierunku MELAS czasem mutacje udaje się zidentyfikować tylko w DNA izolowanym z mięśni a nie udaje się gdy DNA jest izolowany z krwi obwodowej. Wyniki te są konsekwencją losowej segregacji cząst. mtDNA . W czasie podziałów komórki liczba zmutowanych cząst. mitochondrialnego DNA nie zawsze jest identyczna we wszystkich tkankach. *bada się całkowity DNA, nie izoluje się DNA mitochondrialnego. *specyficzność badania jest uzależniona od zastosowanych starterów w metodzie opartej na PCR lub sond w przypadku hybrydyzacji. *co prawda w jądrowym DNA obecne są tzw. pseudogeny, będące odpowiednikami niektórych sekwencji mtDNA, ale na ogół nie stwierdza się interferacji podczas badań …stycznych. *brak wykrycia zmian mtDNA (dalsze podejrzenie mutacji mtDNA) >przeprowadzenie dalszych badań> ustalenie czy defekt u pacjenta jest powodowany przez mutację jądrową czy mitochondrialną> linie komórek ludzkich tzw. rho zero, nie mające mitochondrialnego DNA> pirogronian i urydyna niezbędna do wzrostu w hodowlach in vitro> fuzja komórek rho zero z płytkami krwi pacjenta (nie zawierają jądra komórkowego, ale zawierają mtDNA) lub z jego fibroblastami pozbawionymi jader. Co prowadzi do po pierwsze: wzrostu hodowli na pożywce bez urydyny i pirogronianu świadczy, że defekt ma charakter mutacji genu jądrowego. Po drugie: potrzeby wzrostu hodowli obu skł. wskazuje na defekt mitochondrialnego DNA. Diagnostyka chorób mitochondrialnych cd.: jeśli stwierdzi się, że defekt wyst. w mtDNA jest możliwa jego lokalizacja np. za pomocą techniki SSCP a następnie sekwencjonowania konkretnego fragm. DNA. *prawdopodobnie już niebawem będą dostępne handlowo tzw. mikroprocesory DNA które umożliwiają szybkie i proste (choć nie tanie) wykrywanie mutacji w mtDNA. *warto pamiętać, że cały ten genom jest mniejszy od wielu ludzkich genów jądrowych. * brak znanych sposobów leczenia większości chorób mitochondrialnych. * wykazano niedawno, że jest możliwe zmuszanie mitochondriów do importu cząst. tRNA które znoszą defekty powodowane przez mutację w gnie tRNA. *perspekywy są obiecujące ale droga od komórki in vitro do żywego organizmu jest bardzo długa a nawet może się okazać nie do pokonania.

Wykorzystanie metod biologii molekularnej w ekologii. Identyfikacja gatunkowa:

-trudna na podstawie obserwacji: rozróżnianie odchodów na podstawie ich cech morfologicznych - oznaczanie odchodów

-kun i lisów - mylne zidentyfikowanie 18% prób pochodzących z terenów o stosunkowo wysokim zagęszczeniu kun oraz aż 97% prób pochodzących z terenów, gdzie zagęszczenie kun było bardzo niskie

- wilk-pies-kojot wydra-norka-tchórz

-puma-ryś jaguar-puma-ocelot

-wiarygodne rozróżnienie śladów pozostawionych przez różne gatunki zwierząt (PCR, mikrosatelity, mtDNA, RFLP, sekwencjonowanie)

Identyfikacja osobnicza:

- w przypadku materiału zwierzęcego zbieranego w sposób nieinwazyjny (odchody, sierść, pióra itd.) ważne jest rozróżnienie prób pochodzących od różnych osobników

*szacowanie liczby populacji

*badanie migracji

-zestaw markerów mikrosatelitarnych - wysokie prawdopodobieństwo, że każdy osobnik będzie się charakteryzował unikalnym genotypem

liczebność populacji:

-rzadkie lub prowadzące skryty tryb życia gatunki zwierząt, bezpośrednie policzenie osobników rzadko jest możliwe

-ocena liczebności populacji na podstawie analizy DNA z odchodów (bądź innych pozostawionych przez zwierzęta śladów, np. sierści czy piór)

*zbieranie odchodów ok. 2 tyg.

*identyfikacja gatunkowa, umożliwiająca odrzucenie odchodów, którym mylnie przypisano pochodzenie do danego gatunku)

*analiza sekwencji mikrosatelitarnych

-przestrzenne rozmieszczenie odchodów pozwala na wnioskowanie o sposobie użytkowania przestrzeni przez badany gatunek

-możliwość przypisania odchodów konkretnemu osobnikowi umożliwia przybliżone wyznaczenie areałów poszczególnych osobników bądź areałów poszczególnych grup.

Genetyczny ratunek:

-osobniki przenoszone z jednej populacji do innej często są źródłem nowych alleli - takie zjawisko może prowadzić do redukcji poziomu depresji inbredowej - genetyczny ratunek

-zjawisko to tłumaczy się heterozją - zwiększonym poziomem dostosowania potomstwa, pochodzącego po rodzicach różniących się pod względem genetycznym (wigor, wybujałość mieszańców, bujność) - efekt maskowania szkodliwych alleli.

Genetyczny ratunek - ratunek przed zagładą:

-populacja pumy z Florydy - wielkość populacji 25 osobników - zmienność gentyczna (markery mikrosatelitarne) znacznie mniejsza niż pozostałych północnoamerykańskich podgatunków

-utrwalone cechy szkodliwe (zakrzywiony ogon, słaba jakość nasienia, jednostronne wnętrostwo)

-1995 r - introdukcja kuguarów z Teksasu - z 8 przetrwały 4 - ale również 25 mieszańców

-wzrost liczebności populacji do 70 osobników

- znaczne zmniejszenie cech szkodliwych u mieszańców.

Identyfikacja płci

- zbyt duże odchylenie od oczekiwanej proporcji płci (znanej z wcześniejszych badań przeprowadzonych dla interesującego nas gatunku), może świadczyć o tym że próba nie jest reprezentatywna

-również przy wyznaczaniu areałów osobniczych dobrze jest znać płeć poszczególnych osobników, ze względu występujące u wielu gatunków różnice w wielkości areałów samców i samic.

- bezpośrednie określenie płci na podstawie materiałów tj pióra, sierść czy odchody zazwyczaj jest niemożliwe

-z problemem oznaczenia przynalezności płciowej możemy mieć do czynienia również w przypadku gatunków zwierząt, u których nie występuje wyraźny dymorfizm płciowy i oznaczanie płci na podstawie cech morfologicznych jest trudne lub nawet niemożliwe, występuje to m.in. w przypadku wielu gatunków ptaków, szczególnie trudne jest rozróżnienie płci u piskląt.

- oznaczanie płci metodami molekularnymi możliwe jest tylko w przypadku organizmów u których płec jest determinowana genetycznie. U krokodyli, żółwi, niektórych gatunków jaszczurek oraz ryb płeć jest determinowana przez środowisko i nie można u nich znaleść markerów DNA umożliwiających ich identyfikację

-u ptaków i ssaków płec jest determinowana przez geny, a w obrębie każdej grupy system tej determinacji jest jednolity.

Identyfikacji płci u ptaków(ZW/ZZ):

-gen CHD 1 zlokalizowany w chromosomach płci

-gen CHD 1-W znajduje się w chromosomie W i jest charakterystyczny dla samicy

-gen CHD 1-Z zlokalizowany jest w chromosomie Z i występuje zarówno u samców jak i u samic.

Identyfikacja płci u ssaków:

-gen SRY położony w chromosomie Y oraz gen Sox3 położony w chromosomie X

gen ZFY połozony w chrom Y oraz gen ZFX położony w chromosomie X

-gen AMGY położony w chromosomie Y oraz gen AMG połozony w chromosomie X

-u ssaków coraz powszechniej stosowaną metodą jest analiza sekwencji mikrosatelitarnych leżących w chromosomie Y, co pozwala nie tylko na identyfikację płci, lecz także na badanie polimorfizmu samców oraz pokrewieństwa w linii męskiej.

Badanie migracji:

-genotypowanie osobników metodą analizy mikrosatelitów - test przypisania polegający na tym że każdy osobnik zostaję przyporządkowany do populacji, do której jest najbardziej podobny pod względem genetycznym

-osobniki przypisane do innej populacji niż ta w której zostały znalezione uznawane są za migrantów

-ułamek osobników z jednej populacji który został przypisany do drugiej populacji jest wskaźnikiem tempa migracji między tymi dwoma populacjami.

Ustalenie pokrewieństwa między osobnikami:

-metody molekularne są często jedyną wiarygodną metoda oznaczania pokrewieństwa między osobnikami, wskazują też że ustalenie pokrewieństwa w szczególności ojcostwa, na podstawie obserwacji behawioralnych może być mylące

-przepisywanie osobnikom w populacji najbardziej prawdopodobnych rodziców

-określenie stopnia pokrewieństwa między poszczególnymi osobnikami, do ustalania pokrewieństwa stosuje się zestawy kilku - kilkunastu markerów (sekwencje mikrosatelitarne) o wysokim polimorfizmie w obrębie populacji.

Zasada potwierdzenia ojcostwa na podstawie danych uzyskanych z badania pojedynczego markera STR w automatycznym analizatorze genetycznym. Potomek BB, matka AB, domniemany ojciec BB - potwierdzone ojcostwo.

Zasada wykluczenia ojcostwa na podstawie danych uzyskanych z badania pojedynczego markera STR w automatycznym analizatorze genetycznym. Potomek BB, matka AB, domniemany ojciec CD - wykluczone ojcostwo.

MIĘDZYNARODOWE TOWARZYSTWO GENETYKI ZWIERZĄT:

-międzynarodowe testy porównawcze

- Polska

*Instytut Zootechniki, Balice k/Krakowa (bydło, świnie, konie)

*Zakład Hodowli Koni AR w Poznaniu (konie)

*IGHZ PAN w Jastrzębcu (konie).

Kontrola pochodzenia wykorzystująca markery mikrosatelitarne obejmuje (ISAG): bydło, koni, owce, kozy, świnie, psy, koty, jeleniowate, wielbłądowate. Przesłanki przemawiające za kontrolą są różne ale zawsze spowodowane są przez czynnik finansowy.

-BLAD-ścisły związek przyczynowy i funkcjonalny z dysfunkcją ludzkich leukocytów określaną jako LAD-leukocyte adhesjon deficiency

-analogia etiologii BLAD bydła i CLAD - defekt niedoboru adhezji leukocytów psów

Gen ITGB2 psów

-koduje glikoproteinę-b-2 integrynę (cd18)

-transwersja G--> C w pozycji 107 genu prowadzi do zastąpienia cysteiny seryną w pozycji 36 polipeptydu (C36S) i wykazuje całkowity związek z wystąpieniem choroby

niedobór syntezy urydyno-monofosforanowej u bydła - DUMPS - wczesna obumieralność zarodkó w DUMPS - wykryta w 1988 w USA -jest przyczyną zamierania zarodków, zmniejszenie płodności krów

DUMPS-mutacja genu syntezy urdynomonofosforanowej (genu UMPS)

-mutacja typu nonsens (mutacja stop) na skutek tranzycji lub transfersji kodon dla jakiegoś aminokwasu zostaje zmieniony na jeden z trzech kodonów nonsensowych-amber (UAG) ochrę (UAA) lub opal (UGA), które nie kodują aminokwasów, które stanowią sygnał zakończenia translacji. Wynikiem tej mutacji jest zmiana długości polipeptydu kodowanego przez dany gen, powstaje krótszy Nkońcowy fragment tego polipeptydu

-zmiana cytozyny na tyminę w 405kodonie genu syntezy urdynomonofosforanowej (zmutowane allel genu UMPS), czego następstwem jest zmiana kodonu CGA (dla argininy) na kodon TGA kończący translację białka

-następstwem trgo jest skrócenie łańcucha polipeptydowego i utrata przez enzym funkcji katalitycznej

-niedobór aktywnego enzymu, będący autosomalną cechą recesywną jest przyczyną nie..... syntezy RNA

przyczyna nieprawidłowej syntezy RNA - niedobór aktywnego enzymu (bydło rasy holsztyńsko-fryzyjskiej):

-homozygota zmutowanego genu syntezy UMPS - zamierają ok 40 dnia ciąży

-heterozygota zmutowanego genu syntesy UMPS - fenotypowo prawidłowe lecz aktywność enzymu w różnych tkankach jest u nich o połowę mniejsza niż u homozygot genu prawidłowego

mutacja punktowa C-->T powoduje utratę miejsca restrykcyjnego dla endonukleazy co umożliwia różnicowanie prawidłowych genotypów i heterozygot. W wyniku rozdziału elektroforetycznego produktów powielania fragmentu genu obejmującego kodon 405, trawionych enzymem aval, obserwuje się dwa prążki o długościach 53 i 36pz, w przypadku zwierząt nie obciążonych mutacjią, i 3 prążki 89, 53, 36pz u heterozygot.

-nie zidentywikowano dotychczas homozygot DUMPS. W tym przypadku w żelu obserwowano 1 prążek 89pz, ze względu na utratę miejsca restrykcyjnego dla enzymu aval w zmutowanym genie

CYTRULINEMIA-niedobór syntezy argininobursztynianowej u bydła.

-recesywna, autosomalna wada metaboliczna

-dziedziczna nieprawidłowość przebiegu cyklumocznikowego, spowodowane niedoborem syntezy argininobursztynianowej

-została zidentyfikowana początkowo jedynie u człowiek, aktualnie wiadomo że występuje równioeż u bydła rasy holsztyńsko-fryzyjskiej

-objawia się hiperamonemią spowodowanę przez przerwę w cyklu mocznikowym

-bez odpowiedniego leczenia nastęuje śpiączka i śmierć osobników

OBJAWY:

-nadmierne wydzielanie spienionej śliny

-język wystający z jamy ustnej

-chwiejny chód

-utrata orientacji

-udeżanie głową o przeszkody

-śmierć w ciągu 3-5 dni

HIPERTROFIA MIĘŚNIOWA PSÓW

*Dwu-nukleotydowa delecja w trzecim eksonie genu MSTN (cysstop),

*Mutacja ta powodowała podwójne umięśnienie chartów wyścigowych („bully whippets”),

*Psy heterozygotyczne pod względem wystąpienia mutacji charakteryzowały się bardziej muskularnym umięśnieniem w porównaniu z psami, u których nie odnotowano zmutowanych alleli i są jednymi z najszybszych w konkurencjach wyścigowych,

*Psy homozygotyczne „bully whippets” pod względem mutacji genu cechowała najwyższa masa ciała.

Mutacja genu MSTN -mutacja jest odpowiedzialna za utworzenie dodatkowego miejsca docelowego (target site) dla mikrona (miRNA) w 3'UTR, blokującego transkrypty MSTN, ulegające kompresji w mięśniach.

SKRÓCENIE KRĘGOSŁUPA -gen SLC35A3

Skrócenie kręgosłupa -cecha autosomalna recesywna, letalna u bydła i indyków; u bydła mlecznego -formą tej wady jest wrodzone zniekształcenie kręgów (CVM complex vertebral malformation) opisany u bydła duńskiego po raz pierwszy w 2001r. u psów cecha nie jest letalna.

Wrodzone zniekształcenie kręgów -CVM:

*niekształcenie kręgów, skolioza, fuzja odcinka kilku żeber,

*mutacje w genie SLC35A3,

*w układzie homozygotycznym -martwe urodzenia płodów,

*występuje z dużą częstością w polskiej populacji bydła czarno białego,

*badania prowadzone w populacji buhajów wycenionych -14% osobników- nosiciele zmutowanego allelu genu SLC35A3,

*w katalogu buhajów należących do Stacji Hodowli i Unasieniania w Bydgoszczy jest już zamieszczona informacja o genotypie SLC35A3.

Skrócenie kręgosłupa u psów:

*suki rozmnażają się prawidłowo, ze względu na zmieniony sposób siedzenia suki te nazywane są „pawianowatymi”,

*samce prawdopodobnie nie osiągają dojrzałości, możliwe więc, że jest to cecha letalna dla jednej płci,

*szczenięta obarczone tą wadą cechuje mniejsza żywotność, bezpośrednio po urodzeniu można je rozpoznać po skróconym ogonie.

Postępujący zanik siatkówki psów (PRA -Progressive Retinal Atrophy):

*jest wspólnym terminem wykorzystywanym do opisania szeregu wrodzonych degeneracji siatkówki,

*ślepota zmierzchowa ślepota całkowita ślepota wtórna,

*cecha autosomalna recesywna -mutacja w podjednostce cGMP(?)

*wyjątek -rasa Syberian Husky -cecha sprzężona z chromosomem X,

*wyjątek rasa Bullmastiff -autosomalna dominująca.

Achondroplazja (chondro dysplazja, chondro dystrofia) -mutacja w genie receptora czynnika wzrostu fibroblastów FGFR3: *owca, bydło, *człowiek.

Zespół pajęczy owiec SLS (spiker syndrome):

• w układzie heterozygotycznym -delikatna budowa kośćca.

• allel zmutowany w układzie homozygotycznym -kątowa deformacja kończyn,

• deformacja grzbietu żeber i mostka,

• deformacja części pyskowej (garbaty nos)

U owiec niektórych ras mięsnych (suffolk, Hampshire) w Stanach Zjednoczonych w latach 80' pojawiła się wada budowy kośćca. Jest ona wynikiem mutacji (trans wersja adeniny na tyminę, której następstwem jest zmiana aminokwasu waliny na kwas glutaminowy w pozycji 700 łańcucha polipeptydowego) w genie receptora czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR3).

Objawy kliniczne:

• deformacja nóg -długie, wygięte na boki (jak nogi pająka) kończyny, czasem bardzo cienkie;

• skolioza albo kifoza kręgosłupa -skręcone nogi,

• nienaturalnie długa szyja,

• deformacja czaszki,

• czasami występuje rzadkie futro, jakby owca urodziła się zbyt wcześnie.

Śmiertelność wśród jagniąt dotkniętych zespołem pajęczym jest bardzo wysoka, a u tych, które przeżyły, stwierdza się osłabione zdolności rozrodcze, a nawet niepłodność.

Gen receptora czynnika wzrostu (FGFR3), ścieżki:

*2 i 3 -genotyp FGFR3^sls/+ (132/112pz),

*4 i 5 -genotyp normalny FGFR3^+/+ (132pz)

*6 -147 pz -bez cięcia Xhol

Mutacja homologu genu FGFR3 w genomie człowieka:

*Achondroplazja

*Dysplazja tabatoforyczna

Achondroplazja u bydła: zahamowanie rozwoju układu kostnego, poronienie przed 8 miesiącem ciąży.

Achondroplazja u człowieka: nieprawidłowe kostnienie śródchrzęstne (zaburzenie rozwoju kości), karłowatość (wzrost 100-140cm). Nieproporcjonalna budowa ciała tj. duża czaszka, skrócone kończyny, zniekształcony kręgosłup.

Dysplazja tabatoforyczna -ciężki zespół wad wrodzonych tj. krótkie kończyny i palce, wąska długa klatka piersiowa, nieproporcjonalnie duża głowa, krótka szyja. Czaszka kształtu trójlistnej koniczyny, dłonie trójzębne.

CHOROBY GENETYCZNE KONI

1.Hyperkalemic Periodic Paralysis (HYPP) Disease -okresowy paraliż koni

Konie „quarter” (wyścigowe) -najistotniejszą cechą charakteryzującą te konie jest ich odpowiednia muskulatura. Jeden ogier ze szczególnie dobrze rozwiniętą muskulaturą stał sie protoplastą 2,9 miliona koni „quarter” zarejestrowanych w Stanach Zjednoczonych. Wraz z rosnącą popularnością tego ogiera jako reproduktora wzrosła częstotliwość występowania paraliżu towarzysząca nagłemu wzrostowi stężenia … krwi -HYPP.

Etologia HYPP -zwiększone stężenie potasu w surowicy krwi i nieprawidłowy potencjał błonowy. Czynniki -różnego rodzaju stresory lub niska temperatura, zmiany w diecie, głód, podanie paszy z dużą zawartością potasu.

Przyczyna HYPP:

* Mutacja w genie kanału sodowego komórek mięśniowych, polegające na trans wersji C→G w transbłonowej domenie podjednostki α genu kanału sodowego,

* Zmiana fenyloalaniny na leucynę w regionie między 1358-1514 aminokwasem w białku,

* Mutacja HYPP dziedziczy się z niezupełną dominacją, u koni homozygotycznych objawy są silniejsze niż u heterozygotycznych.

Objawy HYPP - dziedziczna autosomalna cecha dominująca, ataki drżenia mięśni i paraliżu występują po:

*Zmianie diety,

*Okresie głodzenia,

*Zadziałaniu czynnika stresogennego,

*Spożycia siana z lucerny bogatego w potas.

HYPP:

*Występuje u koni cennych pod względem wartości genetycznej, dobrze umięśnionych,

*Selekcja koni na podstawie wyników gonitw na torze wyścigowym może prowadzić do wzrostu frekwencji tego niekorzystnego allelu;

*Diagnostyka molekularna nosiciela zmutowanego allelu prowadzona jest za pomocą metody PCR-RFLP z zastosowaniem enzymu restrykcyjnego TagI

Zespół SCID -ciężki złożony brak odporności koni

Zespół SCID -ciężki złożony niedobór immunologiczny, ciężki złożony brak odporności. SCID to choroba genetyczna, która wynika z braku aktywności limfocytów T i B -głównych komórek układu odpornościowego -załamanie się układu odpornościowego. Nieprawidłowe limfocyty nie atakują bakterii i wirusów, dlatego konie chore na SCID są bardzo podatne na zakażenia. Najczęściej źrebięta o genotypie homozygoty recesywnej padają wkrótce po urodzeniu z powodu różnorodnych infekcji (które dla zdrowych osobników były zupełnie niegroźne).

Choroba genetyczna wywołana mutacją polegającą na delecji 5 nukleotydów w genie kodującym katalityczną podjednostkę kinazy białkowej zależnej od DNA (DNA-PK). Objawem choroby są częste, ciężkie infekcje występujące od urodzenia. Dziedziczony jest jako autosomalna cecha recesywna.

SCID -ciężki złożony niedobór odporności

Mutację tę stwierdzono u koni czystej krwi arabskiej hodowanych w USA, natomiast badania przeprowadzone w Polsce wykazały, że nie występuje ona w polskiej populacji koni arabskich.

HERDA -Hyperelastosis Curtis

*Choroba skóry o charakterze degeneracyjnym,

*Dotyczy koni rasy Quarter Horse,

*Nosicielstwo recesywnie dziedzicznej mutacji odpowiedzialnej za tę chorobę kształtuje się na poziomie ok.1,8-6,5%.

*Źrebięta przychodzą na świat zwykle bez objawów choroby,

*Obszary skóry, na których później pojawią się uszkodzenia, tworzą skupiska i są rozmieszczone na ciele nierównomiernie,

*Choroba atakuje głównie grzbiet (stwierdzona zostaje często dopiero w momencie, gdy koń ma zacząć jeździć pod siodłem, tj. mniej więcej w wieku 2lat).

*Skóra koni dotkniętych schorzeniem jest bardzo rozciągliwa, podatna na zbliznowacenia i często wykazuje poważne uszkodzenia,

*Często obserwuje się również surowicza ki i krwiaki,

*Badania histologiczne były w stanie jedynie w sporadycznych przypadkach wskazać na obecność choroby, ale nie umożliwiały jej zdiagnozowania.

GBED (glycogen branching enzyme deficiency) -choroba spichrzeniowa glikogenu typu IV

*Test genetyczny -GBE

*Mutacja występuje u koni Quarter Horse, Paint Horse oraz w liniach pokrewnych,

*Częstotliwość jej występowania kształtuje się na poziomie ok10%. Przypuszcza się, że GBED jest przyczyną co najmniej 3% poronień u koni Quarter Horse,

*U źrebiąt dotkniętych tą chorobą nie występuje GBE, czyli enzym odpowiedzialny za prawidłową syntezę i magazynowanie glikogenu.

*Choroba atakuje głównie tkankę mięśni szkieletowych, mięśnia sercowego oraz mózg.

Diagnostyka molekularna wybranych immunologicznych chorób genetycznych zwierząt hodowlanych i człowieka- genomika porównawcza.

Rodzaje mutacji:

*Genomowe

*Chromosomowe

*Genowe- Dotyczą zmian w budowie genu:

- Choroby monogenowe- mutacje dotyczące zmian w budowie jednego genu

-Choroby kompleksowe- mutacje dotyczące kilku genów + czynniki srodowiskowe

Identyfikacja mutacji niektórych genów zwierząt za pomocą metody PCR-RFLP i in.

*Gen wrażliwości świń na stres (RYR1)

*Choroba obrzękowa (Futl, Futl2)

*Upośledzenie adhezji leukocytów u bydła (BLAD) i psa (CLAD)

*Niedobór syntetazy urydynomonofosforanowej u bydła

*Niedobór syntetazy argininobursztynowej u bydła

*Hypertrofia mięśniowa

*Spider Lamb Syndrome u owiec

*Okresowy paraliż u koni

*Ciężki złożony niedobór immunologiczny u koni

Hipetermia (gorączka) złośliwa (wrażliwość świń na stres)

*Gen RYR1 jest najlepiej poznanym genem o dużym efekcie u trzody chlewnej

*W wyniku działania tego genu zwiększa się podatność świń na stres

*Miopatia stresowa- pogorszenie się jakości mięsa

-Pozytywny wynik testu halotanowego u osobników o genotypie HALn/HALn:

1. Usztywnienia kończyn

2. Wzrost temperatury

Miopatia stresowa- pogorszenie się jakości mięsa

*Test PCR-RFLP pozwala różnicować genotypy w odniesieniu do prawidłowości struktury genu receptora ryanodiny, czyli mutacji 1843 genu RYR1

*Produkt PCR o długości 74pz.

*Po trawieniu enzym HinPI identyfikuje się dwa prążki o długości 41 i 33 pz u homozygot, HALn/HALn jeden prążek 74 pz u homozygot HALn/HALn i trzy prążki 74 pz, 41pz, i 33pz u heterozygot

*Znajomość genotypu HAL umożliwia odpowiedni dobór kojarzonych zwierząt, tak by otrzymane potomstwo było odporne na stres

Zespół objawów gorączki złośliwej u człowieka:

*Gorączka, Wzrost napięcia mięśni, Nadciśnienie, częstoskurcz

Gorączka złośliwa człowieka w Polsce:

*Śmiertelność przekraczająca 50%

*Mała dostępność testów genetycznych

*Niedoskonałości monitorowania

*Mała dostępność preparatu Dantrolen- jedynego leku, który przerywa napad hipotermii złośliwej

BLAD:

*Mutacja typu zmiany sensu- na skutek tranzycji lub transwersji kodon dla jakiegoś aminokwasu zostaje zamieniony na kodon dla innego aminokwasu

*Kodon GAU dla kwasu asparaginowego w wyniku tranzycji A-G zmieniony na kodon GGU kodujący glicynę

Ze względu na szeroki import bydła holsztyńsko-fryzyjskiego z USA, mutacja BLAD występuje również w Europie z częstością oddziałującą na wyniki hodowli.

Klasa II

Klasa I

Klasa III

---