1. Antybiotyki półsyntetyczne.

Antybiotyk - substancja pochodzenia biologicznego (gł. od grzybów i bakterii), która w małych ilościach hamuje wzrost innych drobnoustrojów.

Półsyntetyczne antybiotyki - produktem wyjściowym jest naturalny antybiotyk poddany modyfikacji

Przykłady:

I Penicylina- związek beta-laktamowy

Cechą wspólną penicylin jest obecność w ich cząsteczce kwasu 6-aminopenicylanowego (kwas 6- AP)

Kwas ten może być doskonałym materiałem wyjściowym do syntezy nowych półsyntetycznych penicylin .

W wyniku reakcji kwasu 6-AP z chlorkami lub bezwodnikami kwasów otrzymujemy półsyntetyczne antybiotyki.

Kwas 6-AP otrzymuje się na drodze chemicznej lub enzymatycznej hydrolizy penicyliny G

II Cefalosporyna: bezpośrednia biosynteza kwasu 7-AC oraz kwasu 7-ADC (7- aminodeacetoksycefalosporanowy) przez zrekombinowany szczep Penicillum chrysogenum z genami szlaku biosyntezy cefalosporyn

2.Technologia Produkcji antybiotyków

Aby rozpocząć produkcje antybiotyków należy uwzględnić:

1. skład pożywki

2. ogólne warunki fermentacji

3. właściwości fizyczne i chemiczne antybiotyków

Na poszczególne etapy składają się:

1. Wstępna hodowla wyselekcjonowanych drobnoustrojów w odpowiednich pożywkach w skali laboratoryjnej i półtechnicznej

2. Biosynteza w reaktorach przemysłowych

3. Oddzielnie biomasy

4. Oczyszczanie za pomocą procesów fizyko-chemicznych, oraz nadanie bioproduktowi wymaganej postaci farmaceutycznej

Antybiotyki:

ich produkcja następuje w fazie stacjonarnej, gdy wzrost został zahamowany. Nie są one niezbędne do przeżycia drobnoustrojów. Są metabolitami drugorzedwoywmi. Za ich synteze odpowiada wiele genów ( około 20)

3. Etapy syntezy penicyliny w fermentatorze

Przemysłowy szczep Penicilium chryzogenum hoduje się w obecności kwasu fenylooctowegoco prowadzi do wytworzenia penicyliny G; bakterie zawarte w zbiornikach fermentacyjnych z napowietrzaniem, hodowla wgłębna

• Np. w Bist-Brocadens NV w Delft 14 fermentatorów o poj. 100 tys. litrów każdy, fermentacja 200h, 14 h ekstrakcja

Po zakończeniu fermentacji hodowle przepuszcza się przez rotacyjny filtr, w celu oddzielenia grzybni od zawierającego penicylinę G płynu hodowlanego, następnie płyn pohodowlany tłoczy się do ekstraktora (ekstrakcja rozp. org. np. chloroformem).

Po dodaniu jonów K⁺otrzymuje się w rezultacie sól potasową penicyliny G o czystości 99,5%.

Enzymatyczna hydroliza penicyliny G - preparat soli potasowej penicyliny G dodaje się do hodowli bakterii wytwarzającej enzym acylazę. Enzym ten odszczepia grupę benzylowąod cząsteczki antybiotykuco powoduje powstawanie kwasu fenylooctowego (6-AP)

Kwas 6-AP + chlorki lub bezwodniki kwasowe penicylina

Zdolność do syntezy acylazy penicylinowej degradującej penicyliny do kwasu 6-AP z odszczepieniem reszty kwasowej w pozycji N6 fenyloacetynowej w penicylinie G i fenoksyacetylowej w penicylinie V wykorzystują liczne drobnoustroje:

dla hydrolizy penicyliny G - acylazy z E.coli, Bacillus megaterium

dla hydrolizy penicyliny V - acylazy z grzybów Bovista plumbea

W procesie hydrolizy mogą być stosowane całe komórki, najczęściej jednak stosuje się enzymy po ich utrwaleniu na różnych nośnikach, co pozwala na wielokrotne wykorzystanie ich lub prowadzenie transformacji metodą ciągłą.

4.Ogólny skład pożywki do biosyntezy antybiotyków.

-zródło C : glukoza,sacharoza,laktoza,skrobia

-zródło N: kazeina, hydrolizat kazeiny, namok kukurydziany, pepton, mąka sojowa,buliony mięsne itp.

-zródło mikro- i makroelementów :sole mineralne np ( NH₄)₂SO₄ , KH₂PO₄

-aktywatory : witaminy, aminokwasy

-prekursory antybiotyków np. kwas fenylooctowy ( do syntezy penicyliny)

-rozpuszczalniki

-aseptyki

-bufory (stabilizacja pH)

5. Zródła otrzymywania kwasu aminopenicylanowego(6-AP)

Kwas 6-AP stanowi podstawową część antybiotyków B-laktamowych ( np. penicyliny);

różnice miedzy poszczególnymi penicylinami wynikają z różnych łańcuchów bocznych kwasu 6-AP

(6-AP + kw fenylooctowy = penicylina G ); 6-AP wykorzystywany jest do produkcji półsyntetycznych penicylin

( 6-AP + chlorki = półsyntetyczne penicyliny). Otrzymywany jest na drodzeŁ

• syntezy chemicznej z penicyliny G ( Penicilium chrysogenum):

Penicylina G + ( CH₃)₂SiCl₂ + PCl₅ (40 C) + butanol(40 C) + woda Ⴎ kwas 6-AP

• syntezy enzymatycznej z penicyliny G lub V:

Penicylina G Ⴎ deacylacja soli potasowej ( acylaza penicylanowa z E.coli) Ⴎ kwas 6-AP

Ⴎspecyficzne odłączanie gr benzylowej( hydrolaza estrów aminokwasowych z Xanthomonas citri )

Ⴎ kwas 6-AP

6.Drobnoustroje stosowane do otrzymywania nizyny.

Nizyna jest antybiotykiem peptydowym, synetyzowana jest przez BFM z gr serologicznej N

np. Lactococcuc lactis ssp lactis. Szczepy oporne na fagi syntetyzują mało nizyny więc selekcja szczepów jest trudna

ze względu na ich wrażliwość na fagi.

Syntezę nizyny prowadzi się w hodowlach wielostopniowych:

• pozywka : mleko pełne, odtłuszczone, zregenerowane

• ( mleko zwieksza ryzyko zakazen, często stososwane inne media tj ekstrakt kukurydziany, hydrolizat kazeiny,

• KH₂PO₄, MgSO₄)

• aminokwasy, witaminy, glukoza

• 16- 18 h

• pH =6,0 -6,8

• T =28-30 ^oC

Otrzymywanie nizyny:

• Zakwaszenie do pH =2

• Wirowanie

• Chloroform, izooktanol

• Alkohol absolutny (wytrącenie nizyny)

• Osad rozpuszczany w 50^oC w HCl

• Wysalanie w NaCl

• Proszek nizyny przechowywany w T= 18-21 ^oC

7. Właściwości i zastosowanie nizyny.

Nizyna jest antybiotykiem peptydowym, synetyzowana jest przez BFM z gr serologicznej N

np. Lactococcuc lactis ssp lactis.

• Stabilna w pH niskim

• Stabilna w 121^oC przez 15-20 min

• Wąskie spektrum działania

• Hamuje rozwój : Staphylococcus, Micrococcus, Clostridium,Bacillus, Lactococcus,Lactobacillus

• Nia hamuje rozwoju : Bakterii G (-), drożdży, pleśni

• Niszczy ścianę komórkową komórek wegetatywnych

• Nie działa na przetrwalniki, ale uniemozliwia przekształcenie w formy wegetatywne

• U organizmów wyzszych trawiona przez trypsynę

• Nietoksyczna , bezpieczna dla zdrowia, produkowana w skali przemysłowej

Zastosowanie w przemyśle spożywczym:

• Konserwy owocowo- warzywne- dodatek nizyny działa antybakteryjnie na termostabilne

• Bacillus stearothermopfilus, Clostridium thermosecchadyticum i umożliwia obnizenie temp obróbki ,

• Produkcja sera- dodatek nizyny działa antybakteryjnie na Clostridium botulinum ,

• Clostridium butyricum (przetrzymują 85-105 ^oC) i zapobiega „wzdymaniu sera”

• Produkty mięsne, sery topione, mleko do produkcji sera - dodatek nizyny zapobiega rozwojowi bakterii masłowych ,

• do samego mleka nizyny się nie dodaje, a w do produkcji serów topionych stosuje się wiecej nizyny

• ( bo zawierają wiecej wody)

• Napoje i desery mleczne- dodatek nizyny zapobiega kwaśnieniu

8. SEMISYNTETYCZNE AMINOKWASY

Proces produkcji polega na syntezie chemicznej lub biologicznej prekursorów witamin. Póżniej następuje przekształcenie prekursora we właściwą witaminę na drodze biotechnologicznej lub biochemicznej.

Jeżeli pierwszy etap w tej technologii prowadzony był biologicznie to drugi etap stanowi transformację chemiczną , i odwrotnie. Przykładem jest synteza witaminy B2.

Innym przykładem jest prekursor witaminy D-RYBOZA jest wytwarzana biotechnologicznie, a następnie modyfikowana do ryboflawiny drogą chemiczną.

D-ryboza otrzymywana jest za pomocą mutantów bakterii przetrwalnikujących- Bacillus subtilis, B punilis.

9. ZNACZENIE ß- JONONU W BIOSYNTEZIE WITAMIN

Ogólnie jonony są to składniki aromatotwórcze powstałe po enzymatycznej hydrolizie karotenoidów.

Beta- jonon jest częścią łańcucha poliizoprenoidowego karotenoidów.

Beta- jonon jest toksyczny dla organizmów ale jego dodatek do podłoża w obecności olejów roślinnych stymuluje biosyntezę karotenoidów.

Beta jonon jest wykorzystywany w biosyntezie witaminy A, ponieważ z grupy karotenoidów prekursorami Wit. A mogą być tylko te zawierające pierścień beta- jonowy. Dlatego też głównym prekursorem wymienionej witaminy jest beta-karoten z którego otrzymujemy 2 cząsteczki Wit. A .

Za syntezę beta- karotenu odpowiadają drożdże Rhotodula gracilis, grzyby Blakeslea trispora czy glony Chlorophyceae czy Euglenophyceae. Hodowla w temp. 26-280c przez 48 h , na pożywkach ze skrobią, mąką sojową olejem bawełnianym. Po 48 h dodaje się BETA-JONONU, który intensyfikuje syntezę beta- karotenu, a w końcowym etapie glukozę. Całość trwa 185 godzin. Następnie jest suszenie i ekstrahowanie prowitaminy.

Dodatek beta- jononu wynosi 1,8 g/dm3.

Najważniejsze prowitaminy A:

Beta-karoten-na końcach łańcucha poliizoprenoidowego posiada cząsteczką beta- jononu.

Alfa-karoten- posiada 1 cząsteczkę beta-jonou i 1 cząsteczkę alfa jononu

Gama- karoten- posada 1 cząsteczkę beta-jononu i jedna cząsteczkę pseudojononu.

Kryptoksantyna- różni się od beta-karotenu tym ,że w jednej cząsteczce beta- jononu znajduje się grupa hydroksylowa.

Pyt. 10 Drobnoustroje stosowane do biosyntezy witaminy D

Witamina D - jedyna o budowie sterydowej, działanie przeciwkrzywiczne i wzrostowe, stosowane do wzbogacania mleka i margaryn, bo oleje roślinne nie zawierają wit.D.

Produkuje się metodą chemiczna lub przy użyciu mikroorganizmów otrzymując prowitaminę- ergosterol, który pod wpływem UV ulega przekształceniu do Wit.D₂.

Stosujemy:1) drożdże: S. cerevisiae, S. uvarum, S. cerlsbergensis, Candida tropicalis, C. petrophilum. S. cervisiae zdolny do biosyntezy ergosterolu w ilości 3,9% s.s, S. carlsbergensis 2,4% s.s, Rhodotorula gracilis 2,7% s.s. 2) inne: Aspergillus, Penicillium chrysogenum, Fusarium - biosynteza ergosterolu od 0,1-0,8% s.m.

Jako źródło węgla drożdże wykorzystują węglowodany zawarte w melasie, namoku kukurydzianym, inne węglowodany oraz etanol też moga byc wykorzystywane.

Na biosyntezę ergosterolu wpływa: napowietrzenie hodowli, po 4dniowej hodowli w T= 28°C , na pożywce zawierającej melasę i namok kukurydziany, biomasa wyselekcjonowanego szczepu S. cerevisiae 7-10% ergosterolu w s.s.- szczep ten jest bardzo dobrym producentem.

Pyt.11Drobnoustroje stosowane w przemysłowej biosyntezie witaminy B2 (ryboflawina)

Witamina B2- produkowana przy użyciu różnych drobnoustrojów: bakterie, drożdże, grzyby strzępkowe i algi (podczas wzrostu syntetyzują znaczące ilości tej witaminy). Stosowana w medycynie(niedobór - łojotok, szorstkość skóry, zahamowanie wzrostu), dodatek do żywności, dodatek do pasz. Drobnoustroje syntetyzujące znaczące ilości Wit. B2 [ mg/dm³]:

Clostridium acetobutylicum 97

E. coli 505

Candida flareri 567

Eremothecium ashbyii 2480

Ashbya gossipii 6420

Dużą rolę odgrywają 1) S. cerevisiae, które zawierają 39-80μg/ g suchej substancji ( proces produkcji: rozdrabniamy je, poddajemy autolizie w T= 45-50°C, pH= 6-6,5, ekstrakcję witaminy prowadzimy alkoholem, wyciąg alkoholowy zagęszcza się do 60% s.s). Dużo lepszą wydajność biosyntezy Wit.B2 z S.cerevisiae osiągnięto stosując pożywkę z octanem wapnia (lepsze źródło węgla niż melasa, bo nie zawiera zanieczyszczeń). 2) Candida flareri- możemy otrzymać 21 g witB2/ dm³ pożywki, gdy drożdże te były mutagenizowane , zdolne do nadprodukcji Wit.B2. 3) najczęściej stosowane- Eremothecium ashbyii i Ashbya gossipii : jako surowce wykorzystują: wywar gorzelniczy, melase, syriop kukurydziany, suszone drożdże, mleko odtłuszczone, mąka sojowa, mąka rybna, brzeczka itd. Obecność oleju kukurydzianego, kokosowego, sojowego, słonecznikowego wzmaga biosyntezę. Do pożywki dodaje się również tiaminę, biotynę, inozytol, mikroelementy. Pożywka z dodatkiem glicyny wzmaga 2krotnie biosyntezę Wit.B2 (większa wydajność). Eremothecium ashbyii ( kwasowość pożywki pH= 6-8)dla Ashbya gossipii pH= 5,5-7; optimum temp= 25-30°C.

Pyt.12 Drobnoustroje stosowane w przemysłowej biosyntezie witaminy B12 (cyjanokobalamina

Stosowana w medycynie (leczenie anemii złośliwej), dodatek do pasz dla drobiu, świń, cieląt.

Drobnoustroje zdolne do biosyntezy: Aerobacter, Azotobakter, Bacillus, Clostridium, Propionibacterium, Pseudomonas. Dużo witaminy B12 do 6 mg/ dm³ syntetyzują drobnoustroje z gatunku: Nocardia rugosa, N. gardneri, Streptomyces griceus, S. olivaceus. Najbardziej ekonomiczne jest użycie bakterii z rodzaju Propionibacterium shermani, P. freudenreichii- zdolne do syntezy witaminy w ilości ponad 20 mg/dm³. Używa się również bakterii z rodzaju Pseudomonas. Dzięki selekcji i mutagenizacji , produkcyjność szczepu P. denitrificans wzrosla z 5 do 120-140 mg Wit.B12/dm³!!

W procesie biosyntezy witaminy B12 wazny jest dodatek do pożywki soli kobaltowych niezbędnych dla syntezy witaminy. Stężenie kobaltu w pożywce więcej niż 50 ppm, hamuje biosyntezę witaminy. Dodatek betainy, choliny stymuluje biosyntezę np. podczas hodowli P. denitrificans ich dodatek w ilości 5mg/ml powodował 10-20 krotny wzrost ilości Wit. B12.

W wyniku fuzji komórek wyselekcjonowanego szczepu Rhodopseudomonas ze szczepem Protominobacter uzyksnao hybrydę zdolną do syntezy 135 mg/dm³ wit B12 w ciągu 2-7dniowej beztlenowej hodowli na pożywce z glukozą.

Pyt.13 Ilość syntetyzowanej ryboflawiny w zależności od drobnoustrojów

!!patrz pytanie11 + dodatkowo:

Drobnoustrój ryboflawina [mg/l pożywki]

Mycobacterium smegmatis 58

Mycobacterium riboflavine 200

Corynebacterium diphteriae 25

Pseudomonas fluorescens 22-34

Drobnoustrój mg/ g s.s komórki

E. coli 106

Pseudomonas fluorescens 310

Rhizobium trfolii 300

Hansenula 54

Geotricchum 55

Torulopsis 50-90

Mycotorula 59

14. Metody otrzymywania aminokwasów

Aa są powszechnie stosowane jako dodatki do żywności, zwłaszcza w celu podniesienia jej wartości odżywczej; są także używane w przemysłach farmaceutycznym, kosmetycznym i in. W zależności od rodzaju mają smak kwaśny, słony, gorzki, słodki; mogą intensyfikować smak żywności. 95% produkcji aa to L-lizyna, L-metionina i przede wszystkim kwas L-glutaminowy (powszechnie wykorzystywane jako dodatki do żywności i pasz).

Metoda ekstrakcji aa z hydrolizatów odpadów przemysłu mięsnego, kazeiny i glutenu. Wady: - niepełna hydroliza wiązań peptydowych, - rozkład niektórych aa, - drogie oczyszczanie, - ograniczenie źródeł i zmienność składu surowców.

Synteza chemiczna. wymaga zastosowania wysokiej temperatury, wysokiego ciśnienia, toksycznych związków chemicznych i kosztownej aparatury, dlatego tylko produkcja dużych ilości danego aa jest opłacalna. W wyniku syntezy chemicznej otrzymujemy racemiczną mieszaninę D- i L-aa, co wymaga dodatkowego procesu do ich rozdzielenia (forma D-aa może być szkodliwa dla zdrowia). Przykłady: z akroleiny - D,L-metioninę, z cykloheksanu - D,L-lizynę, z indolu i kwasu nitrooctowego - D,L-tryptofan.

Synteza enzymatyczna. Można produkować nią L-aa, ale wymaga drogich prekursorów i często drogich i kilku enzymów. Metodą ta otrzymujemy większy wydatek aminokwasowi z prekursorów i większe stężenie aa w roztworze. Jak mamy odpowiednie enzymy mażna produkować L-aa z mieszaniny racemicznej D,L-prekursora. Przykłady: z D,L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu przy użyciu enzymu L-hydrolazy z Cryptococcus, Candida lub Trichosporon mamy L-lizynę. Racemaza z Achromobacter, Flavobacterium przekształca D-kryptolaktam w formę L-, a potem L-hydrolaza w L-lizynę. Z wasu fumarowego i amoniaku przy użyciu aspartazy z E.coli mamy kwas L-asparaginowy.Używa się w tej metodzie prekursorów i enzymów o dużej czystości. Zastosowanie immobilizowanych enzymów umożliwia znaczne obniżenie kosztów, automatyzację procesu, pełniejsze wykorzystanie prekursorów.

Synteza mikrobiologiczna. Produkuje się zwykle L-lizynę, kwas L-glutaminowy i kwas L-asparaginowy - dodatki do żywności. Jest metodą tanią ze względu na to, że składniki pożywki są zazwyczaj tanie, proces przebiega w niższej temp. niż enzymatyczna synteza i uzyskuje się wyłącznie L-aa. Przez dobór warunków hodowli, a zwłaszcza mutagenizację drobnoustrojów metodami fizycznymi, chemicznymi lub inżynierii genetycznej, można uzyskać organizmy zdolne nadprodukcji danego aa. Nadprodukcję aa można uzyskać przez dodanie do pożywki określonego prekursora, np. dodanie L-homoseryny zwiększbiosyntezę L-treoniny przez B. subtilis lub proteusz rettgeri. Można dodać do pożywki związki powodujące zwiększenie przepuszczalności błony cytoplazmatycznej, a tym samtm nadprodukcję aa.

15. Aminoacylaza i jej praktyczne znaczenie

Aminoacylaza- enzym otrzymywany z Aspergillus oryzae. Stosowana do rozdziału mieszaniny racemicznej aminokwasów. Na skalę przemysłową jest wykorzystywana jako enzym immobilizowany na membranie w reaktorach membranowych. Pozwala na otrzymywanie L-aminokwasów z mieszaniny N- acetyl- D,L- aminokwasów.

Mieszanina:

N- acetyl-D,L- aminokwasów aminoacylaza L- aminokwasy

Pozostałą formę D poddaje się racemizacji.

16. Co to są auksotroficzne mutanty?

Mutagenizacja umożliwia otrzymanie auksotroficznych mutantów, czyli drobnoustrojów, które straciły zdolność syntezy jednego z metabolitów ( np. aminokwasu lub witaminy) w wyniku mutacji i utraty zdolności wytwarzania określonego enzymu szlaku syntetycznego. Wynika to z nadprodukcji przez drobnoustrój danego aminokwasu, ze związku chemicznego, który zaś jest prekursorem dla zahamowanej biosyntezy innych aminokwasów. Aminokwas, którego biosynteza została zahamowana, powinien być dodawany do pożywki, aby zapewnić odpowiedni wzrost bakterii.

Mutagenizacja indukowana stosowana na skalę przemysłową w celu otrzymania jakiegoś metabolitu, działa na zasadzie zmiany kierunków metabolicznych, w wyniku zmiany aktywności określonych enzymów, co powoduje zahamowanie biosyntezy niektórych aminokwasów, a nadprodukcję pożądanego! Mutacja genu regulatorowego może spowodować ograniczenie syntezy określonych enzymów, uczestniczących w syntezie danego aminokwasu, zaś mutacja genu strukturalnego powoduje, że drobnoustrój staje się niewrażliwy na nadmiar danego aminokwasu i nie ogranicza jego syntezy.

17. Wady i zalety fermentacyjnej metody otrzymywania aminokwasów.

Zalety:

- duża zawartość produktu w płynie pohodowlanym,

- większa, ilościowa produkcja aminokwasów,

- tanie pożywki,

- niższa temperatura procesu,

- możliwość zastosowania komórek unieruchomionych ( immobilizowanych),

- mutagenizacja,

- uzyskuje się wyłącznie L-aminokwasy.

Wady:

- możliwość zakażenia hodowli,

- wrażliwość na bakteriofagi,

- zmienność metaboliczna mikroorganizmów,

- zmienność substratów.

18. wady i zalety enzymatycznych metod otrzymywania aminokwasów :

Wady:

1. wymaga użycia kosztownych prekursorów

2. często wymaga użycia drogich enzymów

3. często trzeba używać dużych ilości enzymów

4. konieczność użycia prekursorów i enzymów o dużej czystości - co powoduje zwiększenie kosztów procesu, ze względu na dodatkowe koszty ich oczyszczania

5. dodatkowe koszty immobilizacji enzymów

6. jest to metoda dość kosztowna w porównaniu do metod mikrobiologicznej biosyntezy, w której użyte składniki pożywki są tańsze

7. wysoka temperatura w porównaniu z mikrobiologiczna biosyntezą, co wiąże się z większymi kosztami tego procesu i większym zużyciem energii

8. tą metodą można otrzymywać wyłącznie L- aminokwasy

Zalety:

1. duża wydajność produkcji aminokwasów z ich prekursorów

2. uzyskujemy większe stężenie aminokwasów w roztworze w porównaniu z innymi metodami

3. jeśli dobierzemy odpowiednie enzymy to możemy produkować L-aminokwasy z mieszaniny recemicznej ich prekursorów. Pozwala to na zmniejszenie kosztów procesu produkcji aminokwasów, ze względu na to iż procesy produkcji rozdziału mieszaniny recemicznej na 2 izomery (L i D) są dość skomplikowane i kosztowne

4. duża wydajność procesu ze względu na dużą czystość użytych enzymów i prekursorów aminokwasów

5. zastosowanie immobilizownych enzymów obniża koszty procesu

6. automatyzacja procesu ( przyczynia się to do ułatwienia kontroli procesu)

7. lepsze i pełniejsze wykorzystanie prekursorów aminokwasów obniża koszty procesu produkcji aminokwasów nawet o kilka procent

20. drobnoustroje używane do produkcji lizyny i kwasu glutaminowego

LIZYNA:

1. drożdże Cryptococcus, Candida, Trichosporon - produkcja L-lizyny z D,L-α-amino-ε-kaprolaktamu (który jest otrzymywany na drodze syntezy chemicznej) za pomocą L-hydrolazy pozyskanej z tych drobnoustrojów

2. recemaza (enzym) pozyskiwana z Flavobacterium i Achromobakter przekształca D-kaprolaktam w L-kaprolaktam, który następnie pod wpływem L-hydrolazy przekształca się w L-lizynę

3. Corynebacterium (C. glutanicum), Brevibacterium (B. lactofermentum, B. flavum) - używane do produkcji L-lizyny na skalę przemysłową

4. Poza tym są stosowane drożdze do produkcji L-lizyny lecz nie na skalę przemysłową

Ważne parametry procesu:

1. T= 28-33°C

2. pH pożywki= 6,9-7

3. czas prowadzenia hodowli = 48h

4. Napowietrzanie

5. wydajność biosyntezy w zależności od użytego drobnoustroju i źródła węgla ok. 39-75%

KWAS GLUTAMINOWY:

• Corynebacterium (C. glutanicum), Brevibacterium (B. flavum), Mikrobacterium, Arthrobacter, które są auksotroficznymi mutantami

Ważne parametry procesu:

1. T= 32-33°C (nawet do 38°C)

2. pH pożywki= następuje spadek podczas prowadzenia procesu z 8,5 do 7,8 i jest utrzymywane na tym poziomie do końca procesu, po zakończeniu hodowli obniża się pH do wartośći 3,2

3. czas prowadzenia hodowli = 30-35h

4. wydajność biosyntezy w zależności od użytego drobnoustroju i źródła węgla ok. 59 - do powyżej 100%

21. Wielkość biosyntezy lizyny w zależności od użytego drobnoustroju i aminokwasu:

Źródło węgla	Drobnoustrój	L-lizyna, g/dm3
Glukoza Glukoza Glukoza Glukoza Kwas octowy Kwas octowy Etanol	C.glutamicum C.glutamicum 901 B.flavum FA 1-30 B.flavum B.flavum B.lactofermentum B.lactofermentum	39 44 57 33 75 75 66

Wielkość biosyntezy kwasu glutaminowego w zależności od użytego drobnoustroju i aminokwasu:

Źródło węgla	Drobnoustrój	L-glutaminian g/dm3
Melasa buraczana Glukoza + octan amonu Kwas octowy n-alkany alkohol etylowy	C.glutamicum B.divaricatum C.flavum A.paraffineus B.subsp. 136	>100 100 98 62 59

22. Enzymy decydujące o biosyntezie kwasu glutaminowego

Kwas L-glutaminowy duże znaczenie jako intensyfikator smaku żywności zwłaszcza glutaminian sodu. Zdolność do produkcji mają Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium i Arthrobacter. Przebieg biosyntezy: 2-oksoglutaran z cyklu Krebsa ulega przemianie do kwasu L-glutaminowego w obecności dehydrogenazy glutaminowej. Może uledz dalszej przemianie w cyklu Krebsa za pomocą dehydrogenazy 2-oksoglutaranowej. W mutantach auksotroficznych C. glutamicum i B. Flaum aktywność dehydrogenazy oksoglutaranowej bardzo mało, dehydrogenazy glutaminianowej bardzo duża co zapewnia nadprodukcję kwasu L-glutaminowego. Źródłem węgla w hodowli może być glukoza, sacharoza, hydrolizowana skrobia, melasa, alkohol etylowy, kwas octowy, n-alkany. Źródłem azotu: sole amonowe, amoniak, mocznik.

23. Enzymy decydujące o biosyntezie lizyny.

L-lizyna determinuje wartość biologiczną białka, zwiększa wykorzystanie białek roślinnych zawartych w paszy. Do jej produkcji w skali przemysłowej używa się bakterii Corynebacterium i Brevibacterium. Przebieg biosyntezy: szczawiooctan z cyklu kwasów trikarboksylowych przez aminotransferazę glutaninianową przechodzi w L-asparaginian a ten przez kinazę asparaginianową w semialdehyd beta-asparaginowy. Enzymem decydującym o powstaniu L-lizyny z semialdehydu jest syntetaza dihydrodipikolinianowa. W biosyntezie mikrobiologicznej L-lizyny używa się mutantów auksotroficznych, które nie syntetyzuję dehydrogenazy homoserynowej (sprzyja syntezie innych aa z semialdehydu), lub mutantów regulatorowych, których kinaza asparaginianowa (jej aktywność hamowana przez nadmiar L-lizyny) jest niewrażliwa na obecność analogu L-lizyny. Najlepiej używać drobnoustrojów z obydwoma rodzajami mutacji. Źródło węgla w hodowli bakterii: melasa buraczana, melasa trzcinowa, alkohol etylowy, kwas octowy, n-parafiny, a źródło azotu: sole amonowe, hydrolizat białek sojowych. Do pożywki dodaje się L-homoserynę, L-treoninę lub L-metioninę (ograniczają syntezę kwasu glutaminowego) dodaje się ponad 30 µg/dm³ biotyny (ale jak melas trzcinowe to bioty nie ma). pH=6,9-7 (utrzymywane amoniakiem). Czas 48h, temp. 28-33⁰C. Po zakończeniu hodowli płyn pohodowlany z L-lizyną i innymi cennymi składnikami zagęszcza się do 40 g s.s otrzymując preparat paszowy L-lizyny.

24. Czynniki wpływające na intensywność biosyntezy kwasu glutaminowego.

Jak w pożywce jest dużo biotyny to bakterie nie są zdolne do nadprodukcji kwasu L-glutaminowego. Optymalne stężenie biotyny sprzyjające nadprodukcji aa na pożywce zawierającej 10% glukozy to 5 µg/dm³, jak glukozy w pożywce mniej to i biotyny odpowiednio mniej. Jeśli w pożywce jest kwas octowy to stężenie biotyny powinno wynosić 0,2-1,0 µg/dm³. W celu zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej w hodowli stosuje się dodatek detergentów, penicyliny, cefalosporyny, nasyconych kwasów tłuszczowych. Przykład: synteza kwasu L-glutaminowego przez B. divaricatum NRRL B-231 to:

- inokulu 6% stanowi 16-godzinna hodowla bakterii w temp. 35^0­­C na pożywce o składzie g/dm³: glukoza-40, KH₂PO₄-1, MgSO₄*H₂O-0,5, ekstrakt drożdżowy-1, mocznik-8

- pożywka hodowlana zawiera g/dm³: 121-glukozy, 5-ctanu amonu, 6-scukrzonej skrobi, 1,2-KH₂PO₄, 1,2-K₂SO₄, 6-MgS)₄, FeSO₄*H₂O i MnSO₄*H₂O po 6 ppm i odpieniacz Hadam K-67. Na początku hodowli dodajemy kwasu oleinowego 0,65 dm³ na 1 dm³ pozywki. Początkowe pH 8,5 obniża się i utrzymuje na poziomie 7,8. Czas trwania 14 h w temp. 32-33⁰C, potem 38⁰C. Zawartość glukozy podczas hodowli obniża się do 0,5-2% i dodaje się wtedy 160 g glukozy na dm³ pożywki.Kontroluje się napowietrzanie, zawartość CO₂-nie więcej niż 4,5%. Po 30-35 h hodowli w pożywce jest ok. 100 g/dm³ kwasu L-glutaminowego. Po zakończeniu hodowli usuwa się komórki bakterii i dodaje mleka wapniowego. L-glutaminian doprowadza się do pH 3,2- punkt izoelektryczny. po schłodzeniu roztworu krystalizuje się kwas.

25. Wymień znane ci polisacharydy mikrobiologiczne i drobnoustroje stosowane do ich syntezy. Polisacharydy to wielocząsteczkowe związki zbudowane z monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. Otrzymywanie tych związków przy użyciu mikroorganizmów jest korzystne ze względu na ich dużą różnorodność oraz możliwość produkcji niezależnie od warunków klimatycznych. W zależności od warunków mikroorganizmy mogą syntetyzować duże ilości polisacharydów w celu: - ochrony przed wyschnięciem, - neutralizacji toksyn i trucizn, ochrony przed wirusami i przeciwciałami „atakującymi” określone wiązania w ścianie komórkowej mikroorganizmu, - przeprowadzenie nadwyżki substratu w stan piany (wtedy dostępny dla innych drobnoustrojów). Polisacharydy otrzymywane z drobnoustrojów mają duże znaczenie w technologii żywności, przemyśle petrochemicznym, papierniczym, tekstylnym. Dodatek polisacharydów do żywności ma na celu: - utrzymanie pożądanej konsystencji produktu w czasie przechowywania, - zwiększenie lepkości płynnego produktu spożywczego, - zmniejszenie strat wody w czasie obróbki i przechowywania produktów spożywczych, - produkcję niskokalorycznej żywności.

Pullulan: grzyby Aureobasidium pullulans (nowa nazwa Pullutaria pullulans) z klasy Euascomycetes, rząd Diothideales, rodzina Dothideaceae, potocznie nazywane „czarnymi drożdżami”, występuje na wielu owocach i roślinach i wykazuje dużą zmienność morfologiczną (komórka ma 5 jąder).

Dekstran: Leuconostoc mesenteriodes NRRL B12(F) lub Leuconostoc mesenteroides B512, w Rosji Leuconostoc SP4, w Czechach i w Polsce Leuconostoc L60A.

Ksantan: Xantomonas campestris B-1459, ale też inne z tego rodzaje są zdolne do jego syntezy, np. X. phaseoli, X. caratom, X. oryzae, X. malvacearum.

Kurdlan: Alcaligenes faecalis oraz rodzaj Agrobacterium

26. budowa dekstranu i jego zastosowanie.

Polisacharyd zbudowany z glukozy połączonej wiązaniami α-(1-6)-D-glikozydowymi. Między resztami glukozowymi są wiązania α-(1-4)-D-glikozydowe i α-(1-3)-D-glikozydowe, tworząc łańcuchy boczne. Wiązania α-(1-6)-D-glikozydowe stanowią 90-95% wiązań glikozydowych w dekstranie. To substancja o wysokim ciężarze cząsteczkowym rozpuszczalny w wodzie ( występuje w postaci białego proszku). Średnia masa cząsteczkowa ok.. 40.000 Daltonów.Wytwarzany jest ze śluzu pokrywającego komórki bakterii Leuconostoc mesenteroides ( bakterie fermentacji mlekowej, paciorkowce gram +).

Zastosowanie:

-wykorzystywany jako środek krwiozastępczy w medycynie w przypadku wstrząsów pokrwotocznych, pourazowych i oparzeniowych( jego stosowanie może wywołać u pacjenta liczne powikłania. Propagowany przez Świadków Jehowy jako alternatywa dla transfuzji krwi).

27. produkcja dekstranu-pozywka, drobnoustroje i warunki hodowli.

Mechanizm biosyntezy dekstranu polega na rozszczepieniu cząsteczki sacharozy pod wpływem enzymów. Struktura dekstranu tzn. wielkość cząsteczek oraz stopień rozgałęzienia jest cechą gatunkową szczepu Leuconostoc i świadczy o dużej specyficzności w zależności od źródła izolacji.

Rozpoczęcie biosyntezy polega na powstaniu kompletu enzymu z akceptorem reszty glukozylowej, w przypadku syntezy dekstranu dawcą tej reszty może być tylko sacharoza.

Mikrobiologiczna synteza dekstranu:

Klasyczna metoda polega na hodowli wyselekcjonowanego szczepu Leuconostoc sp. W podłożu zaw. Od 10-15 % sacharozy. Jest ona zarówno substratem w biosyntezie dekstranu, jak i źródłem węgla i energii do wzrostu drobnoustrojów ( prze komórki Leuconostoc wykorzystywana jest uwolniona z sacharozy D- fruktoza.). Szczepy wymagają do wzrostu witamin i aminokwasów, których źródłem są autolizaty i ekstrakty drożdży lub zarodków zbożowych. Dobrym źródłem azotu jest hydrolizat kazeiny. Składniki te stosuje się w stężeniu od 0,1 -0,5 %. Proces syntezy trwa 24-28 h w temp. 23-25°C. produkcja dekstranu-pozywka, drobnoustroje i warukni hodowli, obniżenie pH podłoża z 5,6-7,4 do 4,5 jest sygnałem do przerwania procesu, gdyż pH optymalne wynosi 5-6. W celu przedłużenia procesu można regulować pH przez dodanie CaCO3, wiąże się z tym również dozowanie roztworu sacharozy. W procesie trwającym 2, 4 doby otzrym. Się dekstran rodzimy o masie cząst. Od kilu do kilkudziesięciu Da, z wydajnością 80-85% w przeliczeniu na reszty glukozydowe użytej sacharozy.

Modyfikacja mikrobiologicznej syntezy dekstranu. W klasycznejmetodzie biosyntezy dekstranu wyróżniamy 2 fazy:

1. namnożenia komórek ( z syntezą enzymu dekstranosacharazy),

2. produkcja dekstranu.

Optymalne warunki dla obu faz są różne , dlatego opracowano technologię, w której fazy te są 2 oddzielnymi procesami:

Faza I- podłoże z dodatkiem 2% sacharozy. Na tym etapie sacharoza jest niezbędna jako induktor dekstranosacharazy, zaś źródłem węgla i energii dla drobnoustrojów mogą być inne cukry, kw. Organiczne, aminokwasy, niskocząsteczkowe alkohole. Stosuje się niższe niż w procesie klasycznym dawki N i P, temp. Procesu 20-28°C, optymalne pH= 6,5- 7,5 utzrymywane jest przez dozowanie NaOH i KOH. Czas namnażania bakterii ok.. 24h. W tych warunkach aktywność enzymu w podłożu jest 5x większa w porównaniu z metodą klasyczną. Faza II- otrzymana hodowlę w prowadza się w ilości 10% do roztworu sacharozy o stężeniu 10-20%, oprócz tego roztwór zawiera 1% dekstranu niskocząsteczkowego. Wysokie stężenie sacharozy sprzyja wydajnej syntezie dekstranu. Optymalne pH dla biosyntezy od 5-5,5, temp. 25-30°C. Dzięki stworzeniu optymalnych warunków dla obu etapów oddzielnie znacznemu skróceniu ulega sumaryczny czas procesu, otrzymany dekstran zaw. Znacznie mniej zanieczyszczeń chemicznych oraz jest łatwiejszy w dalszej obróbce.

28. PRODUKCJA PULLULANU-pożywka, drobnoustroje warunki hodowli i zastosowanie.

Pullulan jest polisacharydem zbudowanym z cząsteczek alfa-trisacharydów w skład których wchodzą 3 cząsteczki glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-gliozydowymi. Produkowany przez Aeurobasidium pullulans(i Pullularia pullulans)

.WŁAŚCIWOŚCI I ZASTOSOWANIE:

-Biały, higroskopijny proszek, bez smaku i zapachu, nie trawiony przez organizm człowieka jest stosowany jako dodatek do niskokalorycznej żywności.

-rozpuszczalny w wodzie a nierozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych i alkoholu

-stosowany jako środek zagęszczający do produktów spożywczych

-właściwości silnie adhezyjne-tworzy „powłoczkę” na produktach które chcemy zamrozić

-ochrona przed ususzką i zmianami barwy i konsystencji

- do produkcji kremów, sosów, deserów, mrożonej, żywności

-mała przepuszczalność tlenu- do przechowywania produktów o dużej zawartości tłuszczów

- do produkcji biodegradowalnych folii, opakowań, kontenerów

Charakterystyk szczepu: Aureobasidium pullulaus

-występują na owocach i roślinach

-duża zmienność morfologiczna (zawierają 5 jader)

-nazywamy „czarnymi drożdżami”-może syntetyzować melaninę o czarnym zabarwieniu podczas wzrostu

WARUNKI HODOWLI

-hodowla napowietrzana

pH:4,5-6,6(nawet do 7,5)

-temp. 25-28C

-źródło węgla:glukoza, laktoza, sacharoza, skrobia,

-Źródło N: amoniak, zw. Azotowe, azotany, azotyny, zw. Amonowe

-dodatki do podłoża hodowlanego:NH4NO3, KNO3, MgSO4x7H2O,K2SO4x7H2O, Fe2So4X7h2O, ekstrakt drożdżowy, K2HPO4, NaCL2

W zależności od składu pożywki, pH, i innych warunków hodowli szczep Aeurobasidium pullulans będzie syntetyzował pullulan o różnej masie cząsteczkowej:

-duża zawartość fosforanów-mniejsza masa cząsteczkowa

-pH<6,8 o większej masie cząsteczkowej

Pullulan jest syntetyzowany w połowie fazy logarytmicznego wzrostu po 48 godz hodowli

-ogólnie synteza trwa 96-120 godz.

WYDZIELANIE PULLULANU Z PŁYNU HODOWLANEGO:

1. zmniejszenie lepkości płynu przez rozcieńczenie woda

2. odwirowanie lub filtracja komórek grzybni(filtry z weglem aktywnym zatrzymującym melaninę)

3. Strącanie alkoholem etylowym

4. oczyszczanie przez chromatografię jonowymienna

5. suszenie(zwykle rozpyłowe)

29. Pyt. PHA- POLIESTRY HYDROKSYKWASÓW ALKANOWYCH

-materiał zapasowy bakterii,

-stosowane do produkcji biodegradowalnych tworzyw, butelek do szamponu, nici chirurgicznych(PHM), naczyń krwionośnych, otoczek do leków- ukierunkowanie ich do miejsca działania

-podstawową jednostką budulcową jest kw. masłowy(PHM-kw.3-hydroksymasłowy)

lub kw. walerianowy(PHV -kw. 3-hydroksywalerianowy)

-w zależności od długości łańcucha zmieniają się jego właściwości

-stosowane szczepy do produkcji: Alcaligenes eutrophus

-pożywka zawiera glukze, etanol itp.

30. PYT. PRODUKCJA KSANTANU

Zbudowany z jednostki podstawowej składającej się z 2 cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem α-1,4-D-glukozydowym. Druga glukoza połączona wiązaniem α-(0-3)-D-glikozydowym jest połączona z mannozą, zawierającą w pozycji C-6 grupę acetylowi, wchodzącą w skład trisacharydu zawierającego 2 mannozy, miedzy którymi jest kwas glukaronowy. Końcowa mannoza zawiera kwas pirogronowy.

-Szczepy produkujące ksantan:Xanthomonas campestris(inne X.phaseoli, X.carotae, X. oryzae

-Skład pożywki:

1.żródło weglą:glukoza, sacharoza, hydrolizat skrobi, melasa

2. źródło N :hydrolizowana kazeina, skrobia lub hydrolizat białek sojowych

3. dodatek kwasów org. I soli mineralnych

4.pH 6-7,5, temp 28C

5. napowietrzanie 1mmolO2/dm3 na minutę

WYDZIELANIE KSANTANU

1.pożywkę hodowlaną rozcieńczamy wodą

2.podgrzewamy do wrzenia-zabicie bakterii

3.sączenie/filtracja lub wirowanie-oddzielenie komórek bakterii

4.dodanie stęż. 50%metanolu lub izopropanolu w obecności 2%KCL-u

5.suszenie i mielenie

WŁAŚCIWOŚCI

-kremowy proszek bez smaku zapachu

-dobrze rozpuszczalny w wodzie-tworzy lepkie roztwory( lepkość zależy od ilości kw. Pirogronowego)

-stabilny w obecności kwasów i soli, w każdym pH(dodatek do majonezów)

-daje możliwość rozlewania płynnych produktów wysokiej temperaturze co zapobiega zakażeniom bakteryjnym

-tworzy stabilne emulsje(desery, majonezy, dressingi)

-stosowany w mrożonej żywności zapobiega wypływaniu z niej wody po rozmrożeniu

-dodatek do napojów w proszkach

-Odporny na działanie wieu enzymów

-zastępuje skrobię w niskokalorycznej żywności

-stabilizuje produkty mleczne-lody, jogurty, sery topione

-stosowany w przemyśle tekstylnym, petrochemicznymi papierniczym

Pyt.31 Dekstranosacharaza i jej praktyczne znaczenie

Dekstranosacharaza jest to enzym o aktywności transglukozydazy, hydrolizujący cząsteczke sacharozy z przeniesieniem cząsteczek glukozy na dekstran; produkowana przez Leuconostoc mesenteroides. Sacharoza jest substratem w biosyntezie dekstranu oraz źródlem węgla i energii dla rosnących bakterii. Po hydrolizie przez dekstaranosacharazę pozostaje niewykorzystana fruktoza (sacharoza= glukoza+ fruktoza). Dekstranosacharaza tworzy DEKSTRAN. Jest to polisacharyd, w którym cząst. α- Glukozy połączone są w pozycjach 1,6 (α-1,6- glukan). Struktura dekstanu tzn. wielkość cząsteczek oraz stopień rozgałęzienia jest cecha gatunkową szczepu Leuconostoc i świadczy o dużej specyficzności w zależności od źródła izolacji. W produkcji dekstranu modyfikacja mikrobiologiczna syntezy dekstranu wyróżniamy 2 fazy:

1) namnożenie komórek z synteza enzymu dekstranosacharazy ( podłoże z >2%sacharozy, jest induktorem enzymu oraz źródłem węgla i energii; T=20-25°C, pH= 6,5-7,5, czas namnażania bakterii=24h). W tych warunkach synteza enzymu jest 5krtonie większa niż w metodzie klasycznej. Przy pH= 6,7 zachodzi najintensywniejsza produkcja enzymu. Nagromadzenie się dekstranosacharazy powoduje spadek pH z 6,7 do 5,2 i zapoczątkowuje 2 fazę

2) konwersja sacharozy w dekstran przy pH=5,2

Coraz częściej stosowana jest immobilizowana dekstranosacharaza !

Zastosowanie dekstranu: środek zastępczy plazmy krwi( utrzymuje stałą objętość i ciśnienie krwi przy utracie), produkcja materiałow chromatograficznych (zeli dekstranowych- Sephadex), jako bezpieczny i biodegradowalny składnik opakowań do żywności

31.Dekstranosacharaza i jej praktyczne znaczenie

Dekstranosacharaza to enzym produkowany przez Leuconostoc mesenteroides, przekształca sacharozę (ale też maltoza, izomaltoza, dekstran niskocząsteczkowy) w dekstran.

SACHAROZA + AKCEPTOR DEKSTRAN + D-FRUKTOZA

Jest ona syntetyzowana przez komórki bakterii w I etapie hodowli (najintensywniej w pH=6,7) i gromadzona w komórkach. Prowadzi to do spadku pH podłoża i przy pH=5,2 następuje intensywna konwersja sacharozy w dekstran.

Dwustopniowa synteza dekstranosacharazy:

• Nagromadzenie enzymu

• Konwersja sacharozy (przy pH=5,2)

Coraz częściej stosuje się immobilizację tego enzymu. Korzystne jest ciągłe zasilanie hodowli sacharozą (hodowla ciągła).

32. Wymień znane ci enzymy amylolityczne i metody ich otrzymywania.

Amylazami nazywa się wiele enzymów używanych do hydrolizy skrobi na cukry prostsze. Zaliczamy do nich:

α-amylaza - hydrolizuje wiązania α-(1-4)-glikozydowe, upłynnia skrobię, albo upłynnia i scukrza, stosowana w pierwszym etapie przerobu skrobi, produkt końcowy maltoza i niewielkie ilości dekstryn granicznych, w zależności od pochodzenia otrzymane enzymy mogą różnić się miejscem hydrolizowanego wiązania α-(1-4)-glikozydowego w skrobi i optymalnymi warunkami hydrolizy. Synteza przez Bacillus licheniformis (dla każdego szczepu należy dobrać odpowiedni skład pożywki i warunki hodowli). W ostatnich latach - geny odpowiedzialne za syntezę enzymu z B.coagulans, B.licheniformis, B.stearothermophilus metodą inżynierii genetycznej przeniesiono do E.coli.

β-amylaza, hydrolizuje co drugie wiązanie α-(1-4)-glikozydowe od końca nieredukującego łańcucha skrobi, hydrolizuje amylozę w 75-91%, a amylopektynę w 55-60%, końcowe produkty hydrolizy - maltoza i dekstryny graniczne, preparaty przy użyciu Bacillus polymyxa, B.circulans, B.cereus, B.megaterium.

glukoamylaza, hydrolizuje wiązanie α-(1-4)-glikozydowe od końca nieredukującego łańcucha skrobi, odszczepiając cząsteczki glukozy, zdolna jest również do hydrolizy wiązania α-(1-6)-glikozydowego w amylopektynie (ale z mniejszą wydajnością). Do produkcji stosuje się Aspergillus niger (po mutagenizacji), A.awamori, A.foetidus. Hodowla - pożywka: 5-20% mielonej kukurydzy (hydrolizowaną wcześniej bakteryjną α-amylazą), namok kukuradziany i nieorganiczne sole; pH 5,5 podczas fermentacji utrzymywany na poziomie 4; hodowla napowietrzana; 4-5 dni.

pullulanaza, działa na oligosacharydy zawierające po dwie jednostki glukozy z każdej strony wiązania, hydrolizuje wiązania α-(1-6)-glikozydowe w amylopektynie, otrzymywana z bakterii Klebsiella, Escherichia, Bacillus, Streptococcus

izoamylaza, działa na wiązania zawierające co najmniej po 3 jednostki glukozy z każdej strony, hydrolizuje wiązania α-(1-6)-glikozydowe w amylopektynie, otrzymywana z bakterii Cytophaga, Bacillus, Escherichia, Flavobacterium i drożdży Lipomyces, Pseudomonas.

33. Metody otrzymywania fruktozy ze skrobi.

Mleczko skrobiowe→upłynnienie(α-amylaza) →scukrzenie(glukoamylaza) →filtracja→ odbarwianie→ demineralizacja→izomeryzacja(unieruchomiona izomeraza glukozowa)→ dodatkowe odbarwianie→zagęszczanie→syrop wysokofruktozowy(42%fruktoza, 52%glukoza, stosowany jako zamiennik cukru)

Produkty enzymatycznego rozkładu skrobi

34. Produkcja syropów maltozowych.

W obróbce skrobii można stosować różne procesy enzymatyczne pozwalające na wytworzenie różnych produktów skrobiowych.

• Wynikiem procesu upłynniania jest maltodekstryna

• Proces scukrzania upłynnionej skrobi pozwala na uzyskanie syropów skrobiowych, glukozy i maltozy

• Proces cyklizacji - cyklodekstryny (transferaza glukozowa cyklodekstryn)

• Proces transglukozylacji - syrop izomaltooligosacharydowy

• Proces utleniania glukozy - kwas glukonowy

• Proces izomeryzacji - syrop fruktozowy

Syropy maltozowe produkowane są o różnej zawartości maltozy w zależności od zastosowania jednego czy dwóch enzymatycznych procesów scukrzania (ale najpierw na skrobię działamy α-amylazą w celu jej upłynnienia):

Zastosowanie wyłącznie pleśniowej α-amylazy czy β-amylazy pozwala na uzyskanie syropu zawierającego 40-60% maltozy

Dodatkowe wprowadzenie pullulanazy czy izoamylazy - syropy 75-85% maltozy

Syropy maltozowe są to oczyszczone i zagęszczone wodne roztwory cukrów prostych (glukozy, maltozy) i niskocząsteczkowych wielocukrów, otrzymywane w wyniku enzymatycznej hydrolizy skrobi.

Charakteryzują się łagodną, charakterystyczną słodyczą, dobrą stabilnością temperaturową i chemiczną, obniżoną tendencją do krystalizacji, wysokim ciśnieniem osmotycznym. Wysoka stabilność mikrobiologiczna pozwala przechowywać syropy przez dłuższy czas w temperaturze otoczenia bez obawy wystąpienia krystalizacji.

Jako największe zalety syropów należy wymienić:

regulację struktury i konsystencji produktu

zdolność karmelizacji

zdolności fermentacyjne

uwypuklenie walorów smakowych

obniżenie punktu zamarzania

dobrą rozpuszczalność

polepszanie wyglądu i uwypuklenie koloru produktu

zapewnienie słodyczy zdolnością hamowania krystalizacji cukru

łagodną słodyczą

Zastosowanie:

w przemyśle cukierniczym do produkcji cukierków twardych, zewnętrznych twardych powłok cukierków nadziewanych, nadzień cukierniczych, masy karmelkowej, pomad, wyrobów piankowych, żelków, galaretek, polew czekoladowo-owocowych (dzięki zdolności regulowania struktury i konsystencji produktu). W produkcji twardych i miękkich karmelków udział syropu maltozowego powoduje zwiększenie plastyczności masy, wpływa na trwałość barwy i smaku oraz nadaje przezroczystość i połyskliwość. W nadzieniach do wyrobów waflowych poprawia właściwości strukturalne, smarowalność masy oraz jej przyczepność.

W piekarnictwie cukierniczym użycie syropów polepsza konsystencję ciasta, zapewnia zwartą i delikatną strukturę. Ze względu na specyficzne właściwości dodatek syropów do wypieków zapobiega nadmiernemu wysuszeniu produktu. Syropy są szczególnie polecane do wypieku pieczywa cukierniczego o przedłużonej trwałości. Podwyższona zawartość maltozy i glukozy w syropach pozwala na zmniejszenie dawki sacharozy, przy jednoczesnym polepszeniu konsystencji ciasta.

Syropy dzięki specjalnie dobranemu składowi cukrów prostych znajdują zastosowanie w produkcji gum do żucia (zwykłych, balonowych, rozpuszczalnych, twardych, miękkich). Nadają one odpowiednią konsystencję masie oraz zapobiegają twardnieniu gumy poprzez zatrzymywanie wody w produkcie.

w browarnictwie, W napojach bezalkoholowych wykorzystuje się wysokie ciśnienie osmotyczne tego syropu, używa się go także do wytwarzania syropów pitnych, likworów oraz likierów.

W przemyśle owocowo-warzywnym stosowane są jako substytut cukru do produkcji dżemów, marmolad, konfitur, deserów mrożonych, owoców kandyzowanych, kompotów, soków owocowych, keczupów, sosów, majonezów.

35. Znane preparaty koagulujące białka mleka, drobnoustroje używane do ich syntezy.

Podpuszczka - preparat enzymatyczny stosowany w serowarstwie zawierający chymozynę, otrzymuje się go prowadząc ekstrakcję chymozyny z pokrojonych trawieńców roztworem CaCl₂ lub NaCl o pH=5,6-5,8. Ekstrakt poddaje się filtracji lub wirowaniu (usuwanie niepożądanych drobnoustojów), a następnie pH obniża się do 5 (uaktywnienie prochymozyny). Roztwór o pH 5,3-5,6 zachowują swoją aktywność i jest nazywany podpuszczką w płynie.

Preparaty koagulujące otrzymywane przy użyciu bakterii nie znalazły szerszego zastosowania w przemyśle, głównie z powodu dużej aktywności proteolitycznej obniżającej wydatek sera i pogarszającej jego cechy organoleptyczne. W ostatnich dziesięcioleciach podjęto przemysłową produkcję substytutów podpuszczki głównie przy użyciu grzybów.

„Suparen” - otrzymany w 1966 przy użyciu Endothia parasitica

„Meito” - 1967, Mucor pusillus, podłoże stałe z otrąb pszennych

„Fromase”, „Rennilase”, „Marzyme” - Rhizomucor miehei, właściwości najbardziej zbliżone do podpuszczki, obecnie stosowane

„Chymax”(Aspergillus niger var. awamori), „Chymogen“(Escherichia coli K12), „Maxiren”(Kluyveromyces marxianum var. lactis), otrzymane przez wprowadzenie do dbn genów odpowiedzialnych za syntezę prochymozyny przez komórki trawieńca cielaka.

36) Wady i zalety płynnych i stałych preparatów enzymatycznych :

Czynniki warunkujące wady i zalety:

>mechaniczne (zmiany fizyczne)

>cieplne (stan termiczny środowiska)

>dyfuzyjne(potencjał chemiczny przenikania)

>fizykochemiczne (stan skupienia, rozproszenia)

>biologiczne (wpływ innych enzymów i zanieczyszczeń)

Płynne :

>wystarczy oczyścić i zagęścić nie potrzeba dalszej obróbki, można nawet używać zagęszczone pożywki. (met. Membranowa 28-32*C )

>skoncentrowane mają dużą aktywność

>wymagają dodania subst. ochronnej (stabilizatorów, kowalentna modyfikacja, immobilizacja)

>Mało stabilne i trwałe

>Nie wygodne w dozowaniu, niskie koszty przechowywania

>Naturalna konformacja w roztworze

Stałe:

>Wymagają solidnego oczyszczania

>Konieczność dodawania substancji ochronnych (,bo suszenie sublimacyjne lub rozpyłowe)

>Dużo bardziej trwałe niż enzymy w roztworze

>Przechowywane w temp. 0*c - koszty

>Łatwe w dozowaniu i naważce- forma kryształów, proszku

>Brak wody zmienia konformacje

Jako cząsteczki białkowe posiadają podobne właściwości jak białka: są labilne i podatne na wpływy różnych czynników środowiska. Optymalna temperatura to 37-40°C (wyjątek stanowią enzymy bakteryjne, bakterii żyjących w gorących źródłach - 80°C), optymalne pH dla większości z nich waha się w granicach 6,4-6,6. Niektóre enzymy wykazują zbliżony poziom aktywności w szerokim zakresie pH, np. papaina, inne z kolei działają w ściśle określonym pH: bardzo niskim 1,5 - pepsyna lub wysokim 7,7 - trypsyna.

Aktywność enzymów jest regulowana przez takie czynniki, jak: temperatura, pH roztworu, stężenie enzymu i substratu, inhibitory i aktywatory. Inhibitorami enzymów są m.in. cyjanek, kwas jodooctowy, fluorek, luizyt; same enzymy mogą także oddziaływać jak trucizny, jeśli znajdą się w nieodpowiednim miejscu, np. trypsyna wstrzyknięta do krwi lub jad węży, pszczół, skorpionów.

37)Podpuszczka- (inaczej: rennina, chymozyna) to enzym trawienny, który znajduje się w dużych ilościach w śluzówce żołądka cielęcego. Istnieją także podpuszczki roślinne, znajdujące się w niektórych sokach i tkankach roślin oraz grzybów. Od czasów antycznych powszechnie znaną substancją wywołującą proces ścinania mleka jest sok figowy. Obecnie w użyciu znajdują się także podpuszczki syntetyczne.

Enzym ten może być izolowany, bezpośrednio z żołądka cielęcego, po maceracji roślin ale nastręcz to wielu problemów z wydobyciem i oczyszczaniem, dlatego do produkcji wykorzystano : mezofilny szczep Cryphonectria parasitica (Endotthia p.) w preparatach Suparen, Pfizer, International i termofilne szczepy Rhizomucor miehei (Mucor m.) w Morcular, Pfizer, International oraz Rhizomucor pusillus var. Lindt w Emporase, DFL, Vitex.

Warunki hodowli : hodowla wgłębna, wytrząsana, w pożywce z mąką sojową, glukozą , hydrolizatem skrobiowym, solami mineralnymi, oraz rzadziej serwatką lub białkami mleka.

Dla Rhizomucor pusillus podłoże stałe, z głównie otrębami pszennymi.

Preparaty enzymów zewkom. Są otrzymywane z cieczy pofermentacyjnej po oddzieleniu grzybni metodami filtracji lub wirowania, a enzymów wewkom. z supernatantu po odwirowaniu grzybni zdezintegrowanej metodą chemiczną (aceton, -15*cdo -20*c), mechaniczną, ciśnieniową. Handlowe preparaty podpuszczki są oczyszczonymi i zagęszczonymi cieczami po fermentacji lub wysuszonym i zmielonym precypitatem.

Coraz częściej stosuje się genetycznie modyfikowane : Escherichia coli, Aspergillus niger var. awamori , A.nidulans, Kluyveromyces marxianus, Proteus mirabilis, Sacharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae. Podpuszczka cielęca o 100% chymozyny syntetyzowana jest w firmach Pfizer, CHr.Hansen prze szczepy : Aspergillus niger var. awamori, E. Coli K-12, Kluyveromyces marxianus var. marxianuspod nazwami Chymogen, Chymax, Maxiren.

38)Pepsyna - czynna postać pepsynogenu, enzymu wydzielanego przez komórki gruczołowe (komórki główne) żołądka. W procesie trawienia pepsyna rozkłada białka do krótszych łańcuchów polipeptydowych(na albumozy i peptony). Pepsyna jest składnikiem soku żołądkowego. Głównie wykorzystuje się zmodyfikowane szczepy bakterii, gdyż izolacja z naturalnego środowiska wstępowania jest kłopotliwa i nastręcz wielu problemów.

39)Papaina- endopeptydaza roślinna pozyskiwana z soku mlecznego drzewa melonowego, owoców papai (Carica papaya). Jest to substancja podobna do ludzkiej pepsyny. Uczestniczy w rozkładzie białek (szczególnie pochodzenia zwierzęcego). Łańcuch papainy zbudowany jest z 212 reszt aminokwasowych, stabilizowany jest 3 mostkami dwusiarczkowymi (-S-S-) i tworzy dwie domeny podobnie jak insulina. Papaina trawi białka strukturalne pasożytów obecnych w przewodzie pokarmowym do albuminoz i peptonów. Dodatek witaminy C i amigdaliny z czeremchy pospolitej oraz śliwy tarniny katalizuje aktywność papainy. W medycynie papaina jest od dawna wykorzystywana jako środek przeciwpasożytniczy (np. w lambliozie) działający na zasadzie strawienia ciała parazyta. Papaina rozkłada również strukturę białkową ściany i błony komórkowej bakterii i grzybów.

40)Proteinazy serynowe- Proteazy serynowe reprezentują grupę enzymów rozkładających białka na drodze hydrolitycznej(z udzialem H₂O). Cechą charakterystyczna tej grupy jest wstępowanie asparaginy, histydyny, i seryny. Do tej grupy należą m.in. chymotrypsyna, trypsyna,esteraza, plazmina, trombina, proteazy z lizosomów zwierzęcyh i roślinnych oraz niektóre bakteryjne. Ciężko jest izolować z naturalnych środowisk, bakterie posiadają mały zasób potrzebnych proteaz więc wykorzystuje się modyfikowane genetycznie bakterie, pleśnie, nie drożdże bo wolno rosną i jest ciężej nad nimi pracować. -teraz to samo co z pepsyną + mikroorganizmy ▼na dole:

MIKROORGANIZMY wyk do produkcji białek: bakterie Pseudomonas, Chromobacter, Aerobacter, Escherichia, Micrococcus, Bacillus; drożdze: Kluyveromyces marxianus var marxianus, Kluyveromyces marxianus var lactis, Candida kefyr, Trichosporon cutaneum, Candida tropicalis, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae; grzyby, Tricholoma konigi, Zygorhynchus malleri, Penicilium flavoglaucum, Aspergillus oryzae, Oospora, Fusarium;

41)MIKROBIOL SYNTEZA TŁUSZCZÓW ( SCF- tłuszcz z pojedynczych kom). BAKTERIE nie są najlepszym źródłem tłuszczu, bo w suchej substancji rzadko zawieraja więcej niż 10% lipidów. Nie wykazuja również uzdolnień do syntezy polienowych kw tłuszcz. W biosyntezie tłuszczu mogą być wykorzystane szczepy należące do gat: Noceridia opaca, N. petrophilia i N. hydrocarbons, których lipidy zawieraja dużo kwasu tetradekanowego. DROŻDŻE są częściej wykorzystyw do biosyntezy tłuszczu z węglowodanów ze wzg na wysoka zawartość tego składnika w biomasie. Tłuszcz z biomasy drożdży może być łatwo ekstrahowany i oczyszczany, a pozostałe jej składniki można stosować w żywieniu zwierząt. Synteza tłuszczu przez drożdże wymaga przygotowania pożywki o małej zawartość azotu i fosforu. Tłuszcz z drożdży zawiera znaczne ilości triacylogliceroli a zwłaszcza symetrycznie dwunasyconego triacyloglicerolu - 66%, co jest typowe również dla tłuszczu z nasion roślin oleistych. Zasadnicza różnica między nimi dotyczy przede wszystkim większej zawartości trójnasyconych acylogliceroli w tłuszczu drożdżowym. Triacyloglicerole drożdży syntetyzow w podłożu z n-tetradekanem, wykazują znaczna ilość kwasów nasyconych w pozycji 2. Poszczeg gat drożdży mogą się różnić między sobą wydajnością biosyntezy masy kom, zawartością lipidów i ich składem. Skład kw tłuszcz lipidów drożdży zależy też od temp, pH, czasu trwania hodowli oraz składu pożywki. Wpływ temp hodowli na skład lipidów drożdży namnaża met okresową nie jest jednoznaczny. Kwasowość czynna środowiska wpływa wyraźniej na skład lipidów niż na ich zawartość w biomasie. Stwierdzono, że zmiana kwasowości hodowli Hansenula polimorpha prowadz na etanolu w pH=3-5, zwiększała stopień nienasycenia lipidów w wyniku zmniejszania udziału kw palmitynowego i zwiększenia zawartości oleinowego i linolowego. Dalsze podwyższenie kwasowości do pH=7 nie wpływ na wartość współczynnika nasycenia ale zmieniało stosunek kwasu oleinowego do linolowego. Wraz z wiekiem komórek zmienia się skład kw tłuszcz, przy czym stopień ich nienasycenia i ilość kwasów o krótkich łańcuchach są największe w fazie log wzrostu drożdzy. Grzyby wykazuja duże predyspozycje do biosyntezy tłuszczu. Spośród innych grzybów mikroskopowych największą zawartościa lipidów w suchej masie substancji wyróżniały się Mortierella vinacea- 66% i Penicillium lilacinum-56%. Jakość tłuszczu, wydajność substratu i szybkość procesu są lepsze w przypadku drożdży natomiast grzyby mikroskopowe wytwarzają tłuszcz o większej zawartości kwsów polienowych. GLONY. W optymal warunkach glony syntetyzują duże ilości białka i tłuszczu. W celu uzyskania dużej wydajności biosyntezy tłuszczu należy stosować podłoża z minimalna zawartością związ azotowych. Hodowle glonów prowadzi się przy dostępie światła i war napowietrzenia mieszaniną powietrza ( 95%) i CO2 ( 5%). Czas trwania hodowli wynosi w świetle sztucznym 17-80 dni lub 4-12 dni w war oświetlenia natural. POŻYWKI. Do najczęściej stosow pożywek w procesie mikrobiol syntezy tłuszczu należą n-alkany. Stwarzają one możliwość otrzym lipidów o zmodyfikowanym składzie, zawierającyh kw tłuszcz zwykle nie wyst w tłuszczach pochodz mikrobiol tzn o krótkich łańcuchach i parzystej liczbie atomów węgla. Optymalną wydajność biosyntezy tłuszcze osiąga się wówczas, gdy spełnione są nast. warunki: - stężęnia n-alkanów wynosi 10% (v/v); -inokulum zawiera kom pobarane podczas lub w końcu ich log fazy wzrostu; -inokulum stosuje się w ilości 3-10%. Zwiększanie wydajności syntezy kw tłuszcz jest możliwe do osiągnięcia przez: - wstępne namnażanie drobnoust na tanim substracie o wymaganym poziomie azotu w stosunku do węgla i przeszczepienie ich na pożywkę zaw n-alkany. W tych war dochodzi do intensywnej syntezy tłuszczu; - zastosow stabilnych preparatów enzymat utleniających węglowodory. Duża zdolność wykorzystania przez drożdże większości n-alkanów wynika z ich niewielkiej toksyczności. Od rodzaju uzytych węglowodanów oraz od fazy wzrostu drożdży zależy min skład tłuszczu mikroorg. Innym substratem często stosowanym do mirobiol synt tłuszcz jest glukoza. Zależnie od rodzaju, drożdże wykaz pewne zróżnicow podczas ich namnażania w pożywce z glukozą. W drożdżach namnażanych w pożywce z glukozą dominuja triacyloglicerole typu nasycone-nienasycone-nasycone. Do celów syntezy tłuszczu mikrobiol wykorzyst się też odpady przemysłu spożywczego lub chem przede wszystkim cukrowniczego ( melasa), mleczarskiego ( serwatka) i celulozowego. Najbardziej obiecujące wyniki badań nad biosyntezą tłuszczu uzyskano na pożywce z serwatki z zastosow drożdży Apiotrichum curvatum i Trichosporum cutaneum zdolnych do przemiany laktozy w tłuszcz. To wskazuje na możliwość wdrożenia ich do produkcji przemysł tłuszczu. Perspektywy substytucji tradycyjnych tłuszczów roślinnych stwarzaja możliwość ich biosyntezy przez drożdże w pożywce z serwatki lub odcieku po jej ultrafiltracji. Lipidy stanowią ok. 50% s.s biomasy Apiotrichum curvatum i zaw 80-90% triacylogliceroli oraz niewielką ilość wolnych kw tłuszcz. Wydajność biosyntezy tłuszczu przez ten szczep namnażany w odcieku po ultrafiltracji serwatki, wynosi 15,6 g/dm3 pożywki. Drożdże predysponowane do biosyntezy tłuszczu w optymat warunkach nie zawieraja w suchej substancji mniej niż 55-65% lipidów. W ich składzie kw tłuszczowe jako acyloglicerole stanowia ok. 70%. Wydaje się że najbardziej celowa byłaby mikrobiol produkcja substytutów masła kakaowego którego koszt jest bardzo wysoki ze wzg na wyjątkowy skład, a zwłaszcza dużą zawartość symetrycznie nasyconych triacylogliceroli. Ich wysoki poziom w lipidach Candida 107 sugeruje możliwość otrzymania z tego źródła substytutów masła kakaowego. Biosynteza tłuszczu jest procesem bardziej opłacalnym niż biosynteza białka. Najkorzyst wydaje się prowadzenie procesu ciągłego w biosyntezie tłuszczu ze wzg na jego wydajność oraz opłacalność wynikające z dużej produktywności fermentora oraz ekonomicznego wykorzystania źródła węgla. Duże znaczenie przywiąz się do wykorzyst w przyszłości celulozy jako jednego z najbardziej rozpowszech źródeł węgla w świecie. Rozwiązanie problemu hydrolizy celulozy do cukrów wykorzyst w procesie fermentacji może stać się podstawą zastosow tego surowca do biosyntezy tłuszczu i w innych procesach fermentacyjnych.

42.Pyt. KURDLAN

SZCZEP:Alcaligenes faecalis var myxogenes

POŻYWKA: glukoza, sacharoza, cytrynian, furmaran, glikol polietylenowy ,sole mineralne

pH 6,5-8

WYDZIELANIE1.Rozpuszcanie w środowisku zasadowym

2.wirowanie 3. neutralizacja 4. wytrącanie alkoholem etylenowym 5. odwirowanie, przemywanie wodą i suszenie

WŁAŚCIWOŚCI: tworzy żel w temp>54C stabilny w pH 3-9,5, elastyczny i trwały, do produkcji delicji, marmoladek, preparatów zagęszczających, żywności niskokalorycznej, biodegradowalnych opakowań, do immobilizacji enzymów, odporny na zamrażanie

PIMARYCYNA -należy do antybiotyków tzw .makrolidów polienowych, syntetyzowana przez Streptomyces natalensis.

WŁAŚCIWOŚCI I ZASTOSOWANIE

-działanie przeciwgrzybowe i przeciwpleśniowe(nie migruje w głąb produktów hamuje rozwój pleśni i grzybów w i na powierzchni żywności)

-stosowana do ochrony powierzchni serów i kiełbas

-jako dodatek do soków owocowych i win

-skuteczna już w bardzo małych stężeniach, nie zmienia cech organoleptycznych produktów

POŻYWKA

-źródło C: glukoza, sacharoza, laktoza, skrobia, glicerol

-źródła N: kazeina, hydrolizaty kazeiny, namok kukurydziany, mąka sojowa, ekstrakt drożdżowy

+dodatek olejów roślinnych i zwierzęcych

WARUNKI HODOWLI:

-temp. 26-28C, czas:48-120 godz.(nawet do 14 dni)pH:6,5-8(stałe)

WYDZIELANIE Z PŁYNU POHODOWLANEGO:

-Po zakończeniu hodowli doprowadzamy pH do 10,3(dodatek KOH),oddzielamy grzybnię

-dodajemy kw. Fosforowego do pH 2,8(uzyskujemy osad)i dodajemy alkohol n-butylowy

-Otrzymany ekstrakt3x przemywamy4%kw.borowym, a następnie3x wodą

-zagęszczamy w temp 44C i po oziębieniu do 0C-krystalizujemy.

Z GRZYBNI wydzielamy ekstrahując alkoholem metylowym.

ROLA KOBALTU W SYNTEZIE WITAMIN

:Gł. Rola w biosyntezie Wit B12(cyjanokobalamina), dodatek soli kobaltowych do pożywki jest niezbędny do biosyntezy tej witaminy. Zbyt duże stężenie przekraczające 50ppm może tez działać hamująco. Stosowany jako prekursor, stymuluje syntezę witaminy B12.

1

maltoza

β-amylaza, izoamylaza

β-amylaza

glukoamylaza

glukoza

glukoamylaza, pullulaza

oksydaza glukozowa

fruktoza

izomeraza glukozowa

Kwas glukozowy

Liniowe maltodisacharydy

liniowe i rozgałęzione maltodisacharydy

α-amylaza

Amylaza

amylopektyna

α-amylaza

---