17 stycznia 2007 r.

Analiza DNA znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach. Należą do nich przede wszystkim diagno­styka medyczna (transplantologia, diagnostyka prenatalna chorób dziedzicznych itp.), medycyna są­dowa (ustalanie pokrewieństwa, badania identyfikacyjne) i kryminalistyka. Jest również niezbędna w takich dziedzinach jak: mapowanie genetyczne, antropologia, genetyka populacyjna, biologia ewolu­cyjna, hodowla roślin i zwierząt, systematyka itd.

Z historii badań DNA:

1902 r. odkrycie układu antygenów grupowych krwi AB0 (Landsteiner, Richter)

1958 r. opisanie układu antygenów zgodności tkankowej HLA

1970 r. początek trawienia DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych (Arber, Nathans, Smith)

1975 r. technika transferu i hybrydyzacji DNA (Southern)

1977 r. technika sekwencjonowania (Sanger, Maxam, Gilbert)

1978-80 r. koncepcja metody RFLP (Salomon, Bodner, Batstein)

1981 r. zsekwencjonowanie mtDNA (Anderson)

1983 r. opracowanie techniki PCR (Saiki, Mullis)

1985 r. opisanie polimorfizmu sekwencji minisatelitarnych (VNTR), sondy multilokusowe, tech­nika „DNA fingerprinting”(Jeffreys)

1987 r. sondy jednolokusowe (Wong, Nakamura)

1991 r. opisanie polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych (STR)

1993 r. rutynowe badania DNA w ponad trzydziestu krajach

2001 r. opisanie polimorfizmu pojedynczych nukleotydów (SNP)

DNA jako dowód w sądzie:

1985 r. pierwszy dowód z badań DNA w sprawie imigracyjnej

1987 r. pierwszy dowód w sprawie o morderstwo w Wielkiej Brytanii

1988 r. dowód w sprawie o morderstwo i gwałt w USA

1994 r. pierwsza formalna baza danych DNA - CODIS

2001 r. pierwszy dowód sądowy z badań DNA mitochodrialnego

Informacja genetyczna komórki. Modele dziedziczenia

Całość informacji genetycznej komórki podzielona jest pomiędzy genom jądrowy i mitochondrialny.

Genom jądrowy obejmuje 3×10⁹ pz. Sekwencje kodujące, czyli geny, których liczba szacowana jest na ok. 30 tysięcy, stanowią tylko ok. 20% genomu. Pozostałe 80% stanowią sekwencje niekodujące.
O polimorfizmie DNA jądrowego stanowią:

• tandemowe sekwencje repetytywne (20-30% wszystkich sekwencji niekodujących);

• zmienność pojedynczych nukleotydów (p. niżej).

DNA mitochondrialny (mtDNA) jest kolistą czą­steczką, zawierającą jedynie 16 579 pz, w tym 37 ge­nów. Źródłem zmienności są dwa regiony zawierające sekwen­cje nieko­dujące: HV1 i HV2, liczące w sumie 1200 pz. Region HV1, leżący pomiędzy 16024. a 16365. parą nu­kleoty­dów, zawiera 50 loci SNP. Region HV2 leży po­między 73. a 340. parą nukleotydów i obejmuje 28 loci SNP. W tych dwóch regionach poszukuje się zmienności mtDNA.

Dziedziczenie informacji genetycznej zawartej w genomie jądrowym odbywa się zgodnie z prawami Mendla. Według prawa czystości gamet (I prawo Mendla) każda gameta wytwarzana przez organizm posiada tylko jeden gen z danej pary alleli. Prawo niezależnej segregacji cech (II prawo Mendla) mówi, że geny należące do dwóch różnych par alleli są rozdzielane do gamet niezależnie od siebie. Prawa te nie dotyczą DNA mitochondrialnego, które nie rekombinuje, lecz dziedziczy się wyłącznie z linii matczynej.

Wyróżniamy dwa typy zmienności dziedzicznej:

1. zmienność rekombinacyjna → tworzenie nowych układów istniejących już alleli na skutek róż­nych kombinacji cech rodzicielskich i wymiany homologicznych fragmentów DNA (tylko ge­nom jądrowy);

2. zmienność mutacyjna → tworzenie nowej informacji genetycznej; nagłe, skokowe zmiany przeka­zywane potomstwu, powstające na skutek tranzycji, insercji, delecji lub mutacji punkto­wych (genom jądrowy i mitochondrialny).

Rodzaje polimorfizmu DNA:

1. Polimorfizm pojedynczych nukleotydów (Single Nucleotide Polymorphism, SNP).

SNP oznacza utrwalone mu­tacje punktowe występujące z częstością min. 1%. Polimorfizm w obrę­bie jednego locus jest bardzo mały, gdyż obejmuje tylko trzy możliwości (np. homozygota AA, homozygota GG, heterozygota AG). Niską zmienność rekompensuje jednak bardzo duża ilość miejsc zmiennych. Mutacja punktowa przy­pada średnio raz na każde 1000 pz, nie wyłą­czając sekwencji kodujących. Wielka liczba loci jest źró­dłem olbrzymiej zmienności, rozłożo­nej równomiernie w całym genomie, co czyni metodę SNP szczególnie wartościową w przy­padku badania DNA zdegradowanego, niemożliwego do oceny in­nymi metodami. Przykładami SNP są m.in. polimorfizm układów grupowych krwi, lekowrażliwość, a także niektóre choroby genetycznie uwarunkowane (np. mukowiscydoza, fenyloketonuria, achondro­plazja, hemofilia A, anemia sierpowatokrwinkowa itd.).

2. Polimorfizm DNA satelitarnego (krótkich sekwencji tandemowych).

Mianem DNA satelitarnego określa się zespoły sekwencji powtórzonych, ułożonych jedna za drugą (tandemowo). DNA satelitarny dzieli się na minisatelitarny (Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) i mikrosatelitarny (Short Tandem Repeats, STR). Różnice między nimi przed­stawia tabela:

	DNA minisatelitarny	DNA mikrosatelitarny
Długość motywu repetytywnego	9-100 pz	2-6 pz
Ilość tandemowych powtórzeń	kilkadziesiąt	kilkanaście
Odległość między sąsiednimi loci	500-20 000 pz	5-500 pz

Polimorfizm SNP a polimorfizm VNTR:

Metody wykrywania polimorfizmu DNA:

1. ANALIZA RESTRYKCYJNA ( = analiza długości fragmentów restrykcyjnych, Restriction Fragments Length Polymorphism, RFLP):

1. analiza pojedynczego locus (Single Locus Probes, SLP) → PROFIL;

2. jednoczesna analiza wielu loci (Multiple Locus Probes, MLP) → FINGER­PRINT.

W metodzie tej wykorzystuje się trawienie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych, czyli enzymów bakteryjnych przecinających nić w ściśle określonym miejscu. Kolejne etapy metody to: elektroforetyczny rozdział pociętego DNA, denaturacja DNA w alkalicznym roztworze, transfer metodą Southerna na nylonową (nitrocelulozową) membranę i hybrydyzacja ze specy­ficznymi sondami. Wystarczy zmiana pojedynczego nukleotydu w sekwencji rozpoznawanej przez enzym, aby nie był on w stanie przeciąć DNA. Spowoduje to zmianę liczby powstałych fragmentów DNA (produktów rozkładu pierwotnej cząsteczki) oraz ich wielkości. Jedno i dru­gie ujawnia rozdział elektroforetyczny.

2. ENZYMATYCZNA AMPLIFIKACJA (reakcja łańcuchowa polimerazy, Polymerase Chain Re­action, PCR):

1. polimorfizm DNA mikrosatelitarnego (STR);

2. polimorfizm pojedynczych nukleotydów (SNP).

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest metodą powielania łańcuchów DNA w warunkach labo­ratoryjnych, polegającą na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Do re­akcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery oraz termostabilną polimerazę. Na początku w wysokiej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. Obni­żenie temperatury do optymalnej wartości, ściśle określonej dla danej pary starterów (45-70°C), powoduje ich przyłączenie do matrycy. Ponowne podwyższenie temperatury do około 72°C sprzyja utworzeniu kompleksu między matrycą i starterami a polimerazą DNA, co roz­poczyna syntezę nici komplementarnej do matrycy.

Wielkimi zaletami metody są jej bardzo wysoka czułość oraz wydajność. (Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2ⁿ czą­steczek; wy­dajność rzeczywista jest niewiele mniejsza).

Odmianą reakcji PCR jest tzw. PCR w czasie rzeczywistym (Real Time PCR, RT-PCR). Jest to metoda ilościowego oznaczania DNA, pozwalająca na monitorowanie reakcji w czasie, w któ­rym ta reakcja przebiega. RT-PCR wymaga termocyklera z odpowiednim systemem biolo­gicz­nym, specjalnie zaprogramowanych sond oraz dodania barwników fluorescencyjnych in­korpo­rujących podwójną nić DNA (np. bromku etydyny). Monitorowanie zmian w stężeniu pro­duktu następuje poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do ilości produktu w miesza­ni­nie.

Inną odmianą jest tzw. multiplex PCR (MPCR), która polega na równoczesnej amplifikacji dwóch lub większej liczby (do 16) markerów genetycznych w jednej mieszaninie reakcyjnej. Możliwe jest to dzięki zastosowaniu kilku par starterów, determinujących amplifikację pro­duktów różnej długości. Detekcję ułatwia oznakowanie markerów różnymi fluorochromami. Główne zalety MPCR to: obniżenie nakładu pracy, zmniejszenie kosztów, możliwość uzyska­nia większej ilości informacji o badanym materiale i zmniej­szenie ryzyka kontaminacji.

Identyfikacja liczby powtórzeń motywu repetytywnego metodami PCR i RFLP:

3. TECHNIKA DOT BLOT, czyli testu kropkowego z zastosowaniem oligonukleotydu specyficz­nego dla danego allelu (Allele Specific Oligonucleotide, ASO).

W technice ASO wykorzystuje się oligonukleotydowe sondy komplementarne do okre­ślonego allelu danego genu (np. do genu dystrofiny zawierającego mutację powodującą dystro­fię Du­chenne'a). Powielony produkt reakcji PCR nanoszony jest na nylonową membranę. Na­stępnie hybrydyzuje się go z biotynylowaną sondą, komplementarną do poszukiwanego allelu. Następ­nie membranę inkubuje się z enzymem peroksydazą chrzanową (horseradish peroxi­dase, HPR), która wiąże się z sondą poprzez kompleks biotyna-streptawidyna. Na koniec do środo­wiska reakcji dodaje się bezbarwny substrat, który związana peroksydaza przekształca w barwny produkt. Jeśli w powielonym fragmencie DNA nie występuje poszukiwana mutacja, sonda nie hybrydyzuje, a co za tym idzie - nie dochodzi do przyłączenia peroksydazy i zabar­wienia sub­stratu.

Technika ASO jest szczególnie użyteczna w ustalaniu nosicielstwa zmutowanego genu i szyb­kiej diagnostyce chorób genetycznie uwarunkowanych, takich jak fenyloketonuria, dystrofia mięśniowa, zespół łamliwego chromosomu X i in.

Na podobnej zasadzie opiera się analiza DNA przy użyciu tzw. mikromacierzy. Idea mikro­ma­cierzy wywodzi się bezpośrednio z trady­cyjnych technik analizy ekspresji genów. Mi­kro­ma­cierz DNA (DNA microarray) jest to szklana lub plastikowa płytka z naniesio­nymi w re­gular­nych pozycjach mikroskopo­wymi fragmentami DNA, różniącymi się od siebie sekwen­cją. Fragmenty te pełnią rolę sond, które wykrywają przez hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA. W zależności od rodzaju i pocho­dzenia cząsteczek umiesz­czonych na szkla­nym podłożu wyróżnia się dwa rodzaje mi­kromacierzy: mikromacierze cDNA oraz mi­kromacierze oligonukleotydowe, zwane też „chipami DNA”. Nanosząc na mi­kroma­cierz znakowaną próbkę badanego materiału biolo­gicznego, można w jednym ekspery­mencie prze­analizować ekspresję tylu genów, ile re­prezentujących je sond naniesiono na pod­łoże (czyli nawet kilkudziesięciu tysięcy). Stało się to możliwe dzięki miniaturyzacji sond oraz za­stoso­waniu specjalnych barwników fluore­scencyjnych. Dane zbierane są przez czytnik konfo­kalny, po wzbudzeniu znaczników flu­orescencyjnych światłem lasera o odpowied­niej długości. Zmie­rzona intensywność flu­orescencji, pomniejszona o wartość tła, obra­zuje ilość cząsteczek, które hybrydyzowały do danego elementu mikromacierzy.

4. SEKWENCJONOWANIE.

Sekwencjonowanie DNA jest techniką odczytywania kolejności zasad azotowych tworzących cząsteczkę. Obecnie najczęściej używaną metodą jest metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksy­nukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dal­sze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakoń­czone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powo­duję ich segregację pod względem wielkości. Trifosforany dideoksynukleotydów znakowane są fluorochromami, dzięki czemu odczyt może być w pełni zautomatyzowany.

Najdoskonalszą z technik odczytu jest analiza produktów sekwencjonowania w żelach kapilar­nych (kapilarna elektroforeza żelowa). Elektroforeza kapilarna (capillary eletrophoresis, CE) obejmuje rodzinę technik analitycznych, których wspólną cechą jest rozdział molekuł pod wpływem zewnętrznego pola elektrycznego, w cienkiej kapilarze o średnicy rzędu kilkudzie­sięciu mikrometrów. Analizator prowadzi odczyt jednocześnie w 16 kapila­rach, co pozwala w ciągu godziny ocenić 600 Kpz. Ograniczeniem metody są wysokie koszty (koszt analizatora wynosi ok. 600 tys. PLN).

Najnowszą metodą analizy sekwencyjnej DNA jest pirosekwencjonowanie, zwane również sekwencjonowaniem w czasie rzeczywistym (www.pyrosequencing.com). W metodzie tej, po­dobnie jak w poprzedniej, na matrycy badanej nici DNA odbywa się synteza nici komple­mentarnej. W środowisku reakcji poza DNA i polimerazą znajdują się: siarczan 5'-fosfoadeno­zyny, lucyfe­ryna oraz enzymy apyraza, ATP-sulfurylaza i lucyferaza.

Polimeraza DNA syntetyzuje łańcuch komplementarny na matrycy badanej nici DNA (powie­lonej metodą PCR). Do mieszaniny reakcyjnej dodawane są etapami kolejne nukleotydy. Jeśli dodany nukleotyd nie zostanie wbudowany w nowo powstającą nić, jest niszczony przez en­zym apyrazę. Jeśli dodany nukleotyd zawiera komplementarną zasadę, jest wbudowywany do syntetyzowanej nici z uwolnieniem cząsteczki pirofosforanu. Uwolniony pirofosforan i siar­czan 5'-fosfoadenozyny służą jako substraty dla ATP sulfurylazy, która syntetyzuje cząsteczkę ATP. Energia z ATP umożliwia katalizowaną przez lucyferazę przemianę lucyferyny do oksylucyferyny. Jest to reakcja chemiluminescencyjna. Emisja światła rejestrowana jest przez kamerę i zapisywana na wykresie reakcji w postaci piku, którego wysokość jest proporcjonalna do ilości wbudowanych nukleotydów.

Pirosekwencjonowanie jest najszybszą obecnie metodą analizy DNA. Jej wadą jest ograni­czona długość nici, którą można jednorazowo poddać sekwencjonowaniu.

Analiza DNA w medycynie sądowej

Zastosowanie analizy DNA w medycynie sądowej obejmuje:

1. Badanie pokrewieństwa:

• sprawy alimentacyjne (zazwyczaj dochodzenie ojcostwa);

• badania osób zaginionych;

• sprawy spadkowe;

• sprawy imigracyjne (w tych krajach, w których dopuszcza się łączenie rodzin).

2. Badania identyfikacyjne:

• ustalanie pokrewieństwa osób;

• identyfikacja sprawców przestępstw;

• tworzenie baz profili DNA;

• identyfikacja osób w katastrofach masowych.

Cechy dobrego markera DNA

Markery DNA stosowane w medycynie sądowej powinny charakteryzować się takimi cechami jak wy­soki stopień polimorfizmu, wysoka heterozygotyczność i niski stopień mutacyjności. Przydatnym po­jęciem jest siła dyskryminacji (power of discrimination, PD), czyli prawdopodobieństwo, że dwie lo­sowo wybrane osoby z populacji nie będą posiadały takich samych cech.

W badaniach identyfikacyjnych przeprowadza się analizę uzyskanego profilu DNA i szacuje prawdo­podobieństwo przypadkowej zgodności. Przy badaniu 3 loci STR prawdopodobieństwo to wynosi 10^-4 (1:10 tys. osób). Przy badaniu 10 loci jest to już 10^-13, a przy 15 loci - 10^-18 osób. Zazwyczaj bada się 5 loci minisatelitarnych = 15 STR = 50 SNP.

Dokładność analizy genetycznej sprawia, że polimorfizm DNA określa się mianem „daktyloskopii molekularnej”.

Dochodzenie spornego ojcostwa

Podstawy prawne badań dochodzenia spornego ojcostwa zawiera Kodeks Rodzinny i Opiekuńczy (Tytuł II, Dział I, Rozdział I: Pochodzenie dziecka):

Proces o ustalenie ojcostwa:

Art. 84. § 1. Sądowego ustalenia ojcostwa może żądać dziecko, jego matka oraz domniemany ojciec dziecka. Jednakże matka ani domniemany ojciec nie mogą wystąpić z takim żądaniem po śmierci dziecka lub po osiągnięciu przez nie pełnoletniości.

§ 2. Dziecko albo matka wytacza powództwo o ustalenie ojcostwa przeciwko domniemanemu ojcu, a gdy ten nie żyje - przeciwko kuratorowi ustanowionemu przez sąd opiekuńczy.

§ 3. Domniemany ojciec dziecka wytacza powództwo o ustalenie ojcostwa przeciwko dziecku i matce, a gdy matka nie żyje - przeciwko dziecku.

Art. 85. § 1. Domniemywa się, że ojcem dziecka jest ten, kto obcował z matką dziecka nie dawniej niż w trzechsetnym, a nie później niż w sto osiemdziesiątym pierwszym dniu przed urodzeniem się dziecka.

§ 2. Okoliczność, że matka w tym okresie obcowała także z innym mężczyzną, może być pod­stawą do obalenia domniemania tylko wtedy, gdy z okoliczności wynika, że ojcostwo innego mężczyzny jest bardziej prawdopodobne.

Art. 86. Powództwo o ustalenie lub zaprzeczenie pochodzenia dziecka oraz o unieważnienie uznania dziecka może wytoczyć także prokurator.

Proces o zaprzeczenie ojcostwa:

Art. 62. § 1. Jeżeli dziecko urodziło się w czasie trwania małżeństwa albo przed upływem trzystu dni od jego ustania lub unieważnienia, domniemywa się, że pochodzi ono od męża matki. Domniemania tego nie stosuje się, jeżeli dziecko urodziło się po upływie trzystu dni od orzeczenia separacji.

§ 2. Jeżeli dziecko urodziło się przed upływem trzystu dni od ustania lub unieważnienia mał­żeństwa, lecz po zawarciu przez matkę drugiego małżeństwa, domniemywa się, że pochodzi ono od drugiego męża.

§ 3. Domniemania powyższe mogą być obalone tylko na skutek powództwa o zaprzeczenie oj­costwa.

Art. 63. Mąż matki może wytoczyć powództwo o zaprzeczenie ojcostwa w ciągu sześciu mie­sięcy od dnia, w którym dowiedział się o urodzeniu dziecka przez żonę.

Badania przeprowadzane w celu ustalenia ojcostwa ocenia się wg parametru znanego jako siła wyłą­czenia (power of exclusion, PE). Jest to odsetek niesłusznie pozwanych mężczyzn, którzy zostaną wyłączeni w toku badania.

Kolejność badań w rutynowym procesie o ustalenie ojcostwa obejmuje:

1. Ekspertyzę Iº HLA → wyłączenie ojcostwa lub jego brak.

2. Ekspertyzę DNA → wyłączenie ojcostwa lub jego potwierdzenie z prawdopodobieństwem grani­czącym z pewnością.

Identyfikacja płci

Profil genetyczny płci ustala się w oparciu metodę PCR, na podsta­wie analizy genu amelogeniny (amelogenin, AMG). Gen ten jest w 90 % homologiczny dla chromosomów X i Y. Różnica jest skut­kiem delecji, występującej na chromosomie Y. Przy zastosowaniu takiej samej pary starterów PCR amplifikacji ulegają więc dwa odcinki DNA o różnych długościach. Krótszy, o wielkości 788 pz, jest cha­rakterystyczny dla chromosomu Y (Y AMG). Dłuższy, o wielkości 977 pz, jest swoisty dla chro­mosomu X (X AMG). Stwierdzenie w elektroforezie mniejszego i większego produktu PCR świadczy o obecności w śladzie chromosomów X oraz Y i jest dowodem, że po­chodzi on od mężczyzny. Nato­miast wykrycie jedynie fragmentu dłuższego, swoistego dla chromosomu X, jest dowodem pochodze­nia śladu od kobiety. Analiza genu AMG jest metodą bardzo czułą - wystarcza do niej obecność nie­wielkiej ilości chromosomalnego DNA (poniżej 400 pg).

Rysunek przedstawia rozdział elektroforetyczny genów Y-AMG i X-AMG.

Prążek 788 pz pochodzi z chromosomu Y, 977 pz z chromosomu X. Obecność dwóch prążków (1) wskazuje na pochodzenie materiału genetycznego od mężczy­zny, obecność jednego prążka (2) na pochodzenie od kobiety; M - marker.

Inną metodą identyfikacji płci jest badanie markerów chromosomu Y. Są one absolutnie specyficzne dla mężczyzn (nie rekombinują). Genetyczna zmienność typu STR w wielu obszarach chromosomu Y tworzy tzw. haplotyp, przekazywany w linii męskiej z pokolenia na pokolenie. Badanie markerów chromosomu Y umożliwia:

• stuprocentowo pewną identyfikację DNA mężczyzny (sprawcy 97% przestępstw!);

• wykrywanie przestępstw na tle seksualnym (badanie mieszanin materiału genetycznego sprawcy i ofiary);

• ustalanie pokrewieństwa w linii męskiej.

Odpowiednikiem markerów chromosomu Y u kobiet jest DNA mitochondrialny, który również nie re­kombinuje i przekazywany jest wyłącznie w linii matczynej. Ocenie podlegają regiony HV1 i HV2, które bada się w kierunku zmienności typu SNP. Sekwencją referencyjną, służącą porównywaniu z badanym materiałem, jest tzw. sekwencja Andersona. Badanie markerów mtDNA jest użyteczne w ta­kich sytuacjach jak:

• ustalanie pokrewieństwa w linii żeńskiej;

• badanie włosów, śladowych ilości DNA lub DNA zdegradowanego.

Art. 86 dotyczy sytuacji wyjątkowych (gwałt, kazirodztwo, obcowanie z nieletnim itp.).

Badania ludzkiego mtDNA doprowadziły do ustalenie jego „drzewa genealogicznego”, którego początków upatruje się w Afryce ok. 200 tys. lat temu. Wyniki badań sugerują, że wszyscy ludzie zamieszkujący dziś obszar ziemi są potom­kami jednej kobiety (ewolucyjna teoria „Ewy mitochondrialnej”).

SNP

VNTR

---