SPRAWOZDANIE ĆW.3.

Tomasz Koliński, gr.2.

Przygotowanie mieszaniny ligacyjnej

1. Do jałowej probówki Eppendorfa dodano kolejno:

• 2 μl DNA plazmidu pCattTrE18 przeciętego dwoma enzymami restrykcyjnymi

• 6 μl tzw. „wstawki” czyli fragmentu DNA (gen rIII bakteriofaga T4) amplifikowanego na poprzednich zajęciach i trawionego tymi samymi enzymami co plazmid

• 1 μl buforu ligacyjnego stężonego 10x; bufor zawiera ATP - kofaktor ligazy DNA faga T4.

• 1 μl ligazy DNA faga T4 (1 jednostka) - enzym ten łączy nici DNA (w tym wypadku plazmid ze „wstawką”), tworząc wiązania fosfodiestrowe

2. Zawartość probówki dokładnie wymieszano

3. Probówkę inkubowano w temperaturze 22°C przez godzinę

Przygotowanie komórek kompetentnych metodą chlorkową

Komórki kompetentne to komórki bakterii zdolne do pobrania DNA egzogennego (pochodzącego ze środowiska). Stan kompetencji można uzyskać na kilka sposobów m.in. metodą chemiczną - przy użyciu dwuwartościowych jonów, np. wapnia. Jony te niwelują ujemne ładunki DNA i komórki, co pozwala im zbliżyć się do siebie.

Ten etap został wykonany wcześniej, przez Prowadzącego ćwiczenia; użyty szczep: E. coli DH5α.

Transformacja bakterii zrekombinowanym DNA

1. Do probówki Eppenorfa dodano 200 μl komórek kompetentnych oraz 10 μl mieszaniny ligacyjnej, delikatnie przepipetowano. Równocześnie przygotowano probówkę kontrolną zawierającą tylko 200 μl komórek kompetentnych.

2. Inkubować próbki w lodzie przez minimum 30 minut. W niskiej temperaturze zachodzi krystalizacja błon komórkowych i być może rónież LPS, co stabilizuje strefy adhezji (złącza Bayera); może to ułatwić przyłączenie DNA do komórki.

3. Przeniesiono próbki na 3 minuty do 43°C - heat shock. Wysoka temperatura umożliwia przedostanie się kwasu nukleinowego do komórki (zachodzi topnienie błon komórkowych) i zwiększa wydajność transformacji ok. 10-krotnie

4. Przeniesiono próbki na 3 minuty do lodu - cold shock (aby ochłodzić próbki)

5. Dodano 1 ml pożywki LB (bez antybiotyku) i hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 37°C przez minimum 45 minut (max. 60 minut). Na tym etapie nie użyto jeszze antybiotyku aby „dać czas” na wytworzenie mechanizmów uodparniających bakterie na antybiotyk, który był użyty później.

6. Zwirowano próbki - 10 min. przy 4 tyś. obr./min. Osad zawieszono w małej ilości supernatantu

7. Na wysuszone płytki LA z chloramfenikolem przeniesiono ok. 100μl hodowli i delikatnie rozprowadzono używając jałowej głaszczki . Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Uzyskano wzrost transformantów, co przedstawia poniższe zdjęcie:

Policzono wydajność transformacji: ilość transformantów/mikrogramy DNA użytego do transformacji.

Wydajność ta wyniosła 458/0,3 = 1526,6(6)

Wniosek: zaszła transformacja plazmidem pCattTrE18, który niesie oporność na chloramfenikol. Dlatego bakterie uzyskały odporność na ten antybiotyk i mogły żyć i namnażać się na podłożu go zawierającym.

8. Bakterie z próby kontrolnej (nie zostały poddane transformacji) nie wyrosły na płytce zawierającej chloramfenikol:

Wniosek: bakterie nietransformowane nie posiadają oporności na chloramfenikol.

---