ĆWICZENIE 3

ROZDZIELANIE I OCZYSZCZANIE SUBSTANCJI

METODĄ CHROMATOGRAFII

ODCZYNNIKI

- 0,5 molowe roztwory soli miedzi, niklu, kobaltu, cynku, żelaza (III),

- stężony amoniak,

- nasycone roztwory alkoholowe kwasu rubeanowodorowego, dwumetyloglioksymu,

- 0,5 molowy wodny r-r K₄[Fe(CN)₆],

- aceton,

- kwas solny.

SPRZĘT LABORATORYJNY

- komora chromatograficzna,

- szalki Petriego,

- krystalizator,

- płytki szklane,

- bibuła,

- rozpylacz.

1. CEL ĆWICZENIA:

1. Zapoznanie się z techniką chromatografii.

2. Zastosowanie chromatografii bibułowej do rozdziału i identyfikacji jonów metali.

2. WSTĘP TEORETYCZNY:

Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników mieszaniny. Metoda chromatograficzna oparta jest na wykorzystaniu różnic prędkości migracji rozdzielanych składników względem dwóch faz. Jedną fazę stanowi nieruchoma warstwa substancji o rozwiniętej powierzchni (faza nieruchoma), drugą - przepływający przez nią strumień gazu lub cieczy (faza ruchoma). Substancje rozpuszczone migrują przez fazę stacjonarną z szybkościami określanymi przez ich powinowactwo do każdej fazy. Każdą substancję charakteryzują określone parametry retencji.

Istnieje bardzo wiele rodzajów chromatografii:

RODZAJ CHROMATOGRAFII	FAZA STACJONARNA	FAZA RUCHOMA
Chromatografia bibułowa (PC)	Bibuła (celuloza)	Ciekła
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)	Krzemionka, celuloza, żywica jonowymienna, ciało stałe o regulowanej porowatości	Ciekła
Chromatografia gazowa (GC)	Ciekła lub stała	Gazowa
Chromatografia cieczowa (LC)	Stała, lub faza związana, ciało stałe o kontrolowanej porowatości	Ciekła
Chromatografia jonowymienna (IEC)	Żywica jonowymienna ciekła, lub faza związana	Ciekła

Do najprostszych metod chromatograficznych należą metody stosujące jako fazę nieruchomą bibułę (chromatografia bibułowa - Paper Chromatography - PC) lub płytkę pokrytą warstwą sorbentu (chromatografia cienkowarstwowa - Thin Layer Chromatography - TLC).

Chromatografia bibułowa jest specjalną metodą rozdziału mikrochemicznego. Jako fazę ruchomą (eluent) wykorzystuje się mieszaniny rozpuszczalników. Jednym ze składników mieszaniny jest prawie zawsze woda. Faza wodna jest związana z obojętnym nośnikiem, jakim jest bibuła chromatograficzna. Podstawowymi technikami pracy są metody wstępujące, zstępujące i planarne, w tym metoda chromatografii krążkowej.

W metodzie wstępującej faza ruchoma porusza się dzięki własnościom kapilarnym w kierunku przeciwnym do sił ciężkości, podczas gdy w metodzie zstępującej faza ruchoma zstępuje do dołu.

Rysunek 1. Metoda wstępująca chromatografii bibułowej

Rysunek 2. Metoda zstępująca chromatografii bibułowej

W metodzie krążkowej eluent jest zasysany na środek kawałka bibuły filtracyjnej, wyciętego w postaci koła. Faza ruchoma rozprzestrzenia się w kierunku od środka krążka na wszystkie strony ku jego brzegom. Badaną substancję nanosi się punktowo w odległości 1-2 cm od środka krążka. Jako naczynie stosuje się odpowiednio duże szalki Petriego.

Szybkość migracji substancji na chromatografie zależy przede wszystkim od stosunku podziału pomiędzy obie fazy. Do charakterystyki substancji używa się wartości R_f (współczynnik retencji). Wartości współczynnika retencji zależą zarówno od stosunku podziału substancji pomiędzy fazę ruchomą i stacjonarną. Niezależne są (w pierwszym przybliżeniu) od użytej substancji.

Wartość R_f określa się praktycznie jako stosunek odległości x (równej przesunięciu się środka plamki od miejsca startu) do odległości y (równej przesunięciu się czoła rozpuszczalnika) w sposób przedstawiony na rys. 2.

Rys. 2. Wyznaczanie współczynnika retencji R_f = x/y

Metodą pokrewną do chromatografii bibułowej jest chromatografia cienkowarstwowa. Fazę stacjonarną stanowi tutaj sproszkowany sorbent naniesiony cienką warstwą na płytkę (szklaną, plastikową lub aluminiową). Substancje rozpuszczone migrują przez fazę stacjonarną z szybkościami zdeterminowanymi ich stosunkami podziału. Substancje o największym stosunku podziału poruszają się jako ostatnie (jeśli w ogóle), natomiast substancje o najmniejszych stosunkach podziału poruszają się razem z czołem fazy ruchomej. Ten rodzaj chromatografii stosowany jest przede wszystkim jako jakościowa technika analityczna do identyfikacji substancji organicznych i nieorganicznych w wyniku porównania próbek z jednocześnie chromatografowanymi wzorcami.

Fazy stacjonarne (sorbenty) w chromatografii cienkowarstwowej

SORBENT	MECHANIZM SORPCJI	ROZDZIELANE SUBSTANCJE
Żele krzemionkowe	Adsorpcja	Aminokwasy, węglowodory, alkaloidy, witaminy
Krzemionka modyfikowana weglowodorami	Zmodyfikowany podział	Związki niepolarne
Proszek celulozowy	Podział	Aminokwasy, nukleotydy, węglowodany
Tlenek glinu	Adsorpcja	Węglowodory, alkaloidy, barwniki spożywcze, lipidy, jony metali
Ziemia okrzemkowa	Podział	Cukry, kwasy tłuszczowe
Celuloza jonowymienna	Wymiana jonowa	Kwasy nukleinowe, nukleotydy, halogenki, jony metali
Żel Sephadex	Wykluczanie	Polimery, białka, kompleksy metali
β-cyklodekstryny	Oddziaływania stereoadsorpcyjne	Mieszaniny enancjomerów

Eksperyment chromatografii cienkowarstwowej wymaga nie zaburzonego (laminarnego) przepływu eluentu (rozwijanie chromatogramu). Aby taki warunek był spełniony, w komorze chromatograficznej nie może dochodzić do parowania eluentu z fazy stałej. Dlatego komorę chromatograficzną nasyca się parami eluentu przed rozpoczęciem rozwijania chromatogramu.

Chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa używane są w celach identyfikacji związków chemicznych, czyli jako metoda jakościowa. Czasami stosuje się chromatografię cienkowarstwową na skalę preparatywną, w celu rozdziału małych ilości związków.

Do rozdziału i oczyszczania substancji na dużą skalę (na skalę ilościową - ilości od 0,1 g wzwyż, aż do skali technicznej, w ilościach kilogramowych) stosuje się chromatografię kolumnową.

Proces rozdziału odbywa się na tej samej zasadzie podziału, co omówione poprzednio; fazę stałą (nieruchomą) stanowi złoże chromatograficzne (zwykle silikażel - SiO₂ lub alumina - Al₂O₃) umieszczone w rurze szklanej (lub na skalę techniczną - stalowej). Faza stała jest zawieszona w eluencie, który po otwarciu zaworu A (rysunek 4) przepływa przez kolumnę, wymywając substancje rozdzielane. Roztwory poszczególnych składników mieszaniny (frakcje) są odbierane (czasami z użyciem automatycznie przesuwającego się kolektora frakcji). Chromatografia kolumnowa jest powszechnie używana do oczyszczania i rozdziału związków organicznych oraz białek i kwasów nukleinowych.

Rys. 4. Schematyczne przedstawienie chromatografii kolumnowej.

3. WYKONANIE ĆWICZENIA

A). Wyznaczyć współczynniki retencji (R_f) dla jonów Cu²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, Fe³⁺ metodą wstępującą.

Nakreślić ołówkiem linię startową na przygotowanym pasku bibuły (ok. 2cm od brzegu bibuły). Nanieść próbki badanych jonów na zaznaczone punkty startowe. Punkt startowy winien mieć możliwie małą średnicę (max 2 mm). Przygotować eluent i umieścić go w komorze chromatograficznej (skład eluentu: 9 ml acetonu, 5 ml stężonego kwasu solnego, 5 ml wody). Bibułę wysuszyć, a następnie zawiesić w komorze chromatograficznej wstępnie nasyconej parami eluentu. Rozwijanie chromatografu jest zakończone wtedy, gdy czoło eluentu podniesie się na pasku bibuły na wysokość ok. 10-12 cm od miejsca naniesienia kropli. Wyjąć bibułę z komory, zaznaczyć ołówkiem linię mety i wysuszyć na powietrzu. Następnie nasycić parami amoniaku. Po kilku minutach nasycania wyjąć pasek i spryskać nasyconym alkoholowym roztworem kwasu rubeanowodorowego.

Określić kolory dla poszczególnych związków metali oraz obliczyć współczynniki retencji.

B). Analiza jonów w nieznanej próbce metodą krążkową.

Krążek bibuły dociąć do wielkości szalki Petriego. Zakreślić na środku bibuły okrąg o promieniu ok. 0,5 cm. Na tym obwodzie zaznaczyć ołówkiem symetrycznie 4 punkty startowe. Do środka krążka wzdłuż promienia koła wyciąć pasek szerokości 5 mm. Pasek zagiąć i przyciąć tak, aby sięgał dna szalki. Do dolnej płytki wlać ok. 3 mm eluentu. Na punkty startowe nanieść roztwór analizowany (średnica plamki nie powinna być większa niż 3 mm). Wysuszony krążek położyć centrycznie na dolnej płytce, tak, aby nóżka zanurzona była w eluencie. Zamknąć komorę chromatograficzną drugą (większą) szalką Petriego. Rozwijanie chromatografu jest zakończone, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do krawędzi krążka na odległość ok. 1 cm. Wyjąć krążek, zaznaczyć ołówkiem linię mety, wysuszyć. Nasycić parami amoniaku. Po kilkunastu minutach nasycania rozciąć chromatograf na cztery części i każdą wywołać w innym wywoływaczu (kwas rubeanowodorowy, dwumetyloglioksym, K₄[Fe(CN)₆]).

4. OPRACOWANIE WYNIKÓW

Wyniki opracować zgodnie ze wzorem sprawozdania i wytycznymi prowadzącego.

Literatura

1. Minczewski J., Marzenko Z., Chemia analityczna, t.I, PWN, Warszawa 2004.

2. Lipiec T., Szmal Z.S., Chemia analityczna z elementami analizy instrumentalnej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1996.

3. Ćwiczenia laboratoryjne z chemii ogólnej i nieorganicznej, praca zbiorowa pod redakcją E. Uhlemana, PWN, Warszawa 1977.

4. Kealey D., Haines P.J., Chemia analityczna, seria krótkie wykłady, PWN, Warszawa 2005.

6

---