L.Zaremba, J.Borowski „Podstawy mikrobiologii lekarskiej”

E.M.Szewczyk „Diagnostyka bakteriologiczna”

Charakterystyka pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae

Rodzina Enterobacteriaceae (informacje ogólne):

Systematyka i charakterystyka pałeczek jelitowych.

Pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae (pałeczki jelitowe) stanowią dużą, blisko spokrewnioną grupę bakterii, na którą składa się czterdzieści rodzajów obejmujących ponad dwieście gatunków.

Rodzaje:

Escherichia

Enterobacter

Erwinia

Edwardsiella

Citrobacter

Yersinia

Proteus

Klebsiella

Dział	Klasa	Rząd	Rodzina	Rodzaj
				Cedecea
				Citrobacter
				Edwardsiella
				Enterobacter
				Escherichia
				Hafnia
				Klebsiella
Proteobacteriae	y- Proteobacteriae popwjispPProteobacteriae	Enteroba- cteriales	Entero- bacteriaceae	Kluyvera
		cteriales	bacteri- aceae	Morganella
	Proteobacterie			Pantoea
				Proteus
				Providencia
				Salmonella
				Serratia
				Shigella
				Yersinia

Salmonella

Shigella

Morganella

Providencia

Hafnia

Serratia

Oprócz wymienionych w tabeli jeszcze jeden rodzaj - Plesiomonas, należący do rodziny Enterobacteriaceae, ma istotne znaczenie kliniczne. Ze względu na znacznie większe podobieństwo fenotypowe do podanych drobnoustrojów i wynikającą z tego konieczność różnicowania z nimi. Rodzaj ten był już wcześniej klasyfikowany właśnie w rodzinie Vibrionaceae. Wiele rodzajów rodziny Enterobacteriaceae (np. rodzaje Escherichia, Enterobacter. Klebsiella) zasiedla jelita zdrowych ludzi i zwierząt. Inne (Salmonella, Shigella czy Yersinia) są bezwzględnymi patogenami odpowiedzialnymi za takie choroby, jak dur brzuszny, czerwonka czy toksykoinfekcje pokarmowe. Wcześniej stosowany podział rodzajów tej rodziny na siedem trybów nie znalazł w diagnostyce ani taksonomii i został zarzucony, choć spotyka się go jeszcze w niektórych publikacjach. Nazwy trybów odpowiadały dominującym w nich rodzajom. Wszystkie bakterie wchodzące w skład rodziny Enterobacteriaceae są bar­dzo podobne do siebie zarówno pod względem morfologii komórek, morfologii kolonii, jak i metabolizmu. Są dużymi gramujemnymi pałeczkami o średnicy do 2 μm i długości do 6 μm. Wiele rodzajów jest urzęsionych. Mają niewielkie wymagania odżywcze, są prototrofami. To względne beztlenowce, które wyrastają zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, prowadząc metabolizm fermentacyjny. Na podłożach stałych tworzą duże, błyszczące, przeważnie szare kolonie.

Miejsca bytowania i chorobotwórczość pateczek rodziny Enterobacteriaceae

Chorobotwórczość

		Escherichia	flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne; serotypy bezwzględ­nie chorobotwórcze
		Shigella	bezwzględnie chorobotwórcze, nosicielstwo
		Salmonella	bezwzględnie chorobotwórcze, nosicielstwo
		Citrobacter	flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne, zakażenia szpitalne
		Edwardsiel/a	infekcje oportunistyczne
		Kluyvera	flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne
		Cedecea	flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne
		Yersinia	środowisko, serotypy chorobotwórcze, nosicielstwo
	Grupa KĘS	Klebsiella	flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne; zakażenia szpitalne
		Enterobacter	środowisko, flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne, zakaże­nia szpitalne
		Serratia	flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne, zakażenia szpitalne
		Pantoea	flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne
		Hafnia	flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne
	Grupa Proteus	Proteus	środowisko, flora jelitowa człowieka; infekcje oportunistyczne, zakaże­nia szpitalne
		Morganella	środowisko, flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne; zakaże­nia szpitalne
		Providencia	środowisko, flora jelitowa człowieka, infekcje oportunistyczne; zakaże­nia szpitalne

Wszystkie pałeczki Enterobacteriaceae mają wspólne cechy biochemiczne:

• fermentują glukozę (często z wytworzeniem gazu),

• nie wytwarzają oksydazy cytochromowej,

co wyraźnie odróżnia je od innych, podobnych morfologicznie i żywieniowe gram-ujemnych pałeczek. Pałeczki jelitowe mają także dwie inne wspólne, ale słabiej dyskryminujące je cechy:

• zdolność redukcji azotanów do azotynów,

• wytwarzanie katalazy.

Inne liczne cechy biochemiczne składają się na opis poszczególnych rodzajów wpływają na ich różnicowanie, jednak niektóre gatunki mogą wykraczać poza ramy opisu i stanowią problem diagnostyczny. W obrębie pewnych rodzajów dużą : dla różnicowania gatunków odgrywa także identyfikacja serologiczna, wykorzystująca złożoną budowę antygenową komórek tych pałeczek.

Bakterie te posiadają czynniki zjadliwości:

- K-antygen otoczkowy- np. u Klebsiella,

- O-antygen somatyczny (LPS), (nie zero, ale O)

- H-antygen rzęskowy,

- ponadto posiadają toksyny- egzotoksyny, enterotoksyny (np. u E.coli), oraz czynniki adhezyjne.

RODZINA ENTEROBACTERIACEAE

Pałeczki gram-ujemne, ruchome dzięki obecności rzęsek (wkołorzęse) z wyjątkiem rodzajów Klebsiella i Shigella. Mogą wytwarzać otoczki (np. antygen K w rodzaju Klebsiella), mikrootoczki (śluz, antygen Vi, u SaJmonella typhi i niektórych Citrobacter spp.). Nie wytwarzają przetrwalników. Wzrastają w warunkach tlenowych lub względnie beztlenowych. Są chemoorganotrofami z metabolizmem tlenowym i bez­tlenowym (fermentacja). Fermentują glukozę, a także inne węglowodany i alkohole z wytworzeniem gazu lub bezgazowo (z wyjątkiem Shigella sonnei - nie rozkłada glukozy). Są katalazo-dodatnie, z nielicznymi wyjątkami i oksydazo-ujemne (nie wytwarzają oksydazy cytochromowej). Powodują redukcję azotanów do azotynów. Nie wytwarzają deoksyrybonukleazy (DNaza), z wyjątkiem rodzaju Serratia. Nie powodują tlenowej dezaminacji fenyloalaniny, z wyjątkiem rodzajów Proteus, Providencia i Mor-ganella (DL-F). Niektóre mogą produkować siarkowodór (Salmonella spp., Proteus spp., C. freundii, E. tarda) lub wytwarzać ureazę (K. pneumoniae, Proteus spp., Morganella morganii, Providencia rettgeri, Yersinia spp., inne zmiennie). Większość rodzajów i gatunków nie fermentuje laktozy; cecha ta jest pozytywna dla: E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp., C. freundii. Rosną dobrze na podłożach zwykłych, nieliczne wymagają specjalnych czynników wzrostowych. Optymalną temperaturą jest 35 - 37°C, z wyjątkiem rodzaju Yersinia i Erwinia (22 - 29°C). Pałeczki z rodzaju Yersinia są ruchome w tem­peraturze 22°C (antygen H), a nieruchome w temperaturze 37°C. Optymalny wzrost na podłożach stałych uzyskuje się w czasie 18 - 24 h, z wyjątkiem rodzaju Yersinia (do 72 h). Do hodowli tych bakterii wykorzystywane są podłoża wybiórczo-różnicujące, takie jak: MacConkeya, Endo, Levine'a (EMB) i/lub SS, DC, Hektoen, XLD, Wilson-Blaira lub inne wybiórcze dla określonych tylko rodzajów (Salmonella, Shigella, Yersinia). Niektóre podłoża umożliwiają różnicowanie kolonii na laktozo-dodatnie i laktozo-ujemne. Mogą wytwarzać barwniki w czasie wzrostu na podłożach; dotyczy to Serratia marcescens i S. rubidea (czerwony barwnik - prodigiozyna), Pantoea agglomerans (żółty) i Erwinia spp. (żółte, pomarańczowe, niebieskie). Zawartość G + C w DNA wynosi od 39 do 59 mol %. W skład rodziny wchodzi 20 rodzajów zgodnie z systematyką Bergeya (1984) oraz kilka dalszych dodanych do tej rodziny. W warunkach rutynowej diagnostyki podstawą przynależności do określonego gatunku i rodzaju są właściwości metaboliczne (biochemiczne); przy czym decyduje zespół cech. Ostateczna identyfikacja niektórych gatunków i rodzajów wymaga określenia właściwości antygenowych przy użyciu surowic odpornościowych (odczyny serologiczne); dotyczy to rodzajów Salmonel­la, Shigella i Yersinia. Wyróżnia się antygeny somatyczne O (LPS), rzęskowe (H), otoczkowe, fimbriowe.

Chorobotwórczość: Wyznacznikami chorobotwórczości u pałeczek z rodziny Enterobactriaceae są przede wszystkim endotoksyny (LPS). Niektóre pałeczki jelitowe mogą mieć dodatkowe wyznaczniki zjadliwości w postaci fimbrii zwykłych oraz zdolności do wytwarzania egzotoksyn lub enzymów toksycznych; odpowiadają one za adhezję i kolonizację, penetrację (inwazyjność) lub bezpośrednie działanie toksyczne.

Chorobotwórczość pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae dla ludzi można rozpa­trywać, podobnie jak ich właściwości biologiczne, w podobnych zespołach chorobowych. Częstość występowania poszczególnych gatunków w różnych zakażeniach jest zróż­nicowana w zależności od lokalizacji oraz od tego, czy jest to pierwotne zakażenie pozaszpitalne, czy zakażenie wtórne pacjentów hospitalizowanych. Wszystkie pałeczki mogą wywoływać wymienione niżej postacie klinicznych zakażeń:

Zakażenia przewodu pokarmowego: Dominują w tych zakażeniach pałeczki z rodzaju Salmonella, Shigella i gatunków Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, ostatnio również Enterobacter spp., pałeczki Proteus spp. i Hafnia alvei. Zakażenia przewodu pokarmowego najczęściej dotyczą jelita cienkiego, określane jako: enteritis, enterocolitis, gastroenterocolitis, z wyjątkiem pałeczek Shigella, których dominujące objawy pochodzą z miejscowego zakażenia błony śluzowej jelita grubego (czerwonka bakteryjna). Biegunka jest dominują­cym objawem w większości przypadków. Niektóre pałeczki mają szczególny tropizm do układu limfatycznego, zwłaszcza węzłów chłonnych krezki jelitowej wywołując ich zapalenie (lymphadenitis mesenterialis), co w obrazie klinicznym objawia się jako ostre, podostre lub przewlekłe zapalenie wyrostka robaczkowego (appendicitis acuta, subacuta lub chronica). Dotyczy to głównie pałeczek z gatunku Y. pseudotuberculosis i Y. en­terocolitica, oraz serotypu S. enteritidis, rzadziej niektórych serotypów E. coli. W zakaże­niach przewodu pokarmowego nie biorą udziału tylko pałeczki z gatunków Klebsiella ozaenae i K. rhinoscleromatis.

Zatrucia pokarmowe: Najczęściej wywoływane są przez pałeczki z rodzaju Salmonella, E. coli, Y. enterocolitica. Bakterie te również należą do dominujących wśród czynników bakteryjnych, tzw. biegunek podróżnych.

Zakażenia dróg moczowych: Dotyczą górnego odcinka (pyelonephritis - odmiedniczkowe zapalenie nerek) i dolnego (cystitis - zapalenie pęcherza i urethritis - zapalenie cewki moczowej). Ponad 80% wszystkich przypadków zakażeń dróg moczowych u pacjentów pozaszpitalnych wywoływanych jest przez E. coli i ponad 60% u pacjentów szpitalnych. W zakażeniach tych biorą udział głównie szczepy E. coli, mające fimbrie P (lub PAP). Za zakażenia dróg moczowych mogą być odpowiedzialne wszystkie gatunki wszystkich rodzajów rodziny Enterobacteriaceae, z wyjątkiem gatunków K. ozaenae, K. rhinoscleromatis i Shigella spp. Rzadko uczestniczą w tych zakażeniach pałeczki z rodzaju Salmonella i Yersinia. Pałeczki z rodzajów Proteus, Morganella, Providencia, Citrobacter, Serratia, Hafnia częściej niż inne wywołują zakażenia szpitalne układu moczowego; głównie dotyczy to pacjentów leczonych na oddziałach urologicz­nych, chirurgicznych, oddziałach intensywnej opieki medycznej. W tych ostatnich mogą uczestniczyć pałeczki z rodzaju Edwardsiella, Kluyvera i pałeczki z gatunku P. penneri (nowy gatunek dołączony do rodzaju Proteus, obok P. mirabilis, P. vulgaris i P. myxofaciens).

Zakażenia dróg oddechowych: Pałeczki jelitowe odpowiedzialne są często za zakażenie dolnych dróg oddechowych, głównie w różnych postaciach zapalenia płuc (pneumonia, bronchopneumonia, bronchiolitis, aspiracyjne zapalenie płuc), rzadziej za zapalenie oskrzeli (bronchitis) oraz za zakażenie górnych dróg oddechowych. W zakażeniach tych często uczestniczą pałeczki z rodzajów Klebsiella, Enterobacter i Serratia (KES), zwłaszcza u pacjentów hospitalizowanych, a także E. coli, C. freundii, Proteus spp., Hafnia alvei, sporadycznie także Yersinia spp., Salmonella spp. oraz inne.

Do swoistych zakażeń górnego odcinka układu oddechowego należą zakażenia wywołane przez gatunek Klebsiella ozaenae - czynnik etiologiczny jednostki chorobo­wej, znanej jako cuchnący nieżyt nosa (ozena) oraz gatunek K. rhinoscleromatis - czynnik etiologiczny choroby zwanej twardziela (scleroma) lub „trądem słowiańskim". Te dwa gatunki sporadycznie tylko biorą udział w zakażeniach ogólnoustrojowych (bakteriemie, posocznice lub zapalenie płuc).

Bakteriemie i posocznice: Pałeczki jelitowe są najczęściej izolowane wśród wszystkich bakteryjnych czynników z próbek krwi od pacjentów hospitalizowanych (od 10 do 80%). Dotyczy to szczególnie: E. coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp., Morganella morgami, Hafnia alvei, Salmonella spp., Citrobacter spp., rzadziej Yersinia spp., Erwinia spp. lub innych. Częstość udziału poszczególnych rodzajów czy gatunków jest zróżnicowana w zależności od kraju, oddziałów szpitalnych, a przede wszystkim od grup pacjentów z wysokimi czynnikami ryzyka (m.in. neutropenia, immunosupresja). Posocznice spowodowane przez te pałeczki są często (10-20-50%) bezpośrednią przyczyną zejścia śmiertelnego.

Zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych: Według danych z niektórych krajów pałeczki E.coli kwalifikowane są do najczęstszych czynników zapalenia opon mózgowo-rdzenio­wych u noworodków. Do zakażenia dochodzi podczas porodu, któremu często towarzy­szą powikłania. Dotyczy to zwłaszcza szczepów E. coli K1. U dorosłych natomiast odbywa się to na drodze krwiopochodnej; najczęściej jest to postać wtórna z pierwotnych ognisk zakażenia w układzie moczowym lub drogach żółciowych. Z płynu mózgowo-rdzeniowego często izolowane są szczepy E. coli mające antygen powierzchniowy K1; uważa się je za bardziej zjadliwe od szczepów, które takiego antygenu nie mają. Wskaźnik śmiertelności dla zakażeń tymi szczepami może wynosić około 30%, podczas gdy prawie wszyscy chorzy przeżywają przy zakażeniu szczepami pozbawionymi tego antygenu. Częstość powikłań neurologicznych zależy również od obecności antygenu K1, a jego ilość wykazywana bezpośrednio w płynie mózgowo-rdzeniowym może stanowić wartość prognostyczną. Szczepy E. coli K1 są podobne antygenowe do paciorkowców grupy B typu III, a także do Neisseria meningitidis. W zestawach do aglutynacji lateksowej przeznaczonych do wykrywania antygenów rozpuszczalnych w płynie móz­gowo-rdzeniowym znajdują się odczynniki do jednoczesnego wykrywania Streptococcus grupy B/E. coli K1. W niektórych krajach często wymieniane są serotypy 01, 06, 07, 016, 017 i 083, które są izolowane z płynu mózgowo-rdzeniowego. Oprócz E. coli wiele innych pałeczek gram-ujemnych może być odpowiedzialnych za zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Dotyczy to często: Klebsiella, głównie K. pneumoniae (zakażenia szpitalne u noworodków), Enterobacter spp., H. alvei, Serratia spp., Proteus spp., Salmonella spp., Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Citrobacter spp. Rzadkie są zakażenia pierwotne, częściej wtórne, jako następstwa bakteriemii lub towarzyszące posocznicy.

Układ kostno-stawowy: Izolowane ropnie kości z różną lokalizacją wywoływane są przez Yersinia spp., Salmonella spp., E. coli i inne. Postać osteomyelitis w ostatnich latach często pojawia się w związku z zakażeniem pałeczkami jelitowymi: E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. lub innymi. Izolowane ropne zapalenia stawu (np. kolanowe­go) rzadko wywołane mogą być przez pałeczki Y. pseudotuberculosis, Salmonella spp. i inne. Zapalenia stawów (arthritis) często towarzyszą zakażeniom pałeczkami z rodzaju Yersinia (częściej Y. enterocolitica) lub są ich następstwem z inną lokalizacją zakażenia (np. aseptyczne zapalenie wielostawowe lub inne - Y. enterocolitica) (p. Yersinia).

Zakażenia różne: E. coli, Yersinia spp., Salmonella spp., Edwardsiella spp., Erwinia spp. oraz inne gatunki mogą być przyczyną miejscowych zakażeń ropnych skóry, ropni narządów wewnętrznych (wątroba, śledziona, nerki), ropnego zapalenia pęcherzyka żółciowego lub dróg żółciowych, zapalenia otrzewnej oraz innych. Pałeczki jelitowe uwzględniane są w patogenezie różnych chorób tkanki łącznej, stawów, skóry, nerek, tarczycy i innych o podłożu autoimmunizacyjnym (np. Yersinia spp., Shigella spp., inne). Większość pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae określanych jest mianem bakterii oportunistycznych, a choroby przez nie wywoływane oportunistycznymi. Niektóre z rodzajów rodziny Enterobacteriaceae, ze względu na dominację w licznych zakażeniach, scharakteryzowano dokładniej.

Różnicowanie pałeczek w obrębie rodziny Enterobacteriaceae

W związku z częstą izolacją pałeczek jelitowych z materiałów zawierających bardzo bogatą florę towarzyszącą, różnicowanie w obrębie rodziny rozpoczyna zwykle posiew na podłoża wybiórczo-namnażające, na przykład SF, i jednocześnie na podłoża wybiórczo-diagnostyczne. Dużym ułatwieniem identyfikacji niektórych pałeczek jelitowych może być ponadto użycie równolegle tzw. podłóż chromogennych (pozwalają wykrywać aktywność enzymatyczną drobnoustrojów). Wybór rodzaju podłoża warunkowany jest rodzajem badanego materiału. Zwykle jest to podłoże MacConkeya, Levine'a, EMB lub podłoża SS, Wilsona-Blaira czy HE. Zazwyczaj jednocześnie posiewa się na więcej niż jedno podłoże. Podłoża te zawierają składniki ograniczające wzrost bakterii gram-dodatnich, a te używane do izolacji z próbek kału także, w większym lub mniejszym stopniu, obecne są zawsze Escherichia coli. Wspólną cechą tych podłóż jest też obecność odpowiednich substratów i systemów wskaźnikowych pozwalających w przybli­żeniu odróżnić bezwzględnie patogenne gatunki (Salmonella, Shigella, Yersinia) od rodzajów stanowiących stałą florę jelita ludzkiego (Escherichia, Enterobacter, Kebsiella). Bada się pojedyncze kolonie wyrosłe na tych podłożach. O przynależ­ności do rodziny Enterobacteriaceae świadczy morfologia komórek (duże pałeczki gram-ujemne), fermentacja glukozy i brak oksydazy cytochromowej. Kolonię posiewa się na zestaw podłoży (prób biochemicznych) tak dobranych, by pozwoliły na identyfikację jak największej liczby rodzajów. W wielu laboratoriach jest to często tzw. podstawowy szereg izolacyjny (biochemiczny), w skład którego wchodzą próby: rozkład laktozy w warunkach beztlenowych (laktoza pod parafiną), rozkład mocznika przez ureazę, wytwarzanie indolu (woda peptonowa z tryptofanem) oraz zdolność rozkładu laktozy, glu­kozy i wytwarzania H₂S (podłoże Kliglera). Powtórzenie próby na rozkład laktozy w różnych podłożach pozwala na ocenę rozkładu tego substratu w warunkach różnego dostępu tlenu, a wynika z jej dużego znaczenia diagnostycznego.

Zestaw prób biochemicznych znany jako test IMViC jest rzadko już używany w bakteriologii klinicznej, ale ciągle stosowany w mikrobiologii żywności (żywność jest źródłem większości zakażeń tymi pałeczkami). Jego nazwa to akronim (słowo wytworzone przez skrócenie wyrażenia) wynikający z wchodzących w jego skład prób biochemicznych. Są to: próba na indol, próby wykrywające produkty specyficznych szlaków rozkładu glukozy - MR (próba methyl-red) i VP (próba Yogesa-Proskauera) oraz badanie wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. Test ten dość robrze różnicuje rodzaje pałeczek rozkładających laktozę. Dlatego w tabelach identyfikacyjnych stosuje się różne systemy w celu unaocznienia odsetka szczepów wykazujących próby dodatnie. Zazwyczaj jeden z przedstawionych zestawów prób przynosi informację o przynależności rodzajowej wyizolowanych bakterii. W identyfikacji gatunku pomagają kolejne próby biochemiczne (np. dekarboksylacja aminokwasów, rozkład dulcytolu i wykorzystywanie malonianu lub serologiczne, dobrane zależnie od rodzaju badanego materiału i spodzie­wanych potrzeb diagnostycznych.

Dla usprawnienia diagnostyki opartej na cechach biochemicznych dobrze jest uświadomić sobie wyniki niektórych popularnych, dobrze różnicujących prób:

• zdolność deaminacji fenyloalaniny mają spośród wszystkich pałeczek jelito­wych jedynie bakterie rodzajów grupy Proteus (Proteus spp., Morganella spp., Providencia spp.);

• siarkowodór zawsze wydzielają na odpowiednich podłożach (np. Kliglera) jedynie: Salmonella spp., Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilit, Edwardsiella tarda;

• dodatnia próba VP (rozkład glukozy do acetoiny) to cecha bakterii grupy KES; wykazują ją Klebsiella spp., Enterobacter spp., Hafnia spp., Pantoea spp. i Ser­ratia spp.;

• w temperaturze 36°C ruchliwe będą wszystkie pałeczki jelitowe z wyjątkiem: Shigella spp., Klebsiella spp. i Yersinia spp. Te ostatnie wykażą ruch w temperaturze 22°C.

Do celów epidemiologicznych prowadzi się dochodzenia mające ustalić nie tylko przynależność pałeczek do rodzaju i gatunku, ale także podobieństwo po­szczególnych izolatów. Dokonuje się tego najczęściej przez typowanie bakteriofagowe lub bakteriocynowe. Ostatnio coraz częściej sięga się także po metody biologii molekularnej.

Identyfikacja: do rodzaju możemy zaklasyfikować bakterie na podstawie ich właściwości biochemicznych, do gatunku na podstawie ich właściwości serologicznych. Do identyfikacji stosujemy pożywki wybiórczo-różnicujące (np. Salmonella nie rośnie w obecności soli żółci, które hamują jej wzrost). Krótki szereg biochemiczny (stosowany na zajęciach) to podłoże Kliglera, woda peptonowa z tryptofanem, laktoza, pożywka Christensena na wytwarzanie ureazy. Pożywka Kliglera ma kolor czerwony (jest to słupko-skos)- bakterie fermentujące laktozę np. Serratia fanticola- zmienia barwę pożywki na żółtą; słupek czarny na pożywce Kliglera oznacza obecność siarkowodoru. Na pożywce Christensena jeżeli dojdzie do zmiany barwy z żółtej na różową to oznacza to iż drobnoustrój wytwarza ureazę. E.coli- słupek zażółcony i podniesiony, porozrywany świadczy o obecności gazu. Pożywka Simonsa ma barwę zieloną, źródłem węgla jest tu dla drobnoustrojów cytrynian sodowy. Mikrometody: test API 20E - oznaczane jest tu 20 cech+ 3 cechy (jest to ostateczna identyfikacja), są to mikroprobówki z substratem i wskaźnikiem, wg tabeli sprawdza się kolory, następnie sprawdza się w karcie identyfikacyjnej cyfry (jedna cyfra kodu to 3 oznaczenia/reakcje), 7 cyfrowy kod sprawdza się z w książce oznaczeń Enterobacteriaceae- kod cyfrowy to gatunek , jest tam również komentarz dotyczący jakości identyfikacji, prawdopodobieństwa popełnienie błędu, oraz sugerowany inny drobnoustrój. Polskie wydanie tego testu to test EPL21, enterotest to wydanie czeskie- posiada studzienki, tabele itd. jest o tyle niepraktyczny iż zawiera dużo studzienek i trzeba nim badać kilka szczepów. Ostateczne potwierdzeniem badań nad gatunkiem drobnoustroju jest badanie genetyczne i serologiczne.

Rodzaj Escherichia

Do rodzaju Escherichia należą aktywne biochemicznie pałeczki Gram-ujemne, laktozo-dodatnie, produkujące gaz i indol (z wyjątkiem E. vulneris) dodatnie w teście z czerwienią metylową (MR) i ujemne w teście VP (Yogues-Proskauer); test na wykazanie acetylometylokarbinolu = acetoiny), nie wytwarzające ureazy, H₂S, nie wzrastające na podłożu Simmonsa z cytrynianem oraz wytwarzające dekarboksylazę lizyny i ornityny. Zgodnie z systematyką Bergeya do rodzaju Escherichia należą dwa gatunki: E. coli i E. blattae. Gatunek E. blattae, jak dotąd izolowany był tylko z przewodu pokarmowego karaluchów; bakterie te są indolo-ujemne i nie fermentują laktozy, co je odróżnia od typowych szczepów E. coli. Ostatnio określono nowe gatunki, które należą do tego rodzaju: E. vulneris, E. hermanii, E. fergusonii i E. adecarboxylata. Gatunek E. adecarboxylata (Enteric Group 41) w innych klasyfikacjach zaliczany jest do Enterobacter (Erwinia) agglomerans (wytwarza żółty barwnik). Aktualnie gatunek ten należy do nowego rodzaju Pantoea (P. agglomerans). Nowe gatunki z rodzaju Escherichia są bakteriami oportunistycznymi, wywołującymi zakażenia głównie u pacjentów hospitalizowanych. E. vulneris: szczepy tego gatunku są izolowane z zakażonych ran, głównie z lokalizacją na ramionach i nogach, rzadziej z krwi. Nie produkują indolu z tryptofanu i nie mają aktywności dekarboksylazy ornityny. E. hermanii: szczepy tego gatunku są biochemicznie podobne do E. coli, z wyjątkiem tego, że produkują żółty barwnik. Izolowane są od ludzi z ran, wydzielin układu oddechowego, rzadziej z kału, krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego. E. fergusonii: szczepy dotąd wyosobniono z krwi, moczu i kału; ich znaczenie kliniczne jest przedmiotem badań.

Klasyfikacja i znaczenie kliniczne

Większość gatunków tego rodzaju wchodzi w skład fizjologicznej flory jelit ludzi i zwierząt (E. blattae była izolowana tylko z jelita karaluchów) i jest zawsze izolowana z próbek kału. Z tego powodu pałeczki Escherichia są ważnym wskaźnikiem kałowego zanieczyszczenia wody, artykułów spożywczych oraz leków. Spośród sześciu opisanych dotychczas gatunków tylko Escherichia coli występuje powszechnie i ma istotne znaczenie kliniczne. Inne gatunki tego rodzaju, na przykład: H.hermannii, E. fergusonii czy E. vulneris, są sporadycznie izolowane od ludzi jako patogeny oportunistyczne, szczególnie z zakażeń ran. Większość szczepów Escherichia coli (pałeczka okrężnicy) jest izolowana z kału osób zdrowych. Pałeczki te mogą także, przejściowo, występować na skórze błonach śluzowych. Jednak kolonizująca organizm poza przewodem pokarmowym E. coli, jest oportunistycznym patogenem. Najczęściej jest czynnikiem etiologicznym zakażeń dróg moczowych - zapalenia pęcherza moczowego i ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek. Szczególnie niebezpieczne są tu bogato wyposażone w czynniki chorobotwórczości szczepy uropatogenne UPEC ( uropathogenic E. coli). Pałeczka okrężnicy może wywoływać także zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, zapalenie pęcherzyka żółciowego, zapalenie ucha środkowego i zapalenie płuc. Dlatego może być izolowana z różnych materiałów klinicznych. Wywołanie schorzenia w dużym stopniu zależy od predyspozycji gospodarza, ale także od cech chorobotwórczości szczepu powodującego infekcję. Szczepy uropatogenne wyposażone są w czynniki chorobotwórczości sprzyjające adhezji bakterii do powierzchni nabłonków (fimbrie P, ahezyny fimbrialne Dr oraz otoczkowe Afa I i Afa III) i niszczeniu tkanek powiązanemu z niekorzystnym pobu­dzeniem układu immunologicznego (rozpuszczająca krwinki i inne komórki cytolizyna Hh' A). Szczepy wywołujące zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków zazwyczaj mają otoczki (antygen K1) zbudowane z polimeru kwasu sjalowego.W obrębie gatunku E. coli spotykane są szczególne, patogenne odmiany serologiczne - serotypy. Ich wydzielenie było możliwe dzięki temu, iż większość szczepów tego gatunku jest urzęsiona, wiele ma też mikrootoczki. Różnorodność odmian antygenu somatycznego O (171 odmian), antygenu rzęskowego H (55 odmian) i otoczkowego K (80 odmian) pozwala na serologiczny podział, stanowiący wewnątrzgatunkową kla­syfikację Eschrichia coli dzielącą gatunek na ponad 160 serotypów (typy serologiczne = serowary). Wzór antygenowy serotypu wskazuje na odmiany antygenów obecnych w jego komórkach. Pozwala to odróżnić i zidentyfikować serotypy, które są bezwzględ­nie chorobotwórcze dla ludzi (serologiczna identyfikacja E. coli). Serotypy patogenne podzielono na pięć wirotypów w zależności od patogenezy wywoływanych przez nie biegunek. Mają one różne cechy i są wyposażone w od­mienne czynniki chorobotwórczości. Patogenne pałeczki okrężnicy pozyskały nowe informacje genetyczne dzięki horyzontalnemu przenoszeniu genów:

• Enterotoksynogenne, enterotoksyczne Escherichia coli (ETEC) wywołują tzw. biegunki podróż­nych oraz biegunki u dzieci, tzw. cholerę dzieci. Posiadają toksyny LT-termo labilne, ST- termo stabilne wywołujące biegunki.

• Enteroinwazyjne Escherichia coli (EIEC) są czynnikiem etiologicznym biegu­nek czerwonkopodobnych. Penetrują one nabłonek jelitowy.

• Enteropatogenne Escherichia coli (EPEC) - wywołują śluzowe biegunki niemowląt, przekazują one toksyny do komórki przez kanały- III typ sekrecji.

• Enterokrwotoczne (ang. enterohemorrhagic-enterohemolityczne) Escherichia coli (EHEC) - stają czynnik etiologiczny krwotocznego zapalenia jelita grubego oraz występującego jako następstwo, szczególnie u dzieci, zespołu mocznicowo-hemolitycznego i zakrzepicy małopłytkowej. Pochodzące od bydła, produkują verotoksynę- Shiga podobną (dostała się ona do komórek bakterii poprzez transfer horyzontalny od innego drobnoustroju poprzez bakteriofagi)- powodują zespół hemolityczno-mocznicowy (wzrost poziomu mocznika w organizmie).

• Enteroadherentne (EAEC) lub enteroagregatywne Escherichia coli (EAggEC) wywołują przede wszystkim chroniczne biegunki u dzieci, ale i przewlekłe wodne biegunki dorosłych występujące w krajach słabo rozwiniętych.

Morfologia, izolacja i cechy identyfikacyjne

Bakterie rodzaju Eschericha są krótkimi prostymi pałeczkami. E. coli ma rzęski peritrychalnie otaczające komórkę, ale rusza się dość ospale. Wiele szczepów wy­warza cienkie mikrootoczki, które mogą mieć znaczenie nie tylko dla serologicznej klasyfikacji wewnątrzgatunkowej, ale i chorobotwórczości. Najważniejsze cechy biochemiczne E. coli to zdolność fermentowania laktozy i rozkładania tryptofanu do indolu. Ta pierwsza cecha pozwala różnicować ten, gatunek już na pierwszym etapie badania po zastosowaniu stałych podłóż diagnostycznych lub diagnostyczno-wybiórczych zawierających w swym składzie laktozę, na przykład MacConkeya. Silniej wybiórcze podłoża, stosowane w badaniu jak na przykład podłoże SS, zawierają dodatkowo barwniki anilinowe lub sole kwasów żółciowych czy tiosiarczan sodu, które hamują wzrost E. coli ułatwiając znalezienie w materiałach innych, laktozoujemnych pałeczek jelitowych. Cechą charakterystyczną Escherichia coli jest też dodatnia próba MR, a ujemna , dobrzeje różnicująca od również laktozo dodatnich Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae. W materiałach klinicznych można spotkać także tak zwane niereaktywne szczepy coli, których identyfikacja ze względu na słabą aktywność metaboliczną, w tym to brak zdolności rozkładu laktozy, jest bardzo trudna. Mogą to być serotypy patogenne - enteroinwazyjne EIEC. Szczepy takie przypominają, choć tylko pod względem biochemicznym, blisko genetycznie spokrewniony rodzaj Shigella. Róż­nicowanie biochemiczne może dać pewne wskazówki, jednak decydujące są metody serologiczne. Dostępne są zestawy surowic lub opłaszczonych przeciw­ciałami lateksów pozwalających na oznaczenie serotypów najczęściej występujących na terenie kraju. Opracowywane są także metody molekularne - na przykład metodą z zastosowaniem RT-PCR poszukuje się odpowiednich, charak­terystycznych dla poszczególnych serotypów sekwencji, które będzie można wykorzys­tać w tych oznaczeniach.

Escherichia coli

Bakterie z gatunku E. coli (pałeczka okrężnicy) występują stale w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. Pełnią rolę symbiontów, uczestniczą w rozkładzie pokarmu i syntezie witamin z grupy B, K i C. Mogą kolonizować skórę i błony śluzowe jamy ustnej, układu oddechowego, pochwy i cewki moczowej. Występują też w glebie i w wodzie. Należą do bakterii najczęściej izolowanych z materiałów chorobowych w laboratoriach mikrobiologicznych. Gatunek E. coli dzieli się na serotypy na podstawie zróżnicowanej budowy antygenów somatycznych O (LPS), rzęskowych H (białko-flagelina) i polisacharydowych antygenów otoczkowych K. Wyróżnia się 171 antygenów O, około 80 antygenów K i ponad 50 antygenów H. Serotypy określa się wzorami, jak np. E. coli 0: 18 ac Kl: H7 lub E. coli 0: 111: H₂ (nie ma w szczepie antygenu K). Do charakterystyki antygenowej serotypów E. coli mogą być włączone antygeny fimbriowe (lub pilinowe) oznaczone jako F. Na podstawie występowania zróżnicowanych antygenowo białek — pilin wyodrębniono ponad 20 typów serologicznych (F1, F2 itd). Niektóre z fimbrii są przedmiotem szczególnego zainteresowania, zwłaszcza w ostatnich latach, ze względu na ich znaczenie w patogenezie chorób wywoływanych przez E. coli; należą do grupy ważnych wyznacz­ników chorobotwórczości, zwłaszcza w mechanizmie inwazji. Oprócz tego, szczepy z gatunku E. coli można grupować pod względem ich wrażliwości na swoiste bakteriofagi (typowanie fagowe) lub kolicyny (typowanie kolicynowe: zestaw Abbotta, Shannona, inne) oraz na antybiotyki (wzory oporności), a także ostatnio pod względem profilu (wzorów) białek błony zewnętrznej (OMP). Przydatne jest typowanie fagowe, zwłaszcza szczepów zawierających antygen K1. Mimo tak zróżnicowanej budowy antygenowej E. coli, od lat zwraca się uwagę na ograniczoną liczbę serotypów lub klonów komórek w szczepach E. coli, które są specyficzne dla określonej lokalizacji zakażenia lub zespołu chorobowego wywoływanego przez te bakterie. Dla przykładu zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków wywoływane jest głównie przez serotypy zawierające antygen otoczkowy K1, których liczba jest ograniczona. Zakażenia układu moczowego oraz z inną lokalizacją pozajelito­wą wywoływane są zazwyczaj przez szczepy hemolityczne, produkujące typ MR fimbrii (p. niżej).

Chorobotwórczość: pałeczki E. coli mogą być charakteryzowane poprzez ich wyznacz­niki chorobotwórczości, do których należą adhezyny (fimbrie) - czynniki inwazyjności i toksyny odpowiedzialne bezpośrednio za toksyczność i/lub inwazyjność. Fimbrie: wyróżnia się fimbrie typu MS (mannose-sensitive = wrażliwe na mannozę) i typu MR (mannose resistant = oporne na mannozę), co oznacza, że zdolność do bezpośredniej aglutynacji krwinek czerwonych przez kontakt z fimbriami będzie hamo­wana (MS) lub nie (MR) po dodaniu D-mannozy (test hemaglutynacji czynnej). Produkcja fimbrii może być kontrolowana przez grupę genów zlokalizowanych w chro­mosomie lub plazmidach. Szczepy E. coli mające fimbrie typu MS są zaliczane do grupy antygenowej F1; wykazują one duże zróżnicowanie i występują powszechnie. Typem l fimbrii są nazywane również fimbrie wiążące mannozę, które są kodowane przez grupę genów firm zawartych w czynniku F'. Duże zróżnicowanie może być związane m.in. z mutacją genu strukturalnego piliny —firmA. Nie wszystkie komórki stanowiące populację szczepu są ufimbriowane; częstość ufimbriowanych do nieufimbriowanych komórek wynosi 1: 1000 na generację. Może występować heterogenna populacja uwarunkowana mechanizmami genetycznymi, która nie jest zależna od wpływów środowiska oraz populacja homogenna zależna od środowiska. Przykładem zależności od środowiska jest produkcja adhezyny K99 przez E. coli, której ekspresja jest regulowana przez warunki środowiskowe, takie jak temperatura. Szczepy E. coli zawierające znane antygeny zjadliwości K88 i K99 należą odpowiednio do typów serologicznych F4 i F5 antygenów fimbriowych. Ekspresja tych antygenów fimbriowych (adhezyn) uwarunkowana jest genami zawartymi w plazmidach. Szczepy E. coli izolowane od ludzi, dla których dotąd oznaczano obecność antygenów CF1 (CFA I) i CF2 (CFA II), zaliczane są do grup serologicznych F2 i F3. Znane były dotąd jako czynniki kolonizacyjne typu fimbrialnego. U niektórych szczepów E. coli wykazano obecność różnych typów antygenowych fimbrii. Szczepy, które mają ekspresję S pili często są odpowiedzialne za meningitis u noworod­ków. Wykazano, że jedna S adhezyna była kodowana przez grupę sfa genów zlokalizowa­ną w chromosomie. Szczepy E. coli, izolowane z przypadków ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek u dzieci, często mają P pili, których ekspresja również może być uwarunkowana genami wykazywanymi w chromosomie. Badania nad regulacją ekspresji fimbrii typu P umożliwiły określenie organizacji genu grupy Pap i wskazanie ekspresji białek indywidualnych . Grupa genów pap (pyelonephritis associated pili = pile skojarzone z odmiedniczkowym zapaleniem nerek) odpowiedzialna jest za ekspresję jednego typu pili P (serotyp F13), które są zdolne do wiązania się z gal α (l 4) gal wchodzącym w skład receptorów obecnych na komórkach nabłonka układu moczowego. Do regulacji i biogenezy włączonych jest 11 genów, z których gen Pap A dokonuje ekspresji podjednostki głównej strukturalnej piliny Pap A, nazywanej piliną główną (większą lub dużą). Produkt genu pap H jest podjednostką piliny mniejszej (terminator) zakotwiczającej i modulującej długość. Gen pap C koduje produkcje białka pap C, które tworzy kanały w błonie zewnętrznej, przez które struktura fimbrii jest zlokalizowana na powierzchni. Białko Pap D występuje w periplazmie, zapobiega przed degradacją podjednostek piliny i prawdopodobnie działa jako białko transportowe (transporter) dla podjednostek piliny do centrum polimeryzacji w błonie zewnętrznej. Białko Pap J jest konieczne do integralnej struktury i może wpływać na właściwość powierzchni pili. Geny pap EFG kodują piliny mniejsze. Białka Pap F i Pap G uczestniczą w specyficznym wiązaniu do digalaktozydu z Pap G; białko to jest właściwą adhezyną. Te trzy białka są zlokalizowane przy koniuszku struktury fimbrii. Rola białka Pap E polega na umocowaniu białek Pap E i Pap G do fimbrii. Ostatnie badania wskazały, że białko Pap K jest również częścią struktury fimbrii. Geny pap I - pap B stanowią region międzycistronowy dla inicjacji transkrypcji i ekspresji białek Pap I i Pap B, które pełnią funkcje regulacyjne. Zbadano homologię pap I - pap B w innych systemach genowych znanych plazmidów lub szczepów kodujących adhezynę -pilus. Dwa klony wiążące digalaktozyd, należące do serotypu F 7₂ i F 11, zawierają geny, które były w wysokim stopniu homologiczne z pap I i pap B (hybrydyzacja). Determinanta Prs, która była również klonowana ze szczepu J 96, była homologiczna. Fragment DNA, uzyskany z determinanty z pili S wiążących kwas sialowy (sialic-acid binding pili) na pANN 801-4, również wykazywał homologię. Typ l A pili i K 99 nie wykazują homologii DNA do regionu regulacyjnego genu pap. Analiza chromosomalnego J 96 wykazała obecność 3 kopii pap regionu kontrolującego; ten fragment był ostatnio sklonowany. Typ l C pili sklonowany z determinanty szczepu uropatogennego AD 110 jest homologiczny z grupą genu S pili na poziomie DNA. Grupa genu K 99 ma dwa geny regulatorowe (fan A i fan B) zlokalizowane w genowej podjednostce piliny. Białko Pap B było wykazane w determinancie pili S sklonowanej z uropatogennego szczepu E. coli. Białka typu Pap B są szeroko rozprzestrzenione wśród ufimbriowanych patogennych szczepów. Za hemaglutynację krwinek ludzkich w obecności α-metyl-D-mannozy (MRHA) odpowie­dzialny jest dystalny gen - pap G w systemie pap. Efekt, zależny od temperatury wytwarzania fimbrii, jest mediowany przez pap I - pap B region. Te geny regulujące odpowiadają na sygnały środowiska, produkty tych genów nie są wyrażone w temperaturze 30°C. Transkrypcja genu strukturalnego dla Pap pili jest regulowana w odpowiedzi na temperaturę środowiska. Transkrypcja genu pap B (1300 nukleotydów długości mRNA) jest zależna od cAMP i jego białkowego receptora. Operony u E. coli, które są zdolne do kontroli przez CRR (lub CAP) regulator, w połączeniu z sygnałem cAMP należą do ogólnego regulonu cAMP - CRP, włączającego dwuskładnikowe systemy sygnalne transdukcji przezbłonowej, które występują w licznych komórkach priokariotycznych. Fimbrie P lub Pap pili, które warunkują wiązanie do α-D-Galp-(l-4)-(3-D-Galp obecnego w glikolipidach błon komórkowych, oporne na mannozę (typ MR) są determinantą zjadliwości, która była izolowana i scharakteryzowana dla fragmentu DNA - 11 kbp niesionego przez plazmid pRH 4845, który wykazywał właściwości wiązania i produkcji pili u E. coli K 12 laboratoryjnego szczepu HB 101. Jakkolwiek synteza swoistych adhezyn (fimbrie, pili) może zależeć od informacji zawartej w DNA plazmidów, bez udziału antygenów O i K, to pewne typy adhezyn skojarzone są z określoną grupą O serologiczną E. coli. Dla przykładu - adhezyna K 88 występuje głównie u E. coli z grupami 0:8,45,138,141,147,149,157, K 99 skojarzona jest z grupami 0: 8, 9, 20, 64 i 101, a CFAI (F2) z 0: 15, 25, 63, 78 i CFAII (F3) z 0: 6 i 0: 8. Typy fimbrii u E. coli można oceniać w testach hemaglutynacji czynnej (MRHA = mannose-resistant hemaglutination) z użyciem krwinek czerwonych ludz­kich, w odczynach aglutynacji i aglutynacji lateksowej, precypitacji w żelu agarowym, immunoelektroforezy, w technikach immunofluorescencyjnych (te do ilościowego chara­kteryzowania antygenów bezpośrednio na komórkach) i immunoenzymatycznych. Dostępne są handlowe zestawy oparte na teście aglutynacji lateksowej do wykazywania fimbrii typu P u E. coli. Zdolność do adhezji do receptorów zawartych w glikolipidach błon komórkowych wykazano również u bakterii Gram-ujemnych, takich jak Salmonella spp., Shigella spp., P. mirabilis, Klebsiella spp., Yersinia spp., V. cholerae, B. pertussis, N. gonorrhoeae, N. meningitis, Mycoplasmapneumoniae oraz ziarniaków Gram-dodatnich (Streptococcus, Staphylococcus). Glikolipidy receptorowe są równocześnie antygenami układu grupowego krwi P i są obecne w błonie krwinek czerwonych człowieka. Wyróżnia się trzy antygeny tej grupy, tj. P1, P2 i pk, z których P l dotyczy ³/₄ ludzi, P2 zaś tyko ¹/₄. W obu grupach występuje antygen pk, w mniejszej ilości u ludzi z grupą P2. Wykazano, że u ludzi z grupą Pl na komórkach błony śluzowej dróg moczowych znajduje się większa ilość receptorów wiążących się z bakteriami. Antygeny (receptory komórkowe) i adhezyny komórek bakteryjnych, jak te w przypadku Pap pili (fimbrie P) (adhezyna Pap G), należą do tej samej grupy antygenów. Swoiste rozpoznawanie, łączenie się, a także przez błonowe i wewnątrzkomórkowe mechanizmy tych procesów warunkują inwazyjność i/lub toksycz­ność bakterii (p. także Toksyny, s). Udział tu mają z pewnością również antygeny K E. coli, głównie serotypów K1, K5, K12 i K13, które częściej nizinne są przyczyną zakażeń układu moczowego, a szczepy E. coli K l również i zakażeń pozajelitowych. Toksyny: Oprócz działania toksycznego, spowodowanego toksyną polisacharydową (LPS), pałeczki E. coli mogą mieć dodatkowe ważne wyznaczniki chorobotwórczości, do których należą toksyny białkowe. Do tej grupy toksyn należą następujące typy:

1. Enterotoksyny ciepłochwiejne (LT = heat-labile): wiążą się do nabłonka jelita za pomocą receptorów i efekt działania odbywa się poprzez aktywację cyklazy adenylowej, która katalizuje wzrost cyklicznego adenozyno-3,5-monofosforanu (cAMP). To powo­duje przejście do światła jelita dużej ilości płynu i wystąpienie biegunki. Objawy biegunki występują po 10—18 h od podania enterotoksyny LT. Aktualnie wyróżnia się odmiany: LT I, LTh-I, LTp-I oraz LT II, LT Ila i LT Ilb, które są zróżnicowane pod względem immunologicznym. Klasyczna LT toksyna E. coli jest podobna do enterotoksyny u V. cholerae.

2. Enterotoksyny ciepłostałe (ST = heat-stabile): efekt działania odbywa się poprzez aktywację cyklazy guanylowej obecnej w komórkach nabłonka jelitowego, co powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego cyklicznego guanozyno-3,5-monofośforanu (cGMP), wzrost sekrecji płynu do światła jelita i w konsekwencji biegunkę. Efekt biologiczny toksyny ST jest większy i w krótszym czasie (do 6 h) niż LT. Wyróżnia się kilka typów enterotoksyny ST: ST I, ST la, ST Ib, ST Ic i ST II. Produkcja enterotoksyn mediowana jest obecnością genów zawartych w plazmidach i/lub w transpozonach E. coli.

3. Toksyny podobne do toksyny Shiga (Shiga-like = SLT), które uczestniczą w hamo­waniu syntezy białek. Wyróżnia się: SLT-I i SLT-II toksyny.

4. Verotoksyny (VT): VT I i VT II, podobne do SLT I i SLT II. Te toksyny są produkowane przez szczepy E. coli, które są komórkami lizogennymi; uczestniczą tu bakteriofagi określone jako VTS/VT l i VT 2. Wykryto swoisty receptor Gb 3 (glikolipid globotriosylowy) dla VT. Verotoksyny powodują cytopatyczny efekt komórek Vero (nerka afrykańskiej małpy zielonej), odmienny niż po działaniu enterotoksyny LT, który jest tylko efektem cytotonicznym.

5. Inne nowe toksyny białkowe. Do wykazania produkcji toksyn przez szczepy E. coli wykorzystywane są metody biologiczne przy użyciu zwierząt laboratoryjnych (głównie: króliki, prosięta i oseski mysie), hodowle tkankowe komórek Vero, Hep-2, Hela, CHO, Y l lub inne oraz metody serologiczne (RIA, ELISA, odczyn neutralizacji toksyn, odczyn hemolityczny, odczyny immunodyfuzyjne). Próby biologiczne, takie jak test na oseskach mysich i test w pod­wiązanej pętli jelita królika (rzadziej prosięcia) wykorzystywane są, głównie do róż­nicowania enterotoksyn ST, zaś hodowle tkankowe komórek różnych linii - enterotok­syn LT. Dostępne są handlowe zestawy do wykrywania obecności verotoksyn bezpośred­nio w próbkach kału oraz zestawy do szybkiej identyfikacji szczepów, wytwarzających te toksyny.

Szczepy E. coli dzielone są na trzy grupy, takie jak:

- szczepy nefropatogenne - określone serotypy uczestniczące w odmiedniczkowym zapaleniu nerek (m.in. E. coli 02, 04, 06 itd.),

- szczepy enteropatogenne - określone serotypy wywołujące głównie biegunki letnie u niemowląt (m.in. 026, 055, 0111),

- szczepy odpowiedzialne za kolibakteriozy cieląt i prosiąt (m.in. 08, 09, 020) lub wywołujące enterotoksemie (0138, 0139 i 0141).

Inny podział uwzględnia określone wyznaczniki chorobotwórczości tych bakterii. Wyróżnia się następujące podstawowe grupy szczepów E. coli: ETEC (enterotoxige- nic), EPEC (enteropathogenic), EIEC (enteroinvasive), EHEC (enterohemorrhagic) i EAEC (enteroadherent). Szczepy z grupy EHEC opisywane były pierwotnie jako VTEC (szczepy E. coli produkujące verotoksyny VT).

Chorobotwórczość dla ludzi: większość szczepów E. coli może wywoływać enteritis lub gastroenterocolitis przez działanie czterech różnych mechanizmów, w wyniku których mogą być obserwowane różne zespoły kliniczne:

1. Enterotoksygenne (ETEC) szczepy wytwarzające enterotoksyny LT i/lub ST odpowiedzialne są głównie za biegunkę sekrecyjną, która jest podobna do wywoływanej przez Vibrio cholerae. Choroba występuje u ludzi w każdym wieku, szczególnie często dotyczy niemowląt i dzieci oraz osób podróżujących (biegunka podróżnych). Opisano epidemie pokarmowe wywołane przez szczepy ETEC, epidemie szpitalne u dorosłych pacjentów oraz na oddziałach intensywnej terapii u noworodków. Epidemie szpitalne nie były związane z kolonizacją tych szczepów wśród personelu szpitalnego. Objawy chorobowe występują po 16-72 h okresie inkubacji. Produkcja toksyn warunkowana jest obecnością w tych komórkach plazmidu (LT) lub transpozonu (ST). Większość szczepów należy do serotypów E. coli, takich jak: 06, 015, 078, 0124, 0136, 0143, 0145, 0147, 0159. Szczepy serotypów 078: K 80: H12 i 0:159 produkujące enterotoksyny ST odpowiedzialne były za epidemie szpitalne.

2. Enteropatogenne (EPEC) szczepy wywołujące sporadyczne i epidemiczne zespoły biegunkowe u dzieci, głównie u niemowląt. Obserwowane reakcje i zmiany degeneracyjne w tkankach są wynikiem właściwości adhezyjnych szczepów E. coli. Te właściwości adhezji warunkowane są obecnością plazmidu, jednak swoisty mechanizm nie został dotąd poznany. Patogenność tych szczepów została potwierdzona na ochotnikach. Najczęściej dotyczy to serotypów: 06,08,025,026,055,086,0111,0119,0125,0126,0127, 0128, 0142. Rzadziej — serotypów: 018, 044, 0112 i 0114. Opisane większe epidemie szpitalne wśród niemowląt wywołane były przez E. coli 0114 i E. coli 0142.

3. Enteroinwazyjne (EIEC) szczepy, które są zdolne do penetracji komórek nabłonka jelitowego i wywoływania biegunki zapalnej, podobnej do tej, która jest charakterystycz­na dla zakażeń pałeczkami z rodzaju Shigella. Podejrzenie obecności takich szczepów może zachodzić, gdy w wymazach z próbek kału stwierdza się obecność neutrofilów, a także śluzu i krwi. Objawy chorobowe występują po 16-36 h okresie inkubacji. Inwazyjność szczepów E. coli również uwarunkowana jest obecnością plazmidowych czynników wirulencji. W komórkach znajduje się plazmid duży (140 Megadaltonów), który koduje inwazyjność, podobny do wykazanego u Shigella i innych bakterii. Zakażenia zazwyczaj dotyczą dorosłych ludzi (epidemie pokarmowe). Nie były dotąd opisane jako uczestniczące w epidemiach szpitalnych. Szczepy inwazyjne należą najczęś­ciej do serotypów: 028, 0112, 0115, 0124, 0136, 0143, 0145 i 0147

4. Enterokrwotoczne (EHEC) szczepy produkujące verotoksyny wywołują dwa zespoły chorobowe, tj. krwotoczne zapalenie jelita grubego (colitis haemorrhagica) oraz zespół opisany pod nazwą HUS (hemolytic uremic syndrome = zespół hemolityczno-mocznicowy). Rozpoznawane zespoły są wtórne do działania toksyn na komórki śródbłonka naczyń. Krwawa biegunka u ludzi (bez gorączki) podobna jest do wy­stępującej przy działaniu toksyny Shigella dysenteriae. Śmiertelność jest wysoka i wynosi ponad 30% dla zespołu biegunkowego oraz ponad 70% w przypadku zespołu HUS. Szczepy E. coli, izolowane od ludzi, zdolne do produkcji verotoksyn, należały, jak dotąd, do następujących serotypów: 01, 02, 04, 05, 06, 018, 025, 026, 038, 039, 045, 050, 055, 082, 084, 091, 0103, 0111, 0113, 0114, 0115, 0117, 0118, 0121, 0125, 0126, 0128, 0145, 0146, 0153, 0157, 0163 i 0165. Dominującym serotypem odpowiedzialnym za wywołanie większości przypadków wymienionych zespołów, często występujących w formie epide­mii, jest E. coli 0: 157:H7. Objawy chorobowe występują po 72-102 h okresie inkubacji (dla E. coli 0: 157:H7). Szczepy E. coli kwalifikowane do grupy EHEC fermentują sorbitol; są selektywne podłoża handlowe.

Grupa szczepów enteroadherentnych (EAEC) nie ma dotąd określonej ściśle chorobo­twórczości; szczepy te są przedmiotem badań. Szczepy E. coli, obok innych pałeczek Gram-ujemnych (m.in. Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas spp.) oraz laseczek beztlenowych przetrwalnikujących (C. butyricum, C. perfringens, C. difficile) oraz rotawirusów są uwzględniane w patogenezie zespołu NEC (necrotizing enterocolitis = martwicze zapalenie jelita). Szczepy E. coli, uczestniczące w tym zespole, nie były dotąd bliżej scharakteryzowane. Do poważnych zespołów chorobowych pozajelitowych u ludzi należą bakteriemie, posocznice i indukcja wstrząsu endotoksycznego, w których to pałeczki z gatunku E. coli należą do jednych z częstszych czynników spośród Gram-ujemnych bakterii. Omawiane wcześniej zakażenia układu moczowego, meningitis u noworodków, a także zakażenia ran i zapalenia płuc u pacjentów szpitalnych są innymi, powszechnie występującymi zakażeniami wywołanymi przez E. coli.

Rodzaj Shigella

Do tego rodzaju zaliczane są pałeczki Gram-ujemne, bezrzęse, mało aktywne biochemicznie (laktoza, H₂S, MR, VP, Simmons, lizyna ujemne), nie produkujące gazu z fermentacji węglowodanów oraz produkujące indol zmiennie (50% grup A, B, C). Należą tu cztery gatunki, stanowiące jednocześnie podgrupy serologiczne: S. dysenteriae (A), S. flexneri (B), S. boydii (C) i S. sonnei (D), które mają dalsze podziały na serotypy (A - 10, B - 8 i C - 15) oraz podserotypy (tylko podgrupa B). Podgrupy serologiczne A, B i C są podobne pod względem właściwości biochemicznych. Szczepy z gatunku S. dysenteriae fermentują mannitol. Większość szczepów z gatunku S. sonnei wykazuje aktywność β-galaktozydazy (ONPG) i dekarboksylazy ornityny, co je odróżnia od innych gatunków tego rodzaju. Niektóre szczepy S. sonnei mogą fermentować z opóźnieniem laktozę (2%) i sacharozę (1%). Gatunki tego rodzaju są klasyfikowane identycznie wg Bergeya, Ewinga lub Brenera. Nowe gatunki tego rodzaju nie zostały dotąd opisane. Szczepy wyosobnione z próbek kału od pacjentów, które są scharakteryzowane według właściwości biochemicznych do rodzaju Shigella, powinny być potwierdzone w testach serologicznych (test aglutyncji szkiełkowej, test aglutynacji lateksowej) z użyciem odpornościowych surowic zawierających przeciwciała dla antygenów grupo­wych A, B, C i D oraz swoistych dla serotypów. Surowice są dostępne w handlu. W niedługiej przyszłości będzie możliwe wykazanie Shigella spp. i enteroinwazyjnych szczepów E. coli przy użyciu sondy DNA plazmidów wirulencji, których geny kodują produkty komórkowe inicjujące adhezję, wewnątrzkomórkową penetrację i inwazję błony śluzowej jelita.

Klasyfikacja i znaczenie kliniczne

Rodzaj Shigella obejmuje cztery gatunki: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii i S. sonnei określane też czasem jako podgrupy serologiczne A, B, C i D. Wszystkie gatunki są bezwzględnie patogenne i powodują czerwonkę bakteryjną (łac. dysenteria bacterialis). Chorobotwórczość pałeczek Shigella związana jest z ich zdolnością penetrowania i atakowania komórek warstwy nabłonka jelita, do których przedostają się za po­średnictwem makrofagów umiejscowionych w kępkach Peyera. W cytoplazmie ko­mórek bakterie te namnażają się i niszczą je powodując w ten sposób krwawiące owrzodzenia. Zakażenie jest ograniczone do komórek błony śluzowej i tkanek okrężnicy. Silna toksyna, nazwana toksyną Shiga, jest wytwarzana z dużą aktywnością przez szczepy S. dysenteriae typu 1. Jej aktywność jest przyczyną postępujących uszkodzeń nabłonka. Może też prowadzić do powstawania zespołu mocznicowo-hemolitycznego. Istnieje podobieństwo działania tej toksyny z toksyną Escherichia coli EHEC i toksyna Vibrio cholerae. Jest to ponadto, podobnie jak tamte, toksyna dwuskładnikowa AB połączona w specyficznych proporcjach: A-5B.

Różnicowanie

Pałeczki Shigella są nieurzęsione. Cechą charakterystyczną rodzaju jest bardzo słaba aktywność biochemiczna, w tym brak zdolności rozkładu laktozy. Różnicowanie biochemiczne gatunków w obrębie rodzaju Shigella jest trudne lub niemożliwe. Szcze­py należące do podgrup A, B i C są bardzo do siebie podobne. Można je zróżnicować jedynie względem S. sonnei (podgrupa D). Często bowiem wytwarzają indol, co nie jest spotykane wśród S. sonnei. Z kolei tylko S. sonnei spośród Shigella powoduje dekarboksylację ornityny. Identyfikacji gatunków dokonuje się przede wszystkim metodami serologicznymi wykorzystującymi różnice w budowie antygenu somatycznego O. Trudność sprawia różnicowanie pałeczek z rodzaju Shigella z nie fermentującymi laktozy szczepami Escherichia coli. Różnicowanie pałeczek Shigella względem rodzaju Salmonella jest łatwe, gdyż pałeczki czerwonki nie mając rzęsek nie mogą reagować z surowicami zawierającymi przeciwciała przeciw antygenowi H. Ponadto Shigella nie wytwarza H₂S ani nie wykorzystuje cytrynianu jako jedynego źródła węgla.

Chorobotwórczość dla ludzi: pałeczki z rodzaju Shigella wywołują swoiste zakażenie jelit, które określane jest jako czerwonka bakteryjna. Do wczesnych objawów choroby (krótki okres inkubacji) należą: gorączka, biegunka sekrecyjna z bolesnością i ogólnym osłabieniem. Utrata płynów i elektrolitów może być wczesnym objawem następstwa działania toksyn na komórki nabłonka jelitowego. Po 2 - 3 dniach liczba oddawanych stolców zmniejsza się, ale występują objawy zakażenia jelita (śluz i krew w kale, w preparatach neutrofile). Za chorobę biegunkową odpowiedzialne są najczęściej szczepy należące do gatunku S. sonnei; dotyczy to USA, wielu krajów Europy i Polski. Choroba określana jest jako średniociężka. Może występować bezobjawowe zakażenie (kolonizacja, nosicielstwo, komensalizm). Szczepy z gatunku S. dysenteriae są ostatnio najrzadziej izolowane z przypadków czerwonki, ale są najbardziej zjadliwymi serotypami. Ten gatunek historycznie jest znany jako produkujący klasyczną egzotoksynę białkową, której nazwa pozostała do dziś obowiązująca jako toksyna Shiga (od dawnej nazwy gatunkowej S. shigae). U szczepów z rodzaju Shigella odkryto ostatnio nowe toksyny oraz określono na szczeblu molekularnym ekspresję zależną od temperatury genów wirulencji, zlokalizowa­nych w plazmidzie dużym 120-140 Md, podobnie jak to opisano szerzej dla E. coli. Zjadliwe szczepy z rodzaju Shigella charakteryzują się zdolnością do kolonizacji nabłonka jelitowego i rozprzestrzeniania się do komórek przyległych. Bakterie wzrastające w temperaturze 30°C nie są inwazyjne. Ostatnio opisano aktywator genów wirulencji S. flexneri, którym jest białko Vir F, kodowane przez plazmid duży (30 KD). Wykazano, że trzy geny vir F kodowane w plazmidzie są odpowiedzialne za zdolność do inwazji, które oznaczono jako ipa BCD; transkrypcja oraz produkty tych genów nie występują w temperaturze 30°C. Szczepy z rodzaju Shigella wykazują tropizm tylko do jelit i nigdy nie wnikają do układu limfatycznego oraz nie rozprzestrzeniają się do innych narządów lub do krwi. Do niezwykle rzadkich należy pozajelitowa lokalizacja zakażenia, np. S. flexneri izolowana z ropnia śledziony od pacjenta z cukrzycą. Do sporadycznych też należy izolowanie tych szczepów z innych materiałów niż próbki kału lub wymazy z odbytu, popłuczyny jelitowe czy bioptaty jelit. Pojedyncze tylko szczepy w różnych laboratoriach mikrobiologicz­nych w niektórych krajach pochodzą z próbek krwi (bakteriemie u pacjentów z choroba­mi zagrażającymi życiu, wyniszczonych, wcześniaków). Czerwonka bakteryjna może dotyczyć ludzi w każdym wieku. Najwięcej zachorowań, często o sezonowym charakterze (czerwiec-lipiec) w postaci epidemii dotyczy populacji dziecięcej, z najmłodszej grupy wiekowej 0-4 lat. W niektórych krajach sytuacja epidemiologiczna czerwonki bakteryjnej ulega pewnym wahaniom sezonowym, jak i pod względem grup wiekowych, co wiąże się bezpośrednio z występowaniem lub nie większych ognisk epidemii pokarmowych. Ogniska takie często dotyczą oddziałów dziecięcych w szpitalach, sanatoriach, żłobkach czy przedszkolach. Zakażenie może przenosić się z osobnika na osobnika drogą bezpośrednią (ręce) lub pośrednią poprzez zanieczyszczone odchodami przedmioty, żywność itd. Opisano epidemie wodne oraz epidemie biegunek podróżnych, za objawy których odpowiedzialne były pałeczki z rodzaju Shigella. W niektórych krajach bakterie te są na drugim lub trzecim miejscu wśród wszystkich bakteryjnych czynników etiologicznych biegunek u ludzi.

Rodzaj Salmonella (informacje ogólne):

Do rodzaju Salmonella należy jeden gatunek S. enterica z podgatunkami:

1. Salmonella enterica subsp. enterica.

2. Salmonella enterica subsp. salamae.

3a. Salmonella enterica subsp. arizonae.

3b. Salmonella enterica subsp. diarizonae.

4. Salmonella enterica subsp. houtenae.

5. Salmonella enterica subsp. bongori.

Przyjęty schemat budowy antygenowej wg Kauffmana-Whitea uwzględnia grupy serologiczne wydzielone na podstawie antygenów somatycznych O, oznaczone dużymi literami alfabetu od A do Z (łącznie 50) i dalsze oznaczone cyframi od 051 do 067. W obrębie grup antygenów O jest dalszy podział tych szczepów na podstawie cząstkowych antygenów O i zróżnicowanej fazowo budowy antygenów rzęskowych H. Struktura antygenu O i rzęskowego H określa serotypy, z których dotąd opisano wg tego schematu ponad 2200. Nadane nazwy używane powszechnie dotyczą zatem serotypów, a nie nazw jednostek taksonomicznych określających gatunki. Serotypy Salmonella paratyphi B i 5. paratyphi C znane są także pod nazwami S. schottmuelleri (B) i 5. hirszfeldii (C). W codziennej praktyce laboratoryjnej nieznane szczepy izolowane z próbek materia­łów klinicznych (krew, mocz, kał, inne), identyfikowane są wstępnie do rodzaju Salmonella na podstawie ich właściwości biochemicznych, a w dalszej kolejności - na podstawie reakcji serologicznych z O lub H antygenami. Do określenia serologicznego pałeczek z rodzaju Salmonella dostępne są w handlu surowice odpornościowe lub gotowe zestawy do szybkiej identyfikacji antygenów grupowych; w większości dotyczy to grupy A, B, C i D (S. enterica subsp. enterica). Wstępna charakterystyka biochemiczna pałeczek z rodzaju Salmonella określa następujące cechy: są ruchome, laktozo-ujemne, malonian +, H₂S + , produkują gaz podczas fermentacji węglowodanów, nie produkują indolu, rosną na podłożu Simmonsa, wytwarzają dekarboksylazę lizyny. Większość dostępnych w handlu gotowych zestawów do identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae umożliwia różnicowanie pałeczek do poziomu rodzaju Salmonella.

Chorobotwórczość: pałeczki należące do serotypu S. typhi wywołują dur brzuszny (grupa D serologiczna), należące do serotypu S. paratyphi A, B lub C wywołują dury rzekome, a pozostałe serotypy - choroby zakaźne określone wspólną nazwą salmonelozy. Salmonelozy są kwalifikowane również do chorób zakaźnych odzwierzęcych (antropozoonozy). U ludzi obserwowane mogą być następujące grupy objawów chorobowych spowodo­wane przez pałeczki z rodzaju Salmonella:

1. Gastroenteritis - najczęstsza postać kliniczna, od średnio-ciężkiej do piorunującej biegunki z gorączką i różnym stopniem wymiotów i/lub nudności. W tej grupie będą się mieściły epidemie pokarmowe lub wodne, występujące w postaci ostrych zaburzeń żołądkowo-jelitowych związanych ze spożyciem pokarmu zanieczyszczonego, pochodzą­cego z jednego lub kilku źródeł. Dotyczy to zatem objawów kwalifikowanych także do grupy zatruć pokarmowych i/lub biegunek sekrecyjnych czy biegunek podróżnych. Okres inkubacji do wystąpienia objawów chorobowych w przypadku zatruć pokarmowych spowodowanych pałeczkami Salmonella spp. wynosi 16-36 h.

2. Bakteriemia lub posocznica (S. choleraesuis, S. typhimurium i S. agona - serotypy szczególnie inwazyjne) charakteryzujące się wysoką gorączką.

3. Zespól określany jako gorączka jelitowa (enteric fever); potencjalnie może być wywołany przez każdy serotyp Salmonella. Zazwyczaj objawia się jako średnio wysoka gorączka i biegunka, z wyjątkiem klasycznych przypadków gorączki duru brzusznego (typhoid fever, S. typhi). Te ostatnie⁽w wielu krajach Europy rejestrowane są sporadycz­nie.

4. Objawy chorobowe zlokalizowane pozajelitowe należą do rzadko występujących (m.in. zakażenia układu moczowego, oddechowego, skórne, ropnie narządów i inne).

5. Stan nosicielstwa pochorobowego (głównie S. typhi, S. typhimurium i S. enteritidis) - pacjenci z wcześniejszymi zakażeniami mogą wydalać bakterie z kałem przez kilka miesięcy po remisji objawów. Często wraz z żółcią.

6. Stan nosicielstwa lub kolonizacji - zakażenie bezobjawowe występuje u około 1 % populacji; w niektórych środowiskach odsetek może być wyższy.

U ludzi zakażenia i zatrucia pokarmowe są najczęściej wywoływane przez produkty żywnościowe i wodę, które są zanieczyszczone ludzkimi lub zwierzęcymi wydalinami. Zachorowania sporadyczne, rodzinne oraz małe i duże epidemie są rejestrowane w wielu krajach we wszystkich częściach świata. Obserwowane jest zróżnicowanie geograficzne udziału poszczególnych serotypów w tych stanach chorobowych. Do dominujących należą serotypy należące do grupy A, B, C i D (wg Kauffmana-Whitea). Zachorowania na dur brzuszny i dury rzekome w ostatniej dekadzie miały tendencję spadkową w wielu krajach Europy, również i w Polsce; notowano pojedyncze przypadki durów rzekomych oraz kilkadziesiąt przypadków duru brzusznego rocznie. Natomiast w wielu krajach wzrastała liczba przypadków salmonelozy. W Polsce rejestrowano ostatnio średnio rocznie ponad 40 000 przypadków zachorowań i zatruć pokarmowych spowodowanych pałeczkami z rodzaju Salmonella. W wielu krajach, również i w Polsce obserwuje się sezonowy wzrost zachorowań od maja do czerwca. Zachorowania dotyczą ludzi w każdym wieku, najwięcej jest ich w najmłodszych grupach wiekowych — od 0 do 4 lat; w tej grupie wiekowej rejestrowane są także zgony. Od kilku lat w Polsce obserwuje się tendencję zwyżkową salmoneloz wywołanych serotypem Salmonella enteritidis (grupa D) (1982 r. -37% spośród wszystkich serotypów, a w roku 1984 ponad 60%). W dalszej kolejności są serotypy: S. typhimurium, S. agona, S. thompson, S. Heidelberg, S. oranienburg, S. infantis, S. anatum, S. brandenburg, S. bovis morbificans, S. london, S. newport, S. panama oraz inne liczne serotypy stwierdzane w zachorowaniach pojedynczych. W ciągu roku wykrywanych jest kilkadziesiąt różnych serotypów uczestniczących w zakażeniach u ludzi. Sytuacja epidemiologiczna salmoneloz wywołanych przez niektóre serotypy ulega zmianom. I tak nie notuje się od kilku lat zachorowań związanych z serotypem S. stanleyville. W diagnostyce zakażeń mają zastosowanie metody konwencjonalne bakteriologiczne zmierzające do izolacji i identyfikacji bakterii w metodach hodowlanych. Dla celów diagnostycznych, a zwłaszcza epidemiologicznych, dokonywane jest typowanie serologiczne i bakteriofagowe szczepów. Wprowadzane są nowe techniki do identyfikacji oraz dla celów epidemiologii, takie jak: badanie profilów plazmidów skrytych przy użyciu technik analizy restrykcyjnej z endonukleazą lub sondy genetycznej do badania sekwencji nukleotydów w DNA i w mRNA. Podjęto również ostatnio badania genów kodujących informacje o wyznacznikach chorobotwórczości; jak dotąd, wykryto pho P locus Salmonella, którego produkty fenotypowej ekspresji są przedmiotem badań. W diagnostyce zakażeń pałeczkami z rodzaju Salmonella mają zastosowanie praktycz­ne również badania serologiczne.

Czynniki chorobotwórczości Cd.

Na chorobotwórczość pałeczek Salmonella składa się wiele cech. Najważniejszą rolę przypisuje się endotoksynie i cechom metabolicznym pozwalającym na przebycie kwaśnego środowiska żołądka i przeżycie wewnątrz fagosomu makrofagów (kodo­wane przez geny tolerancji kwaśnego środowiska 17). Bez wątpienia istotną rolę odgrywają kodowane chromosomalnie inwazyny: białka i specjalne systemy sekrecyjne odpowiedzialne za zakotwiczenie na kosmkach jelita cienkiego i penetrację bakterii do wnętrza wyściełających go komórek. Wśród inwazyn są też białka sty­mulujące apoptozę makrofagów oraz enzymy odpowiedzialne za syntezę niektórych aminokwasów. Sugerowana jest zdolność wytwarzania cytotoksyny, choć obserwo­wane objawy mogą być także efektem specyficznego, zapalnego pobudzenia tkanek przewodu pokarmowego. Wszystkie Salmonella (z wyjątkiem, co ciekawe, S. Typhi) zawierają duże plazmidy kodujące niektóre cechy ich chorobotwórczości. Podobnie jak w przypadku innych bakterii, determinanty (geny) chorobotwórczości Salmonel­la umiejscowione są przede wszystkim w określonych regionach chromosomu zwa­nych wyspami patogenności SPI (ang. Salmonella pathogenicity islands). Zasady i sposób ekspresji wszystkich zawartych tam genów nie zostały jeszcze dokładnie poznane.

Klasyfikacja i znaczenie kliniczne

Klasyfikacja rodzaju Salmonella obejmująca gatunki zawsze budziła wątpliwości. Stosowany do niedawna podział okazał się pozbawiony filogenetycznego uzasadnienia. Różne źródła podają różną liczbę „prawdziwych" gatunków tego rodzaju: od jednego do dwunastu. Taksonomia filogenetyczna oparta na badaniu sekwencji 16S rDNA wydziela dwa gatunki: Salmonella enterica i Salmonella bongori. W obrębie lego pierwszego wyróżnia się sześć podgatunków (podgrup). W pierwszym i nich: Salmonella enterica subsp. enterica wyróżniono ponad 2500 odmian serologicz­nych nazwanych serowarami (dawniej serotypami). Sklasyfikowane są one w sche­macie identyfikacji serologicznej Kauffmanna-White'a uwzględniającym w obrębie rodzaju Salmonella różnorodność antygenów rzęskowych (antygen H) oraz związa­nych z LPS (lipopolisacharydem) antygenów somatycznych (antygen O) i obecność m niektórych antygenu Vi. Serowary Salmonella enterica subsp. enterica określa się ich dawnymi nazwami, choć dla podkreślenia, że nie stanowią one gatunków, używa się prostego druku pisząc te nazwy dużą literą. Tak więc wyróżnia się na przykład Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis itd.

Różnicowanie

Pałeczki Salmonella są urzęsione, nie fermentują laktozy, nie wytwarzają indolu. Różnicowanie tylko niektórych odmian serologicznych w obrębie rodzaju Salmonella może być oparte na wynikach testów biochemicznych. Są to: wykorzystywanie cytrynianu, wytwarzanie H₂S oraz gazu z rozkładu glukozy na podłożu Kliglera, dekarboksylacja lizyny i ornityny, wytwarzanie dihydrolazy argininy, fermentacja cukrów: dulcytolu, L-arabinozy. L-ramnozy, ksylozy. Należy także wspomnieć o nielicznych wprawdzie szczepach S. enterica subsp. arizonae, które fermentując laktozę wprowadzają prawdziwy zamęt w systemach identyfikacyjnych pałeczek Enterobacteriaceae. Identyfikacja wszystkich odmian serologicznych rodzaju Salmonella odbywa się na drodze serologicznej. W celu oznaczenia grupy serologicznej można się posłużyć testem lateksowym. Postępowanie służące pełnej identyfikacji serowarów z użyciem zestawów surowic z przeciwciałami dla antygenów rzęskowy: (H) i somatycznych (O) jest wyznaczane przez schemat Kauffmanna-Whitea.

Salmonella Typhi (pałeczka duru brzusznego) jest najważniejszą, choć nie naj­częściej izolowaną odmianą serologiczną rodzaju Salmonella. Wywołuje ona dur brzuszny (łac. typhus abdominalis), chorobę o określonej patogenezie i uogólnionym przebiegu szerzącą się tylko wśród ludzi. Człowiek jest jedynym rezerwuarem tych bakterii. Do zakażenia dochodzi drogą fekalno-oralną. Potrzebna jest duża dawka infekcyjna - 10⁶-10⁸ komórek, aby zakażenie było efektywne. Dur brzuszny rozwija się długo (10-14 dni), faza wysokiej gorączki (duru) związana jest z wysiewami bakterii do krwi (bakteriemią). Występują objawy ze strony przewodu pokarmowego wymioty, biegunka lub zaparcie. Chorobie towarzyszy wysypka skórna - różyczka durowa. Bakterie powodują głównie zmiany w obrębie układu chłonnego jelit. In­fekcja ta pozostawia czasem nosicielstwo tych pałeczek w jelicie lub drogach żółcio­wych, co stanowi zagrożenie dla otoczenia osób, które ją przebyły. Łagodniejszą formą duru brzusznego jest wywoływany przez S. Paratyphi dur rzekomy. Także w tym przypadku infekcja dotyczy tylko ludzi. Nosicielstwo tych pałeczek jest rzadsze. Inne, często izolowane odmiany serologiczne S. enterica subsp. enterica to S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Hadar, S. Infantis, S. Yirchof. Są one także bezwzględnie chorobotwórcze. Przedstawiona kolejność odzwierciedla częstość ich izolacji w Polsce w ostatnich latach. Wywołują salmonellozy (łac. salmonellosis) - zapalenia jelita cienkiego i grubego, tzw. toksykoinfekcje - inwazyjne zatrucia pokarmowe. Rezerwuarem tych pałeczek są zwierzęta hodo­wlane (drób i jego jaja, bydło, trzoda) i dzikie, dla których pałeczki te są pierwotnym patogenem. Zakażenie przenosi się na człowieka i rozprzestrzenia głównie poprzez potrawy przygotowane z produktów skażonych odchodami, po niedostatecznej obróbce termicznej. Potrzebna duża dawka infekcyjna jest łatwo osiągana, gdyż pałeczki te dobrze mnożą się w pokarmach i na zanieczyszczonych powierzchniach. Choroba ma krótki okres wylęgania (6-48 godzin). Towarzyszą jej wysoka gorączka, bolesne skurcze jelit i śluzowa, krwawa biegunka. Choroba trwa 2-6 dni i na ogół, jeśli nie wystąpią zaburzenia elektrolitowe, ustępuje bez leczenia. Pałeczki należące do odmiany serologicznej S. enterica subsp. arizonae (dawniej Arizona hinshawii), których głównym rezerwuarem są gady (ale także drób i jaja), wywołują salmonellozy, których kliniczny obraz infekcji może być bardzo różnorodny, inny niż w salmonellozach wywoływanych przez wyżej wymienione pałeczki. Zakaże­nie może bowiem prowadzić do zmian miejscowych, w postaci zapalenia mózgu, wątroby czy szpiku kostnego.

Rodzaj Yersinia (informacje ogólne):

Rezerwuarem pałeczek tego rodzaju są zwierzęta zarówno dzikie, jak i hodowlane. W jego obrębie wyodrębniono kilkanaście gatunków. Dla człowieka chorobotwórcze są Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica - pałeczka jersiniozy, Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis - dawniej nazywana pałeczką rodencjozy i Yersinia pestis - pałeczka dżumy. Te dwie ostatnie są rzadko izolowane w Polsce.

Wspólnym czynnikiem chorobotwórczości wymienionych gatunków Yersinia są adhezyny oraz złożony system toksycznych i transportowych białek ściany ko­mórkowej - YOP (ang. Yersinia outer proteins). Funkcje części tych białek są już poznane: białka o masie 25 kDa mają działanie cytotoksyczne, a za ich tanslokację do wnętrza komórek odpowiedzialne są inne białka tej grupy; inne białka odgrywają rolę w transporcie żelaza; jeszcze inne hamują agregację płytek kiwi; kolejne uniemożliwiają fagocytozę pałeczek Yersinia. Do tej grupy zaliczany Jest też obecny w ścianie antygen V (ang. virulence), ale jego rola nie jest bliżej poznana. Zgodnie z klasyfikacją Bergeya do rodzaju Yersinia należy 7 gatunków: 1. Y. pestis (pałeczka dżumy), 2. Y. pseudotuberculosis (pałeczka rodencjozy), 3. Y. en­terocolitica (pałeczka jersiniozy), 4. Y. intermedia, 5. Y. frederiksenii, 6. Y. kristensenii i 7. Y. ruckeri. W klasyfikacji wg Ewinga (1986) dodany został gatunek 8. Y. aldovae. Ostatnio (1989) opisano dwa nowe gatunki z rodzaju Yersinia, które wcześniej stanowiły grupy biotypowe gatunku Y. enterocolitica. Wyniki badań biochemicznych, antygeno­wych i podobieństwa DNA wykazały, że grupy biotypowe, oznaczane jako 3A i 3B tego gatunku, są całkowicie różne od innych szczepów biotypu 3. Dla dotychczasowych szczepów grupy biotypowej 3A Y. enterocolitica nadano nazwę gatunkową Yersinia mollareti, a dla grupy biotypowej 3B — Yersinia bercovieri. Łącznie opisano dotąd 10 niezależnych gatunków z rodzaju Yersinia. Charakterystyka: są to bakterie Gram-ujemne, małe ziarniako-pałeczki, które rosną na podłożu MacConkeya w optymalnej temperaturze 22-29°C, z opóźnieniem (do 72 h), w postaci szarobiałych kolonii 1-2 mm po 48 h inkubacji (w temperaturze pokojowej). Szczepy z gatunku Y. enterocolitica mogą przeżyć przez długi okres (kilka miesięcy) w temperaturze +4°C (zimna hodowla). Bakterie te nie wytwarzają gazu podczas fermentacji węglowodanów, są nieruchome w temperaturze 37°C, wykazują ruch w temperaturze 22-25°C (Y. pestis jest nieruchoma), nie wytwarzają: H₂S, indolu (są biotypy indolo-dodatnie Y. enterocolitica), acetoiny (VP- dekarboksylazy lizyny, nie rosną na podłożu Simmonsa, i nie fermentują laktozy, rozkładają glukozę, sacharozę (Y. enterocolitica). Szczepy z gatunku Y. enterocolitica są zróżnicowane biochemicznie, stąd są dalsze ich podziały na grupy biotypowe (1-5).

Budowa antygenowa: szczepy z gatunku Y. pestis nie mają dalszego podziału na serotypy. Szczepy z gatunku Y. pseudotuberculosis dzielą się na 13 grup serologicznych na podstawie zróżnicowania antygenu O. Przyjęty powszechnie schemat budowy antygeno­wej Y. pseudotuberculosis uwzględnia 6 dużych grup serologicznych O z podgrupami (Knapp i Thal); grupy te oznaczone są od I do VI. W obrębie szczepów kwalifikowanych do gatunku Y. enterocolitica określono do chwili obecnej ponad 50 serotypów na podstawie antygenu O; są one oznaczone cyframi arabskimi 1, 2, 3 itd. (Winblad, Wauters). Inny schemat budowy antygenowej Y. enterocolitica uwzględnia, podobnie jak dla gatunku Y. pseudotuberculosis, sześć grup serologicznych O I-VI (wg Knappa i Thala). Serotypy Y. enterocolitica, określone jako patogeny, należą głównie do grupy IA (0:3 serotyp wg Wautersa), V (0:9 serotyp) oraz VI (0:8 serotyp). Inne, często izolowane z materiałów klinicznych serotypy, to 5 (grupa IV) i 6 (nie ma odpowiednika wg Knappa i Thala). Szczepy z gatunków Y. intermedia, Y. frederiksenii i Y. kristensenii stanowią określone serotypy i biotypy w podziale pierwotnym szczepów z gatunku Y. enterocolitica; od 1980 roku wyłączone zostały z tego gatunku. Pokrewieństwo na poziomie DNA szczepów z gatunku Y. pestis i Y. pseudo­tuberculosis wynosi więcej niż 90%, zaś tylko w 48% homologia DNA obserwowana jest między tymi dwoma gatunkami i Y. enterocolitica.

Chorobotworczość

Na chorobotwórczość szczepów (serotypów) Y. enterocolitica składa się wiele cech. Część patogennych szczepów wytwarza enterotoksynę ST podobną do termostabilnej toksyny szczepów ETEC. Brana jest także pod uwagę, dla inwazyjności szczepów patogennych, rola produktów chromosomalnych genów inv. W ścianie komórkowej niektórych odmian serologicznych tych bakterii znaleziono też składnik mitogenny dla limfocytów T, wywołujący nadmierną reaktywność immunologiczną podobną do tej, jaką powodują znane superantygeny bakteryjne. Uważa się, że powikłanie zakażenia w postaci reaktywnego zapalenia stawów może być efektem takiego działania. Zakażenia wywoływane przez podgatunki - Y. enterocolitica i Y.pseudotuberculosis są zoonozami, które określa się obecnie wspólną nazwą jersiniozy. Patogenne szczepy z rodzaju Yersinia są wewnątrzkomórkowymi bakteriami, które namnażają się w makrofagach i fibroblastach; należą do gatunków Y. pestis, Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica (głównie serotyp 0: 3 (IA), 0:9 (V) i 0: 8 (VI)). Ostatnio badania w mikroskopie elektronowym wykazały u królików również pozakomórkowy mechanizm proliferacji pałeczek Y. pseudotuberculosis.

Czynniki zjadliwości: wykazano u szczepów należących do trzech gatunków z rodzaju Yersinia; są one kodowane w chromosomie i w plazmidach. We wszystkich plazmidach zjadliwości (pYV) znajduje się region genów Icr (region wapnia = Iow calcium response), który ma 5 podjednostek (Icr A, Icr B, Icr C, Icr F i Icr I), określanych też jako loci vir. Region ten reguluje ekspresję białek błony zewnętrznej Yersinia (Yops = Yersinia outer proteins) i innych białek, z wyjątkiem Yop 1. Do polipeptydów kodowanych w plazmidzie zjadliwości należą wcześniej znane jako antygeny białkowe V i W determinanty zjadliwości Yersinia, są one wyrażone w 37° w nieobecności wapnia. Antygen V jest kodowany w genie jednostki nazywanej V-operonem (u Y. pestis jest to Icr GVH operon).Właściwości wirulencji V-antygenu nie są określone, lecz wiadomo, że przeciwciała anty-V pełnią rolę ochronną w zakażeniach Yersinia. Antygen W jest lipoproteiną 140 kDa. Przeciwciała anty-W nie wykazują ochronnego działania w do­świadczalnym zakażeniu myszy Y. pestis.

Białko błony zewnętrznej oznaczone jako Yop 1 (Yad A) (240 kDa), którego ekspresja jest indukowana w temperaturze 37°C, nie jest regulowane przez wapń (Icr region w plazmidzie), lecz raczej przez temperaturę.

Białko Yop 1 jest strukturalnym składnikiem włókien Yersinia; jedno włókno zawiera 4 do 5 cząsteczek Yop 1. Białko Yop 1 jest odpowiedzialne za autoaglutynację szczepów Yersinia, oporność na surowicę i prawdopodobnie główną jego funkcją jest adherencja. Białko to ma zdolność wiązania z komórkami Hep-2, kolagenem i fibronektyną; uczestniczy także w adhezji do błony śluzowej jelita. Białko Yop 1 nie występuje u szczepów z gatunku Y. pestis.

Białko Yop 2a (Yop M), opisane jako proteina kwaśna 41,5 kDa u Y. pestis; wykazuje homologię z wiązaniem glikoproteinowym Ib błony komórkowej płytek krwi.

Białko Yop 2b u Y. pseudotuberculosis i u Y. enterocolitica odpowiedzialne jest za hamowanie fagocytozy. Ostatnio wykazano, że Yop 2b wykazuje aktywność fosfatazy tyrozynowej, która działa w transdukcji sygnalnej lub regulacyjnym cyklu komórkowym komórek zwierząt w czasie zakażenia pałeczkami Yersinia.

Białko Yop 4a (Yop D) o nieco różnej wielkości u Y. enterocolitica 0:8 (36 kDa) oraz Y. pestis i Y. pseudotuberculosis (34 kDa, każde) wykazuje silne działanie immunogenne. Białko Yop 3 (Yop E) 25 kDa jest istotnym czynnikiem zjadliwości u Y. pseudotuber­culosis; uczestniczy w hamowaniu fagocytozy razem z Yop 2b i jest odpowiedzialne za cytotoksyczność w stosunku do komórek HeLa. Opisano liczne inne białka błony zewnętrznej komórek Yersinia. Gen dla Yop 3 lub Yop B (41 kDa) jest obecny we wszystkich pYV plazmidach, niezależnie od pochodzenia szczepu.

Białka Yop 20, Yop 30 i Yop 84 są kodowane w plazmidzie zjadliwości występującym u szczepów Y. enterocolitica serotypu 0:9, a Yops J, K. i L w plazmidzie wirulencji Y. pestis.

W komórkach Y. pestis, oprócz plazmidu zjadliwości 70 kb, wykazano obecność innych plazmidów — małego 9,5 kb (6 mDa) (Pst plazmid) i dużego - 100 kb (65 mDa). Gen pla w plazmidzie Pst koduje informację dla aktywatora plazminogenu aktywności koagulazowej. Wynikiem ekspresji genu pla jest degradacja białek Yops. Białko Pla (34,6 kDa) zawiera peptyd sygnalny i wykazuje homologię z aktywatorem plazmłnogenu OmpT u E. coli. Plazmid Pst zawiera dwa geny; jeden z nich koduje informację o produkcji pestycyny, która jest bakteriocyną zdolną do katalizowania hydrolizy peptydoglikanu.

Czynniki zjadliwości kodowane w chromosomie u pałeczek Yersinia dotyczą m.in. oporności surowiczej, co oznacza, że bakterie te są oporne na efekt bakteriobójczego działania uwarunkowanego aktywnością dopełniacza normalnej ludzkiej surowicy. Czynnik zjadliwości, związany z opornością surowiczą, jest kodowany w chromosomie u Y. pestis i Y. pseudotuberculosis. Ekspresja jest konstytutywna u Y. pestis i temperaturo-zależna u Y. pseudotuberculosis; w temperaturze 26°C Y. pseudotuberculosis jest wrażliwa na surowicę, a w 37°C jest oporna na efekt bakteriobójczego działania surowicy. Oporność na 10% surowicę ludzką u Y. enterocolitica jest zależna od plazmidu wirulencji i jest obserwowana po wzroście bakterii w 37°C, bez względu na stężenie wapnia. Ostatnie badania wskazują na białko Yop 1, które być może determinuje oporność surowiczą u Y. enterocolitica.

Wykazano obecność dwóch białek regulujących żelazo, które są kodowane w chromo­somie; dotyczy to tylko patogennych szczepów Yersinia. Niektóre szczepy Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis, które wykazują działanie letalne dla myszy, produkują siderofory, zdolne do wychwytywania żelaza z transferrytyny. U szczepów enteropatogennych z rodzaju Yersinia wykazano trzy różne mechanizmy inwazyjności, tj. ich zdolności do penetracji nabłonka jelita. Pierwszy mechanizm wiąże się z genem inv, zawartym w chromosomie, który koduje białko błony zewnętrznej nazwane inwazyną. Koniec karboksylowy inwazyny jest odpowiedzialny za przyleganie do komórek. Struktura, przez którą inwazyną wiąże się, jest receptorem należącym do rodziny VLA, który jest częścią nadrodziny integryn. Ekspresja genu inv u Y. pseudo­tuberculosis jest zależna od temperatury. Szczepy Y. enterocolitica serotypu 0:3 - jako szczepy artrytogeniczne (arthritogenic strains)- są przedmiotem szczegółowych badań. Inny mechanizm inwazyjności do tkanek uwarunkowany jest przez gen ail, który jest określany jako zależny od linii komórkowej. Białko Ail (19 kDa) jest typową sekwencją sygnalną. Sekwencje genu inv wykazano u wszystkich gatunków rodzaju Yersinia, zaś homologiczne sekwencje dla genu ail tylko u szczepów patogennych tego rodzaju; różnice występowały również wśród serotypów Y. enterocolitica. Geny inv i ail nie są homo­logiczne. Trzecia droga inwazyjności jest warunkowana plazmidami wirulencji. Ten efekt jest zależny od temperatury i ma niski poziom penetracji (wejścia) do komórek (około 1% odpowiedzi związanej z inwazyną). Wspomniane wcześniej białko Yop 1 prawdopodo­bnie uczestniczy w tym mechanizmie. Oprócz wymienionych wyżej czynników zjadliwości niektóre szczepy z rodzaju Yersinia wytwarzają klasyczne egzotoksyny białkowe lub enzymy toksyczne, które mogą stanowić ważne elementy w patogenezie zakażeń. Szczepy z gatunku Y. enterocolitica mogą wytwarzać enterotoksyny typu LT i ST, podobne do produkowanych przez E. coli które są odpowiedzialne za biegunkę sekrecyjną (p. Toksyny E. coli, s. 198). Nie wyka­zano tej właściwości u szczepów z gatunku Y. pseudotuberculosis. Niektóre szczepy, głównie z gatunku Y. enterocolitica mogą wytwarzać hemolizyny, których produkcja uwarunkowana jest obecnością plazmidu Hly. Wykazano też inną aktywność cytolityczną, taką jak produkcja lecytynazy i/lub lipazy, wśród szczepów Yersinia, izolowanych głównie z materiałów od ludzi chorych.

Występowanie i postacie kliniczne zakażeń pałeczkami z rodzaju Yersinia:

Pałeczki Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica są dość powszechne w śro­dowisku. Gatunek Y. enterocolitica występuje w środowisku naturalnym (jeziora, strumienie, inna woda, gleba, zboże), w pokarmach (mleko, produkty mięsne, ozory wieprzowe i migdałki, ostrygi, kraby, ryby morskie, słodkowodne itd.), u wszystkich zwierząt bezkręgowych i kręgowców. Na podstawie zróżnicowania anty­genu somatycznego O wyodrębniono 54 grupy serologiczne, spośród których infekcje u ludzi wywołują najczęściej O:3; O:8; O:9; O:5,27. Y. enterocolitica powo­duje zakażenia przenoszone drogą pokarmową - zapalenie jelit, częściej u niemow­ląt i małych dzieci, ale także i u dorosłych. Długotrwałe biegunki połączone z gorączką i zajęciem węzłów chłonnych w obrębie jamy brzusznej są często spowodo­wane spożyciem skażonego mleka i produktów mlecznych, ale także innych pro­duktów. Do zakażenia najczęściej dochodzi drogą pokarmową. Trzoda chlewna stanowi główny rezerwuar i źródło zakażenia dla ludzi w niektórych krajach. Jersinioza jest zaliczana do chorób zakaźnych człowieka i zwierząt ze wspólnym rezerwuarem, którym jest środowisko naturalne (sapronoza). Nazwa Yersiniosis przyj­mowana jest również dla zakażeń wywoływanych przez oba gatunki, tj. Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica. Rzadko występują zakażenia człowieka - od człowieka (np. lekarz od dziecka w czasie biopsji jelita), częściej poprzez transfuzje krwi. Sezonowość zachorowań i zwiększona częstość izolowania szczepów ze środowiska jest zróżnicowana w różnych regionach. W krajach skandynawskich, północnej Europy i Japonii dotyczy to miesięcy zimowych i jesiennych. Obserwowane jest również specyficzne rozmieszczenie serotypów. W zakażeniach u ludzi w krajach Europy, w tym i w Polsce, biorą udział serotypy 0:3 (IA) (dominujący), 0:9 (V) i 0:5,27 (IV). Serotyp 0:3 z wysoką częstością występuje w Japonii. Najczęstszym serotypem izolowanym w USA dotąd był serotyp 0:8, ale ostatnio obserwowany jest wzrost również serotypu 0:3. Patogenne serotypy, takie jak: 0:4,32,0:8,0:13a, 13b, 0:13,18,0:20 i 0:21 są nazywane „szczepami amerykańskimi", które pochodzą głównie z Północnej Ameryki.

Y. pestis: jest czynnikiem etiologicznym dżumy (pestis). Choroba przenoszona jest na człowieka za pośrednictwem pcheł, przez kontakt z zakażonymi zwierzętami, ale także drogą kropelkową od chorych ludzi. Dżuma może wystąpić w trzech klinicznych postaciach: dymienicza (węzłowa), płucna i posocznicowa. Postać płucna dżumy może być przenoszo­na od człowieka do człowieka drogą kropelkową; jest wysoce zaraźliwa. Okres inkubacji jest krótki (3-6 dni), objawy szybko narastają, doprowadzając do zejścia śmiertelnego. Dżuma należy do chorób kwarantannowych, podlegających rejestracji w WHO. W 1988 roku zarejestrowano łącznie 1363 przypadki dżumy pochodzące z 9 krajów: Madagaskar, Tanzania, Zair, Boliwia, Brazylia, Peru, USA, Chiny i Wietnam. Komórki Y. pestis wytwarzają bakteriocynę - pestycynę, aktywator plazminogenu oraz koagulazę. Czynniki te są odpowiedzialne za wykrzepianie wewnątrznaczyniowe i gwałtowny rozwój zakażenia. Pałeczka dżumy należy do grupy bakterii, które stanowią zagroże­nie bioterrorystyczne (najwyższa kategoria A) i już wielokrotnie była wykorzystywana jako broń biologiczna.

Inne gatunki: szczepy Y. frederiksenii są najczęściej izolowane ze świeżej wody, pokarmów, nienawożonej gleby, rzadko z próbek materiałów od ludzi. Może być nosicielstwo (kolonizacja) przewodu pokarmowego, bez objawów biegunki. Sporadycz­nie były izolowane z przypadków chorobowych (np. zapalenie płuc). Szczepy z gatunku Y. intermedia sporadycznie izolowano z przypadków zakażeń układu moczowego, ropni zlokalizowanych w kościach, zapalenia spojówek i zakażeń przewodu pokarmowego.

Y. pseudotuberculosis: jest czynnikiem etiologicznym rodencjozy (rodentiosis), która należy do chorób zakaźnych odzwierzęcych (antropozoonoza) i jest szeroko rozprze­strzeniona w świecie, endemicznie występująca wśród zwierząt małych i dużych w nie­ których regionach geograficznych. Gatunek ten występuje wśród małych gryzoni (myszy, szczury), dzikich ptaków, a także wśród zwierząt hodowlanych (np. drób), domowych (koty, psy) oraz zwierząt laboratoryjnych (np. świnka morska, chomik). U zwierząt choroba objawia się najczęściej w postaci martwiczych ziarniniaków z lokalizacją w wątrobie, śledzionie i węzłach chłonnych. U ludzi do zakażenia dochodzi najczęściej poprzez kontakt ze zwierzętami, personelem obsługującym zwierzęta, produktami pochodzenia zwierzęcego. Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis jest mniej rozpowszechniona w środowisku, a zakażenia znacznie rzadziej spotykane. Dochodzi do nich drogą pokarmową. Najczęściej Y. pseudotuberculosis wywołuje zapalenie węzłów chłonnych krezki przypominające zapalenie wyrostka robaczkowego. Opisywane są też postaci jelitowe zakażenia tymi pałeczkami.

Wyróżnia się następujące postacie kliniczne rodencjozy:

1. Zapalenie węzłów chłonnych krezki jelitowej (adenitis mesenterica lub lymphadenitis mesenterialis), które objawia się w postaci ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego. Charakterystyczny obraz histopatologicznych zmian oraz hodowle szczepów Y. pseudotuberculosis dotyczą węzłów chłonnych krezki, pobranych do badań w czasie zabiegu operacyjnego. Ta postać kliniczna rodencjozy występuje najczęściej u dzieci i młodzieży w wieku szkolnym (6-18 lat) częściej u chłopców niż u dziewcząt i ma sezonowy charakter zachorowań - od jesieni do wiosny, ze szczytem w grudniu. Obserwowane są zachorowania sporadyczne, rodzinne lub w postaci małych albo większych epidemii. W większości przypadków zabieg operacyjny kończy chorobę, zdarzają się jednak nawroty i powikłania (np. wgłobienie jelit, rumień guzowaty, posocznice i inne). Ta postać nazywana jest często ostrą postacią brzuszną lub postacią pseudowyrostkową roden­cjozy. Rzadko dotyczy osób dorosłych.

2. Zapalenie jelit (enteritis, gastroenterocolitis, enterocolitis) - określane też jako łagodna postać brzuszna rodencjozy. W obrazie klinicznym nie ma swoistych objawów; podobne jest do innych tego typu zakażeń wywołanych przez inne pałeczki jelitowe. Występuje rzadko u dzieci i dorosłych. Szczepy Y. pseudotuberculosis rzadko są izolowane z próbek kału. Opisano sporadyczne zespoły biegunkowe skojarzone z zapaleniem płuc u dzieci.

3. Bakteriemie i posocznice - od lat osiemdziesiątych obserwuje się wzrost tych przypadków w wielu krajach. Niektóre z nich mają charakter jatrogenny. Dotyczą dzieci z hemopatiami, pacjentów z marskością i innymi chorobami przewlekłymi, pacjentów dializowanych i poddawanych zabiegom transplantacji. Wysoka śmiertelność - prze­kracza 30%. Pojedyncze przypadki posocznicy opisano u niemowląt, zakończone zgonem, również w naszym kraju. Szczepy izolowane są z próbek krwi.

4. Ropne zakażenia z różną lokalizacją: sporadycznie rejestrowano ropne zapalenia stawu kolanowego, zapalenia kości policzkowych, żeber, zapalenia płucno-opłucnowe, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, ropnie wątroby, śledziony, miejscowe zmiany skórne oraz sporadyczne przypadki zakażenia układu moczowego. We wszystkich tych postaciach zawsze izolowane są pałeczki Y. pseudotuberculosis z materiałów chorobo­wych.

5. Szkarlatynopodobna gorączka występuje endemicznie na terenie niektórych regio­nów byłego ZSRR, sporadyczne zachorowania notowano w ostatniej dekadzie w nie­których krajach skandynawskich (Szwecja). W tej postaci klinicznej pałeczki Y. pseudo­tuberculosis mogą być wyosobnione z próbek krwi, kału, moczu, plwociny.

Powikłania: do powikłań lub następstw zakażeń pałeczkami rodencjozy, głównie ostrej postaci brzusznej u dzieci, należą - rumień guzowaty, reaktywne zapalenie stawów, zapalenie tęczówki lub zapalenie nerek (nephritis, glomerulonephritis).

Rodencjoza u ludzi wywoływana jest najczęściej przez serotyp I (ponad 70% przypadków rejestrowanych w Polsce), rzadziej przez serotyp III (ponad 20% w Polsce) i sporadycznie przez inne serotypy, takie jak II, IV, V i VI F. pseudotuberculosis. Występowanie poszczególnych serotypów w zakażeniach u ludzi nie ma cech geograficz­nego zróżnicowania. Serotyp II i IV Y. pseudotuberculosis ma krzyżowe pokrewieństwo z antygenami somatycznymi odpowiednio grupy B i D pałeczek z rodzaju Salmonella, a serotyp VI z E. coli 0:55. Y. enterocolitica: kliniczne objawy zakażenia wywołanego przez ten gatunek (jersinioza) są bardziej zróżnicowane niż w przebiegu zakażenia pałeczkami rodencjozy.

Wyróżnia się następujące grupy postaci klinicznych, wg częstości występowania: postacie jelitowe, postacie pseudowyrostkowe, posocznice, rumień guzowaty i inne zmiany skórne, postacie stawowe oraz inne, rzadsze, pojawiające się jednak coraz częściej.

1. Postacie jelitowe: formy typu enteritis i enterocolitis są najczęstsze i występują u ludzi w każdym wieku - od kilku tygodni życia do 85 lat. Dominują jednak u bardzo małych dzieci od 0 do 7 lat; najwięcej przypadków o ostrym przebiegu, często doprowadzającym do zejścia śmiertelnego, dotyczy grupy 0-3 miesiące życia. Obraz chorobowy tych postaci jest dość stereotypowy: biegunka, gorączka, bóle brzucha, z wymiotami lub bez. Brak swoistych cech do odróżnienia od zakażeń wywołanych przez inne bakterie, takie jak: Salmonella, Shigella czy enteropatogenne E. coli. Okres wylęgania wynosi od l do 11 dni. W próbkach kału może być krew i leukocyty.

Przy braku leczenia odpowiednimi antybiotykami, które można byłoby zastosować wcześniej, rozwój choroby jest powolny i kończy się wyleczeniem średnio po 12-15 dniach, czasami jednak po wielu tygodniach. Wpływ antybiotyków jest tu istotny, ponieważ biegunka, bóle brzucha i gorączka znikają w ciągu kilku godzin. Pałeczki Y. enterocolitica są izolowane z próbek kału przed leczeniem i nie stwierdza się ich w badaniach kontrolnych po leczeniu.

Ta łagodna postać jelitowa może przejść w ciężką, z odwodnieniem i zatruciem, a nawet mogą być przypadki śmiertelne. I odwrotnie - mogą też występować formy dyskretne, ograniczające się jedynie do jednego, często niezauważalnego epizodu biegunkowego, trwającego krótko, bez innych dolegliwości ani objawów ogólnych.

Może też występować zakażenie bezobjawowe (nosicielstwo, kolonizacja); dotyczy to około 1% populacji ludzi zdrowych, częściej dzieci w najmłodszej grupie wiekowej (2%). W niektórych krajach i w niektórych populacjach stwierdza się wyższe odsetki nosicielst­wa tych bakterii w przewodzie pokarmowym. Zachorowania mogą być sporadyczne, rodzinne, w postaci mniejszych lub większych epidemii. Do tej grupy postaci jelitowej należą również biegunki sekrecyjne, często występujące w związku ze spożyciem wody, mleka, innych pokarmów zanieczyszczonych tymi bakteriami. Kwalifikowane są do grupy zatruć pokarmowych lub biegunek podróżnych. Za tego typu biegunki mogą być odpowiedzialne enterotoksyczne szczepy Y. entero­colitica.

2. Postacie pseudowyrostkowe: większość przypadków nie różni się w obrazie klinicznym od podobnej postaci klinicznej rodencjozy. Różnice dotyczą grupy wiekowej - chorują najczęściej dorośli (20-30 lat), rzadziej dzieci. Obraz ropnego, retikulocytarnego zapalenia węzłów chłonnych jest podobny do wykazywanego w rodencjozie. W przebiegu zakażenia Y. enterocolitica (ale nie w rodencjozie) może być obserwowany inny zespół, uważany za swoiste uszkodzenie przez te bakterie, znany jako ostre zapalenie końcowej części jelita krętego (ilelitis terminalis). Ta swoista postać zakażenia występuje w świecie nierównomiernie; częściej dotyczy to krajów skandynawskich niż innych. W tych postaciach klinicznych pałeczki Y. enterocolitica są izolowane z węzłów chłonnych krezki lub z zawartości wyrostka robaczkowego pobranych w czasie zabiegu operacyj­nego.

3. Postacie posocznicowe: sporadycznie rejestrowane przed 1970 rokiem, coraz częściej w ostatniej dekadzie. Zazwyczaj o ciężkim przebiegu i mimo leczenia, ponad 20% w ostatnich latach kończy się zejściem śmiertelnym. Posocznice dotyczące dzieci i młodych dorosłych chorujących na talasemię (niedokrwistość), niedokrwistość aplastyczną i hemolityczną często mają polimorficzny obraz z lokalizacją wieloogniskową zmian ropnych (np. zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, kości, oka itp.). Posocznice u osób dorosłych i w podeszłym wieku dotyczą pacjentów z grup tzw. ryzyka (np. marskość wątroby, alkoholizm, cukrzyca, choroby nowotworowe). Posocznice jatrogenne mają związek z dializą otrzewnową, transplantacją nerek, hemodializą i przetaczaniem krwi. Pałeczki Y. enterocolitica mogą występować we krwi i preparatach krwiopochodnych i krwio­zastępczych przechowywanych w temperaturze lodówki (+ 4°C hodowla).

4. Pozajelitowa lokalizacja jersiniozy: ropne zapalenia skóry, zapalenie szpiku i kości, ropnie wątroby, nerek, zapalenie gardła, zapalenie płuc, zakażenia układu moczowego, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie gałki ocznej i inne. W tych rzadko występujących postaciach, podobnie jak w postaciach jelitowych i posocznicowych, izolowane są bakterie z próbek materiałów od chorych.

5. Rumień guzowaty (erythema nodosum) i inne zmiany skórne i/lub tkanki łącznej występują z różną częstością w niektórych krajach. W krajach skandynawskich i w Polsce częstość ta określana jest na ponad 20% wśród wszystkich przypadków rumieni. Około 80% tej postaci jersiniozy obserwowanych jest u kobiet po 20 roku życia (najczęściej 30—40 lat), a pozostałe dotyczą mężczyzn, młodzieży i dzieci. Około 5% rumieni wielopostaciowych wywołanych jest przez Y. enterocolitica.

6. Postacie stawowe: określane jako reaktywne zapalenia wielostawowe, często symetryczne. Różne zespoły zapalenia stawów i artralgie skojarzone ze zmianami skórnymi lub inne choroby i zaburzenia, uważane zwykle za reumatyczne, oraz choroby mające niektóre cechy chorób reumatycznych są znane jako możliwe następstwa zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica; głównie dotyczy to serotypu 0:3 (IA).

7. Inne postacie: zespół oczno-stawowo-cewkowy (zespół Reitera), choroby tarczycy, kłębkowe-zapalenie nerek, choroby naczyń, zapalenie mięśnia sercowego. Wiele innych zespołów opisano w związku z zakażeniem Y. enterocolitica. Klasyfikacja postaci klinicznych jersiniozy może uwzględniać tylko trzy główne grupy, wiążące się z fazami zakażenia Y. enterocolitica. Do grupy I należałyby postacie jelitowe, posocznice i wszystkie inne pozajelitowe lokalizacje zakażenia ropnego - w tych postaciach bakterie mogą być wyosobnione z materiałów od chorych. Do grupy II i III fazy powikłań i nawrotów zaliczone byłyby postacie skórne, stawowe itd. - w tych wszystkich różnorodnych zespołach rzadko izolowane są pałeczki Y. enterocolitica (sporadycznie przy ramieniu guzowatym towarzyszącym postaci jelitowej), natomiast rozpoznanie jest ustalone na podstawie odpowiedzi humoralnej, w postaci obecności swoistych przeciwciał zawartych w surowicy chorych. W niektórych zespołach stwierdza się odporność komórkową (rumień guzowaty, choroby tarczycy - odczyn zahamowania migracji leukocytów krwi obwodowej) lub obecność antygenu Y. enterocolitica w kom­pleksach immunologicznych (glomerulophritis - IIF, ELISA).

Identyfikacja i różnicowanie

Yersinia są najmniejsze spośród pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, a długość ich komórek nie przekracza zwykle 2 μm. Ich kształt często jest ziarenkowaty. Yersinia tworzą też bardzo drobne kolonie, często osiągające średnicę 1 mm dopiero po 48 godzinach hodowli. Pałeczki Yersinia wyrastają na podłożu MacConkeya i na agarze z krwią. Optymalna temperatura ich wzrostu to 28-30°C, ale wykazują one dużą tolerancję i mnożą się także w niskich dodatnich temperaturach. Gatunki zaopatrzone w rzęski tylko w tej temperaturze, lub niższej (22°C), wykazują ruch, a w temperatu­rze 37°C są nieruchliwe. Pałeczki te mają zdolność mnożenia, także w żywności przechowywanej w lo­dówce. Do izolacji pałeczek Y. enterocolitica z materiałów klinicznych wykorzystuje się podłoże CIN, na którym tworzą one małe (1-2 mm) kolonie, lub podłoże MacConkeya, na którym tworzą kolonie 1-2 mm, płaskie, bez­barwne lub jasnoróżowe. Różnicowanie Y. enterocolitica z Y. pseudotuberculosis wywołującą infekcje przewodu pokarmowego o podobnym przebiegu odbywa się na podstawie fermentacji cukrów, dekarboksylacji ornityny i wytwarzania indolu. Te odmiany serologiczne Y. enterocolitica, które są chorobotwórcze, nie fermentują salicyny ani nie hydrolizują eskuliny. Próby te są dodatnie dla serotypów saprofitycznych. Szczepy chorobotwórcze wykazują także dodatni test autoagregacji. Po 24 godzinach hodowli na podłożu Clarka (dla testów MR i VP ) pałeczki tworzą wyraźne agregaty osadzające się na ściankach lub dnie probówki. Cecha ta jest przenoszona na dużych plazmidach, na których zakodowane są także jeszcze inne cechy składające się na chorobotwórczość tych szczepów. Plazmidy te mogą być jednak spontanicznie tracone w temperaturze wyższej niż 30°C. Diagnostyka zakażeń pałeczkami Yersinia enterocolitica może być prowadzona metodami serologicznymi. Jedną z nich jest test immunoblottingu wykrywający prze­ciwciała klas IgA i IgG dla różnych białek YOP tego drobnoustroju. Potrzeba poszukiwania pałeczek Yersinia w różnych materiałach (woda, gleba) do celów epidemiologicznych oraz trudności identyfikacyjne w obrębie rodzaju Yersinia zachęcają do wdrażania innych metod diagnostycznych. Poszukuje się odpowiednio swoistych sekwencji DNA poszczególnych gatunków pozwalających ma powielenie w PCR i zidentyfikowanie DNA. Dla Yersinia enterocolitica proponuje się gen yadA, a dla Yersinia pseudotuberculosis sekwencję genu ypm. W celu poszukiwania Y. enterocolitica w żywności proponowania jest metoda hybrydyzacji DNA kolonii z sondami zawierającymi odpowiednie sekwencje chromosomalnego genu mv. W warunkach rutynowego laboratorium bakterie te są najczęściej pomijane lub gubione ze względu na fakt inkubacji podłoży agarowych z posianymi materiałami w temperaturze 37°C przez 24 h. Identyfikacja bakterii na podstawie właściwości biochemicznych powinna być potwierdzona testami serologicznymi (aglutynacja szkiełkowa, aglutynacja lateksowa lub DIF); szczególnie dotyczy to szczepów z gatunku Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica, dla których ważne jest również określenie serotypu odpowiedzialnego za zakażenia. W dochodzeniach epidemiologicznych jersiniozy (Y. enterocolitica) stosowane jest również typowanie bakteriofagowe.

Szczepy z gatunku Y. enterocolitica serotyp 3 (IA) i 9 (V) wytwarzają β-laktamazy pochodzenia chromosomalnego; są oporne na penicyliny (ampicilina i inne) i cefalosporyny I generacji. Oporność na ampicilinę odróżnia ten gatunek od Y. pseudotuberculosis, którego szczepy są zazwyczaj wrażliwe.

Pałeczka dżumy Yersinia pestis jest słabo reaktywna biochemicznie. Jej hodowla i identyfikacja nastręczają pewne trudności. Poszukuje się więc metodami serolo­gicznymi antygenu otoczkowego (glikoproteiny Fl) i ocenia chorobotwórczość pałeczek dla szczurów. Wykorzystuje się także jej wrażliwość na specyficzne bak­teriofagi.

Szczepy z gatunku Y. kristensenii rzadko są izolowane z próbek materiałów, takich jak: krew, kał i mocz. Szczepy z gatunku Y. ruckeri jak dotąd były izolowane tylko w Ameryce Pomocnej od pstrągów tęczowych; wywołują u nich chorobę „czerwonych ust".

Grupa KES (Rodzaje: Klebsiella, Enterobacter, Serratia)

Grupa KES łączy rodzaje o podobnym profilu biochemicznym. Dają one zbliżone wyniki większości prób wykorzystywanych w różnicowaniu rodzajów rodziny Enterobacteriaceae. Pałeczki tej grupy przeżywają w środowisku szpitalnym, bywają wielooporne i łatwo podlegają antybiotykowej selekcji, są częstą przyczyną zakażeń szpitalnych. Pałeczki 4 rodzajów (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Hafnia) tworzą tryb Klebsiellae; charakteryzują się hydrolizą mocznika w ciągu 48 h, brakiem indolu, H₂S i dezaminazy fenyloalaniny, wzrastają na podłożu Simmonsa i w KCN oraz wytwarzają acetoinę (VP + ).

Klebsiella

Pałeczki zazwyczaj tworzą śluzowe kolonie, nie wykazują ruchu i nie powodują dekarboksylacji ornityny. Z wyjątkiem K. oxytoca są indolo-ujemne. Szczepy z gatunku K. pneumoniae są najczęściej izolowane z materiałów od chorych; mogą wywoływać klasyczną postać pierwotnego zapalenia płuc. Częstość nosicielstwa K. pneumoniae w jamie nosowo-gardłowej u osób zdrowych waha się od 1 do 6%; natomiast u pacjentów hospitalizowanych częstość ta wynosi do 20% i więcej. Mogą wywoływać zapalenia płuc (zakażenia endogenne), zwłaszcza u osób z cukrzycą i alkoholików. Zapalenie płuc wywołane przez K. pneumoniae ma charakter destrukcyjny, przebiega ze zmianami martwiczymi oraz krwotokami, a także z produkcją gęstej, śluzowej plwociny o ceglastym zabarwieniu lub też plwociny galaretowatej (przypomina­jącej „galaretkę porzeczkową"). W ciężkich przypadkach mogą powstawać ropnie płuc, jamy w tkance płucnej, krwotoki; może pojawić się także krwioplucie. Bóle w klatce piersiowej występują u 80%; są one wynikiem zapalenia opłucnej. Bakterie z gatunku K. pneumoniae mogą wywoływać również zakażenia pozapłucne, np. enteritis i meningitis u niemowląt, zakażenia dróg moczowych (u dzieci i dorosłych) oraz posocznice. Wzrost częstości zakażeń wywoływanych przez K. pneumoniae, jaki nastąpił w ostatniej dekadzie, stanowi prawdopodobnie odzwierciedlenie zwiększenia liczby zakażeń u pacjentów z obniżoną odpornością oraz narastaniem oporności tych bakterii na antybiotyki. Praktycznie wszystkie szczepy Klebsiella izolowane od chorych zawierają czynnik R i są zwykle oporne na ampicylinę i karbenicylinę. Bakterie różnych gatunków rodzaju Klebsiella występują powszechnie w środowisku naturalnym oraz w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt; szczególnie dotyczy to K. planticola, K. terrigena i K. trevisanae. Pałeczki z gatunku K. ozaenae są rzadko izolowane; wywołują zanikowy (cuchnący) nieżyt nosa (ozena) lub ropne zapalenie błony śluzowej nosa. Pałeczki K. rhinoscleromatis wywołują ziarniniakowatą chorobę znaną jako twardziel (scleroma) (zapalenie błony śluzowej gardła, jamy nosa i zatok obocznych nosa). Na chorobotwórczość pałeczek z rodzaju Klebsiella składa się wiele czynników. Są to przede wszystkim cechy powierzchni komórek (białkowe receptory ściany, LPS, otoczka) odpowiedzialne za adhezję do komórek gospodarza oraz ochronę przed fagocytozą i odpowiedzią immunologiczną. Cechy te są zależne od wielkiego plazmidu występującego w ich komórkach, kodującego cechy śluzowego fenotypu oraz także zdolności wytwarzania sideroforu.

Klasyfikacja i znaczenie

Opisano 7 gatunków i podgatunków tego rodzaju. Najważniejsze znaczenie kliniczne - Polsce mają Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae - pałeczka zapalenia płuc (95% izolatów) oraz Klebsiella oxytoca. Bakterie te są florą przewodu pokarmowego człowieka, ale także oportunistycznymi patogenami. Mogą wywoływać groźne infek­cje: zapalenie płuc, zakażenia dróg moczowych i inne schorzenia. Są częstą przyczyną zakażeń szpitalnych szczególnie na oddziałach noworodkowych. Wieloantybiotykooporne szczepy tych gatunków łatwo selekcjonują się w szpitalach.

Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae i Klebsiella pneumoniae subsp. rhinoscleromatis od niedawna uznawane są za podgatunki K. pneumoniae. Wywołują schorzenia górnych dróg oddechowych o charakterystycznym obrazie klinicznym, ale, szczególnie w Polsce, są bardzo rzadko izolowane.

W wyniku badań filogenetycznych, w nowej taksonomii, w obrębie rodzaju Klebsiella pojawił się nowy gatunek: Klebsiella granulomatis, jako efekt reklasyfikacji dawnego Calymmatobacterium granulomatis. Fenotypowo jest on jednak różny od pałeczek jelitowych i dlatego został opisany w Rozdziale 8 wraz z innymi polimorficznymi małymi pałeczkami o dużych wymaganiach pokarmowych.

Wymagania wzrostowe i cechy hodowlane

Są to krótkie, bezrzęse pałeczki osłonięte grubą otoczką, wytwarzaną także w czasie hodowli na pożywkach. Można ją łatwo uwidocznić przez barwienie komórek i tła (metoda negatywno-pozytywna).

Cechą charakterystyczną kolonii jest ich „puchaty" lub śluzowy wygląd, szcze­gólnie wyraźnie objawiający się na podłożach zawierających węglowodany, a wynika­jący z wytwarzania otoczek. Otoczki Klebsiella mogą zawierać ponad 80 charakterys­tycznych antygenów K, co wykorzystywane jest do typowania serologicznego tych bakterii. Klebsiella należą do tych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, które fermentują laktozę. Większość wytwarza ureazę, a więc rozkłada mocznik. Różnicowanie między K. pneumoniae subsp. pneumoniae i K. oxytoca opiera się przede wszystkim na zdolności rozkładu tryptofanu do indolu przez K oxytoca. Ponadto K. pneumoniae subsp. pneumoniae rośnie i rozkłada glukozę w wyższych temperaturach (41°C i 44,5°C), K. oxytoca natomiast preferuje temperatury niższe (10°C i 41°C).

Enterobacter

W rodzaju tym aktualnie występuje 10 gatunków. Są ruchome i powodują dekarboksylację ornityny. Liczne szczepy wytwarzają otoczki. Gatunki E. aerogenes i E. cloacae są najczęściej izolowane z materiałów od chorych. Bakterie te występują powszechnie w wodzie, ściekach, glebie, warzywach. Stanowią część komensalnej flory przewodu pokarmowego. Mogą wywoływać: biegunki, zakażenia oportunistyczne dróg moczowych, oddechowych, zakażenia ran; czasami wywołują posocznice i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Posocznice mogą być spowodowane podaniem zanieczyszczonych płynów infuzyjnych. Dużą zjadliwość wykazują szczepy E. sakazakii; mogą być czynnikiem zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i posocznic u noworodków z wysoką (do 75%) śmiertelnością. Szczepy tego gatunku rosną w postaci szorstkich, jasnożółtych kolonii, zwłaszcza w temp. 25°C; nie fermentują sorbitolu w odróżnieniu od E. cloacae. Szczepy z gatunku E. gergoviae wywołują zakażenia dróg moczowych i oddechowych oraz bakteriemie i posocznice. Gatunek E. agglomerans wytwarzający żółty barwnik, reklasyfikowano do rodzaju Pantoea (P. agglomerans). Opisany nowy gatunek E. asburiae, wcześniej występował w rodzaju Erwinia. Gatunki takie, jak: E. amnigenes, E. intermedium, E. taylori, E. dissovens występują w środowisku naturalnym i jak dotąd rzadko były izolowane od ludzi (E. taylori).

Klasyfikacja i znaczenie kiniczne

Pałeczki rodzaju Enterobacter są szeroko rozpowszechnione w środowisku. Rodzaj obejmuje wiele gatunków, z których na uwagę zasługują te najczęściej izolowane z zakażeń oportunistycznych. Są to Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, En­terobacter sakazakii i Enterobacter gergoviae. Należy także wspomnieć o oportunis­tycznych pałeczkach Pantoea agglomerans, dawniej zaliczanych do rodzaju Entero­bacter. Rodzaj Pantoea też należy do rodziny Enterobacteriaceae.

E. cloacae i E. aerogenes są odpowiedzialne za około 10% bakteriemii wywoła­nych przez bakterie gramujemne. E. sakazakii jest izolowany z przypadków zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i posocznic u noworodków. Pałeczki z rodzaju Enterobacter wywołują zakażenia ran, zapalenia wsierdzia, zakażenia dróg moczowych, są częstą przyczyną zakażeń szpitalnych.

Identyfikacja i różnicowanie

Pałeczki Enterobacter są ruchliwe dzięki peritrychalnie umieszczonym rzęskom. Wiele szczepów wykazuje metabolizm węglowodanów związany z wytwarzaniem dużych ilości gazu. W obrębie rodzaju różnicowanie gatunków opiera się nie tylko na ce­chach biochemicznych, ale także na wytwarzaniu żółtego barwnika zabarwiającego kolonie. Barwnik ten szczególnie dobrze jest wytwarzany w temperaturze 25^oC. Cechą wyraźnie odróżniającą rodzaj Enterobacter od podobnego Klebsiella jest zdolność dekarboksylacji ornityny (u Klebsiella cecha jest ujemna) i ruchliwość Enterobacter (Klebsiella nie ma rzęsek).

Serratia

Większość pałeczek tego rodzaju to saprofity i komensale. Spośród kilkunastu dotych­czas opisanych gatunków istotne znaczenie kliniczne ma jedynie Serratia marcescens subsp. marcescens, pałeczka odpowiedzialna za zakażenia nabyte w szpitalu, w szcze­gólności dotyczące dróg moczowych, wsierdzia, ale także posocznice. Rozprzestrze­nianie się Serratia w obrębie oddziału wiąże się ze skażeniem sprzętu: cewników rurek do tracheotomii oraz roztworów, w tym także środków dezynfekcyjnych (np. chlorek benzalkoniowy) i płynów do mycia rąk. Zakażenia szpitalne mogą być także powodowane przez Serratia odorifera. Pałeczki rodzaju Serratia są dość drobne i ruchliwe dzięki peritrychalnie osa­dzonym rzęskom. Spośród pałeczek rodziny Enterobacteriaceae wyróżnia je zdolność wytwarzania lipazy, żelatynazy i DNazy. Bakterie z rodzaju Serratia wyróżniają się spośród innych bakterii z rodziny Enterobacteriaceae zdolnością do produkcji trzech enzymów hydrolitycznych: lipazy, żelatynazy i DNazy. Inne charakterystyczne cechy to oporność na kolistynę i cefalotynę.

Kolonie S. marcescensi S. rubidea wytwarzają czerwony barwnik; szczepy szpitalne mogą nie wytwarzać barwnika.

Od innych pałeczek tego rodzaju S. marcescens subsp. marcescens różni się brakiem zdolności fermentacji L-arabinozy i rafinozy. Gatunek ten nie rozkłada laktozy, podobnie jak wiele innych Serratia. Jednak S. rubidaea i wiele szczepów spośród S. odorifera fermentują laktozę. Wytwarzanie czerwonego barwnika (prodigiozyny) w temperaturze 25°C jest bardzo charakterystyczną cechą Serratia. Dotyczy ona jednak raczej niewielkiej liczby szczepów tego rodzaju w obrębie gatunków S. marcescens subsp. marcescens i S. rubidaea. Cechą charakterystyczną S. odorifera jest intensywny zapach nieobranych, gotowanych ziemniaków.

Gatunek S. marcescens jest najważniejszym spośród 9 występujących w tym rodzaju. Może wywoływać zapalenia płuc i posocznice u pacjentów z chorobami nowotworowymi poddawanych chemioterapii, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i biegunki u dzieci; większość zakażeń dotyczy pacjentów hospitalizowanych. Bakterie te wchodzą w skład flory komensalnej przewodu pokarmowego. Szczepy z gatunków S. liguefaciens i S. rubidea izolowane są znacznie rzadziej od pacjentów hospitalizowa­nych, głównie z plwociny, moczu, ran i krwi.

Szczepy z gatunku S. odorifera odznaczają się ostrym zapachem przypominającym zapach zgniłych warzyw lub stęchłej trawy. Inne gatunki, takie jak: S.fonticola, S.ficaria, S. grimesii, S. plymuthica i S. proteamaculans występują powszechnie w wodzie, glebie i na roślinach; rzadko izolowane są z materiałów od chorych hospitalizowanych.

Hafnia

Pałeczki tego rodzaju są podobne do Enterobacter, ale nie wykorzystują tak jak one cytrynianu i są laktozoujemne. Jedynym gatunkiem jest Hafnia alvei. Bakterie należące do jedynego gatunku tego rodzaju - H. alvei izolowano często z przypadków odmy śródściennej jelit (łac. pneumatosis cystoides intestinalis. Wykazuje podobne cechy do Enterobacter; różni się brakiem produkcji kwasów z laktozy, melibiozy, rafinozy, sacharozy, adonitolu, dulcytolu i inozytolu. Występuje w przewodzie pokarmowym u ludzi zdrowych. Wywołuje zakażenia oportunistyczne; szczepy są izolowane z ran, ropni, plwociny, moczu, krwi.

Rodzaje Proteus, Morganella, Providencia

Te trzy rodzaje tworzą tryb Proteae, charakteryzujący się takimi cechami, jak: H₂S( + ), MR( + ), VP(-), fenyloalanina( + ), wzrost KCN( + ), ureaza( + ) (szybko). Grupa ta obejmuje rodzaj Providencia oraz bardzo blisko ze sobą spokrewnione rodzaje Proteus i Morganella. Każdy z tych rodzajów zawiera gatunki o dużym zna­czeniu dla człowieka, a ich wspólne cechy to ruchliwość, wytwarzanie ureazy (więk­szość szczepów) oraz zdolność deaminacji fenyloalaniny.

Proteus

Obejmuje 4 gatunki: P. vulgaris, P. mirabilis, P. myxofaciens i P. penneri. Bakterie tego rodzaju występują w glebie, wodzie i materiałach zanieczyszczonych kałem; mogą wchodzić w skład flory komensalnej przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt. Gatunek P. mirabilis (indolo-ujemny) jest najczęściej izolowanym gatunkiem od ludzi; często wywołuje zakażenia dróg moczowych i zakażenia ran. Bakterie gatunku P. vulgaris są indolo-dodatnie; częściej izolowane są z materiałów od pacjentów z obniżoną odpornością, zwłaszcza leczonych antybiotykami przez dłuższy czas. Szczepy z gatunków P. penneri opisane ostatnio, podobnie jak P. mirabilis, uczestniczą głównie w zakażeniach dróg moczowych. Sporadycznie tylko z materiałów od chorych izolowane były szczepy P. myxofaciens.

Klasyfikacja i znaczenie kliniczne

Spośród dotychczas opisanych gatunków znaczenie kliniczne mają Proteus mirabilis. Proteus vulgaris i Proteus penneri. Wszystkie spotyka się w przewodzie pokarmowym człowieka i wielu zwierząt, są też obecne w nawozie, glebie, mogą być izolowane ze skażonej wody. Jako flora przewodu pokarmowego i z przypadków klinicznych naj­częściej izolowany jest Proteus mirabilis. Zakażenia wywoływane przez pałeczki Pro­teus to głównie zakażenia układu moczowego, a także zakażenia wtórne, na przykład ran pooparzeniowych. Zakażenia szczepami szpitalnymi związane są przeważnie z częstym lub długotrwałym cewnikowaniem dróg moczowych. Chorobotwórczość pałeczek Proteus zależy w dużej mierze od ich aktywnego wytwarzania ureazy. W drogach moczowych uwalnia ona z mocznika znaczne ilości amoniaku, uszkadzającego nabłonek i alkalizującego mocz, co prowadzi do powsta­wania złogów soli i tworzenia kamieni moczowych w nerkach i pęcherzu. Pałeczki Proteus mogą przeżywać wewnątrz tworzonych kamieni. Tworzenie złogów szczególnie nie jest udziałem Proteus mirabilis. Pałeczki te charakteryzuje bardzo krótki czas generacji (szybkie namnażanie). Chociaż obecność fimbrii na ogół wzmaga adhezję bakterii do nabłonka, w przypadku Proteus uważa się, że ich liczna obecność może zmniejszać chorobotwórczość, gdyż wzmacnia obronny proces fagocytozy. Ponadto bakterie te wytwarzają proteazy rozkładające przeciwciała IgA i IgG oraz składniki dopełniacza. Wytwarzają też hemolizyny. Proteus vulgaris i Proteus penneri syntetyzują zewnątrzkomórkową hemolizynę podobną do hemolizynyHlyAE.coli.

Morfologia, identyfikacja, różnicowanie w obrębie rodzaju Proteus

Charakterystyczną cechą występującą u pałeczek tego rodzaju jest zdolność aktyw­nego ruchu, widocznego na podłożach stałych (np. płytka agarowa), który określa się mianem wzrostu rozpełzliwego lub mgławicowego. W preparacie mikroskopowym i takiej hodowli widoczne są długie komórki (ang. swarmer cells). Komórki te są silnie urzęsione. Przeniesione do podłoża płynnego błyskawicznie rozpadają się do krótkich pałeczek (ang. swimmer cells).

Pałeczki z rodzaju Proteus nie rozkładają laktozy. P. mirabilis, P. vulgaris i 30% szczepów P. penneri wytwarzają siarkowodór. Gatunek P. mirabilis różni się od P. penneri i P. vulgaris zdolnością dekarboksylacji ornityny, a także brakiem zdolności fermentowania maltozy. Jest też w odróżnieniu od Proteus vulgaris natural­nie wrażliwy na ampicylinę i cefalosporyny. Cechą odróżniającą rodzaj Proteus od Morganella i Providencia jest przede wszystkim jego niezwykła ruchliwość. Rodzaje te różnią także niektóre właściwości biochemiczne.

Morganella

Pałeczki tego rodzaju mają znaczenie kliniczne przede wszystkim u pacjentów hospitalizowanych. Mogą powodować u nich zakażenia dróg moczowych i posocz­nice. Oba podgatunki jedynego gatunku tego rodzaju: Morganella morganii subsp. morganii i Morganella morganii subsp. sibonii odróżniane są od siebie na podstawie fermentacji trehalozy. Jest to cecha drugiego z nich. Oba rozkładają mocznik. Od innych rodzajów grupy Proteus odróżniają je właściwości biochemiczne: nie wytwa­rzają H₂S, dekarboksylują ornitynę i rozkładają mannozę. Odpowiedzialne są głównie za zakażenia dróg moczowych, zakażenia ran i biegunki.

Providencia

Opisano pięć gatunków rodzaju Providencia. Są powszechnie spotykane w kale ludzi i zwierząt. Największe znaczenie kliniczne mają Providencia alcalifaciens, Providencia stuartii i Providencia rettgeri, P. rustigianii (wcześniej znany jako P. alcalifaciens, grupa 3). Tylko P. rettgeri rozkłada mocznik (ureaza +). Przy czym zakażenia przez nie powodo­wane, podobnie jak w przypadku rodzaju Morganella, dotyczą przede wszystkim pacjentów w szpitalach. Wywołują je szczepy szpitalne, szeroko oporne na anty­biotyki. Wszystkie gatunki deaminują fenyloalaninę, ale tylko P. rettgeri i 30% szczepów P. stuartii wytwarzają ureazę. Trzy klinicznie najważniejsze gatunki Providencia można odróżnić od siebie na podstawie zdolności fermentowania cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych. Uczestniczą głównie w zakażeniach dróg moczowych nabywanych w szpitalach; opisano kilka epidemii zakażeń szpitalnych. Występują w kale. Szczepy z gatunku P. alcalifaciens mogą powodować biegunki, zwykle u dzieci.

Inne rodzaje

W ostatniej dekadzie opisano kilkanaście nowych rodzajów rodziny Enterobacteriaceae: Cedecea, Tatumella, Kluyvera, Obesumbacterium, Rahnella, Xenorhabdus, Moellerella, Ewingella, Budvicia, Buttiauxella, Koserella, Leminorella i Pantoea. Niektóre z nich uczestniczą częściej w oportunistycznych zakażeniach szpitalnych pochodzenia egzogennego i endogennego; głównie Kluyvera, Pantoea, Ewingella.

Uważa się, że około 95% szczepów z rodziny Enterobacteriaceae wykrywanych w próbkach materiałów od chorych w laboratoriach mikrobiologicznych należy do gatunków E. coli, K. pneumoniae i P. mirabilis; 99% szczepów należy jedynie do 23 gatunków, natomiast tylko 1% - do gatunków niedawno odkrytych. Nowe rodzaje zostały włączone do większości identyfikacyjnych systemów kom­puterowych.

Cedecea

Pałeczki Cedecea izolowano z przypadków bakteriemii. Opisano trzy gatunki. Wiele szczepów pod względem biochemicznym przypomina Serratia, ale nie wytwa­rzają DNazy ani żelatynazy.

Kluyvera

Pałeczki Kluyvera mogą wywoływać zakażenia dróg moczowych, a także tkanek miękkich. Należy je różnicować z E. coli, do których są podobne, ale w odróżnieniu od nich wykorzystują cytrynian.

Erwinia

Bakterie te są chorobotwórcze dla roślin. Fermentują glukozę z wytworzeniem kwasu ale bez gazu. Tworzą suche kolonie, często z żółtym barwnikiem, nie powodują dekarboksylacji lizyny i ornityny, nie mają aktywności dwuhydrolazy argininy. W rodza­ju wyróżnia się 15 gatunków; niektóre z nich wykrywane są w materiałach pochodzących od ludzi. Mogą wywoływać zakażenia oportunistyczne; głównie dotyczy to E. amylovora, E. salicis oraz E. herbicola. Gatunek E. herbicola ostatnio został reklasyfikowany do nowego rodzaju Pantoea (1989) i uzyskał nazwę gatunkową Pantoea dispersa; od­powiedzialny jest za liczne przypadki posocznic występujących u pacjentów hos­pitalizowanych, niekiedy po przetoczeniu zanieczyszczonych płynów.

Edwardsiella

W rodzaju Edwardsiella jeden z czterech opisanych - gatunek E. tarda ma znaczenie kliniczne. Izolowany był z przypadków infekcji jelitowych w krajach subtropikalnych. Pałeczka ta wytwarza znaczne ilości H₂S, co upodobnia ją do Salmonella, ale nie wykorzystuje cytrynianu i ta cecha pomaga w jej różnicowaniu. Gatunek E. tarda wykazuje właściwości biochemiczne podobne do E. coli. Z uwagi na wytwarzanie H₂S i brak rozkładu laktozy może przypominać gatunek C. freundii lub S. enterica. Szczepy z gatunku E. tarda mogą być czynnikami etiologicznymi zakażeń jelitowych oraz różnych zakażeń pozajelitowych; mogą wywoływać zakażenia ran, ropnie wątroby. Inny gatunek tego rodzaju - E. hoshinae występuje u ptaków, gadów i w wodzie oraz w kale u ludzi. Trzeci gatunek - E. ictaluri - wykryty jak dotąd u ryb.

Citrobacter

Pałeczki Citrobacter stanowią florę jelitową zdrowych ludzi. Poza jelitem są to bakterie oportunistyczne wywołujące najczęściej zakażenia dróg moczowych i ukła­du oddechowego. Mogą osiągać szeroki zakres oporności na antybiotyki i wywoły­wać infekcje szpitalne. Rodzaj obejmuje już dwanaście gatunków, z których najczęściej izolowane są Citrobacter freundii, Citrobacter diversus (syn. Citrobacter koseri) i Citrobacter amalonaticus. Pałeczki tego rodzaju są ruchliwe i laktozododatnie, mogą jednak fermen­tować ten cukier z opóźnieniem, co sprawia, że bywają fałszywie klasyfikowane jako Salmonella. Mimo wielu podobieństw biochemicznych do Salmonella, w prze­ciwieństwie do większości jej gatunków, pałeczki Citrobacter nie dekarboksylują lizyny. Szczepy z gatunku C. diversus nie rosną w KCN (wybiórcze podłoże hodowlane, sprawdzające wrażliwość drobnoustrojów na cyjanek potasu) i wykazują zdolność fermentacji adonitolu, w odróżnieniu od dwóch pozostałych gatunków. Gatunek C. amalonaticus nie rozkłada malonianu. Cechami pozwalającymi na różnicowanie C. freundii i Salmonella enterica ssp. enterica (większość serotypów chorobotwórczych dla człowieka) są: wzrost w obecności KCN (Salmonella nie rosną), brak dekarboksylazy lizyny oraz produkcja ortonitrofenylgalaktozydu. Bakterie z rodza­ju Citrobacter izolowane są z próbek kału od ludzi zdrowych oraz od chorych z biegunką (C. freundii). Mogą być przyczyną zakażeń pozajelitowych; C. diversus może wywoływać zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych oraz ropnie mózgu u noworodków, a C. amalo­naticus bywa przyczyną bakteriemii i posocznic. Zakażenia ośrodkowego układu nerwowego wywoływane są często przez C. diversus w skojarzeniu z beztlenowymi pałeczkami Gram-ujemnymi z gatunku Bacteroides melaninogenicus (obecnie Prevotella melaninogenica).

28

---