Ekotoksykologia

Ekotoksykologia -wprowadzenie

Termin „ekotoksykologia” został po raz pierwszy powszechnie użyty i przez to wprowadzony do potocznego języka przez Truhauta w 1969r. Wyraz ten został skonstruowany z dwóch słów: „ekologia” i „toksykologia”, a jego wprowadzenie odzwierciedlało rosnące zainteresowanie skutkami obecnych w środowisku związków chemicznych dla organizmów innych niż człowiek. Pozwoliło to na skoncentrowaniu badań na szkodliwych skutkach oddziaływania związków chemicznych (toksykologia) w kontekście ekologicznym. Dotychczas przedmiot toksykologia środowiska zasadniczo dotyczył szkodliwych skutków substancji chemicznych obecnych w środowisku dla człowieka, np. skutki zadymienia obszarów miejskich, toksycznego oddziaływania metali ciężkich itp. Natomiast toksykologia środowiska, w najszerszym tego słowa znaczeniu, obejmuje skutki działania czynników chemicznych zarówno w ekosystemach, jak i u człowieka. Ekotoksykologia jest więc dyscyplina naukową realizowaną w ramach szerszego pola toksykologii środowiska.

Rys.1 Schemat - zależności powiązań między reakcjami zachodzącymi na różnych poziomach organizacji.

. W ujęciu najprostszym ekotoksykologię można zdefiniować jako: „badanie szkodliwych skutków działania związków chemicznych dla ekosystemów”, co rozumieć należy jako bezpośrednie zmiany w organizmach, jak również wynikające z nich konsekwencje na poziomie populacji i wyższym. Interesującą cechą ekotoksykologii jest fakt, że reprezentuje ona podejście badawcze „od cząsteczek do ekosystemów” w myśl podejścia sformułowanego przez Clarke'a (1975) „od genów do fizjologii”. Takie podejście pozwala na ocenę  i w konsekwencji całego ekosystemu. Podczas gdy tradycyjna toksykologia zajmuje się toksycznością związków chemicznych wobec poszczególnych organizmów, ekotoksykolodzy są szczególnie zainteresowani skutkami oddziaływań na różnych poziomach organizacji

Skutkami na poziomie populacji mogą być zmiany w liczebności osobników, zmiany częstości występowania określonego genu (zjawisko oporności) lub tez zmiany w funkcjonowaniu całego ekosystemu (obieg pierwiastków w glebie). Opisane powyżej zmiany mogą być w większym stopniu rezultatem oddziaływań subletalnych (np. zmiany fizjologiczne lub behawioralne), niż toksyczności letalnej. Czasami zmiany takie mogą być również skutkiem pośrednim , jak w przypadku zmniejszenia liczby drapieżników spowodowane bezpośrednim oddziaływaniem substancji toksycznej na jego ofiary.

Głównym zadaniem toksykologii i ekotoksykologii jest określenie zależności pomiędzy ilością związku chemicznego, na działanie którego organizm jest narażony, a rodzajem i stopniem szkodliwych, toksycznych następstwem będących wynikiem tej ekspozycji. Zależność pomiędzy dawką a odpowiedzią organizmu daje podstawę do oceny zagrożeń (hazards) i ryzyka (risk) powodowanego przez substancje zanieczyszczające środowisko. W myśl słów Paracelsusa: „Dawka czyni truciznę”, żaden związek chemiczny nie jest trucizną, jeśli dawka jest zbyt mała, natomiast wszystkie związki chemiczne są trujące, jeżeli dawka jest wystarczająco duża.

Testy ekotoksykologiczne

Początki laboratoryjnych testów toksyczności sięgają czasów przed II wojną światową, kiedy badania prowadzono tzw. metodą "ryba w słoiku". Obecnie opracowanych jest wiele testów toksykologicznych z udziałem wielu gatunków, od roślin poprzez bezkręgowce do drapieżników kończących łańcuch pokarmowy. Ze względów praktycznych możliwe jest przeprowadzenie testów toksyczności tylko na ograniczonej liczbie gatunków, można również prowadzić stałą hodowlę organizmów testowych (bioindykatorów), co oczywiście pociąga za sobą odpowiednie koszty inwestycyjne i eksploatacyjne. Dlatego też obecnie coraz częściej przeprowadza się gotowe testy zawierające bioindykatory w formie kryptobiotycznej ze standardowej hodowli.

Kryteria przydatności testów toksykologicznych:

1. Wynik testu powinien dawać odpowiedź na pytanie z zakresu oceny ryzyka ekologicznego.

2. Powinna istnieć możliwość ekstrapolacji wyników na inne organizmy testowe i całe ekosystemy;

3. Test powinien być dobrany z uwzględnieniem „wrażliwość” organizmów testowych.

4. Test powinien być prosty w wykonaniu i powinna istnieć możliwość standaryzacji uzyskanych wyników.

5. Wyniki testu powinny być jednoznaczne i powtarzalne.

Istnieje wiele sposobów jakimi można dokonać pomiaru toksyczności. Jednym z kryteriów podziału testów toksykologicznych jest mierzalny efekt końcowy, którym mogą być zarówno obserwowalne zmiany biochemiczne, fizjologiczne, wpływ na rozmażanie czy zachowanie organizmów testowych. Najczęściej stosowaną miarą (mierzalnym efektem końcowym „end-point”) jest śmierć organizmu testowego.

Podział testów z uwagi na obserwowalny efekt:

• TESTY PRZEŻYWALNOŚCI polegające na oznaczaniu dawki śmiertelnej z zastosowaniem wybranych organizmów (głównie organizmów wodnych).

• TESTY WZROSTOWE dotyczące oceny hamowania wzrostu bakterii, grzybów lub glonów w obecności związków toksycznych.

• TESTY ENZYMATYCZNE polegające na określeniu stopnia hamowania aktywności jednego enzymu lub grupy enzymów katalizujących określoną reakcję enzymatyczną.

• TESTY GENOTOKSYCZNOŚCI (mutagenności).

• TESTY BIOAKUMULACJI polegające na ocenie stopnia nagromadzenie substancji chemicznej w tkankach i narządach organizmów.

Podział badań ekotoksykologicznych

1. W zależności od miejsca wykonania:

• laboratoryjne;

• polowe;

• pół-polowe;

2. W zależności od czasu trwania:

• krótkoterminowe (ostre)- Badające szkodliwe zmiany w organizmach testowych wywołane oddziaływaniem związku chemicznego w krótkim czasie ekspozycji do 96h, które mogą prowadzić do zaburzeń czynności fizjologicznych i śmierci. Najczęściej jako wynik oznaczenia podaje się wartość LC(EC)₅₀.

• długoterminowe (chroniczne)- Badające szkodliwe zmiany w organizmach testowych wywołane oddziaływaniem związku chemicznego w dłuższym czasie - na ogół od 1/10 cyklu życiowego do uzyskania pierwszego pokolenia potomstwa. W testach stosowane są niższe niż śmiertelne stężenia substancji (subletalnej). Obserwacje polegają na ocenie zmian aktywności fizjologicznej np. pokarmowej, rozrodczej, zaburzeń genetycznych i zakłóceń
  w funkcjonowaniu narządów. Jako wynik oznaczenia podaje się wartość NOEC, LOEC.

W zależności od liczby gatunków:

• jednogatunkowe;

• wielogatunkowe;

Wyniki testów ekotoksykologicznych

Oceną zależności pomiędzy dawką, a efektem wywołanym działaniem badanego ksenobiotyku zajmuje się toksykometria. Jeżeli jest to możliwe, reakcję organizmu na podaną toksynę określa się ilościowo, na podstawie przeprowadzonych badań. Zależność efektu od dawki może być wówczas przedstawiona za pomocą równania matematycznego: f(D) = aD + b , a wykres zależności przyjmuje wówczas postać liniową.

Najczęściej jednak reakcje organizmu na działanie ksenobiotyku można opisywać wyłącznie jakościowo. Oznacza to, że obserwuje się wystąpienie reakcji/lub całkowity brak reakcji, bez stanów pośrednich. Tego typu efekty (np. śmierć, unieruchomienie, itp.) nazywa się jednostkowymi lub kwantalnymi. Natężenie reakcji kwantalnej bada się nie u jednego osobnika, ale wśród pewnej populacji zwierząt i wyraża się w procentach osobników populacji, u których zaobserwowano efekt działania określonej dawki toksyny. Natężenie to wyraża zależność „dawka - odpowiedź”, która przyjmuje postać krzywej sigmoidalnej.

Testy toksykologiczne pozwalają na szacowanie wielkość dawki (ewentualnie stężenia w pokarmie, wodzie czy powietrzu), które może wywołać odpowiedź toksyczną na poziomie np. 50%, tj. medianie dawki letalnej, czyli takiej, która spowoduje śmierć 50% populacji. Popularne jest także szacowanie największego stężenia/dawki, które nie wywołuje żadnego efektu.

Wskaźniki ekotoksykologiczne:

LC₅₀ (LD₅₀)- (ang. lethal concentration, lethal dose) - mediana stężenia śmiertelnego. Wartość LC₅₀ oznacza takie stężenie związku, które powoduje śmierć połowy populacji gatunku organizmów testowych po odpowiednim czasie ekspozycji;

EC₅₀(ED₅₀)- (ang. effect concentration, effect dose) -Wartość EC₅₀ oznacza takie stężenie związku, które powoduje określony efekt (spadek aktywności, reprodukcji itp.) u połowy populacji gatunku organizmów testowych, po odpowiednim czasie ekspozycji;

NOEC (NOED) - (ang. no observed effect concentration (dose)) - najwyższe stężenie (dawka) toksykanta, które w określonym czasie trwania badań nie powoduje żadnych spostrzegalnych zmian w organizmach testowych.


LOEC (LOED) - (ang. lowest observed effect concentration) - najniższe stężenie toksykanta, które w określonym czasie trwania badań toksyczności chronicznej lub subchronicznej wywołuje zmiany w organizmach testowych

Wyznaczanie wartości wskaźników ekotoksykologicznych






Tabela 1 Zamiana efektu toksycznego [%] na jednostkę probitową

%	PROBITY	%	PROBITY	%	PROBITY	%	PROBITY
0,2	2,122	21	4,194	51	5,025	82	5,915
0,4	2,348	22	4,228	52	5,050	83	5,954
0,6	2,488	23	4,261	53	5,075	84	5,994
0,8	2,591	24	4,294	54	5,100	85	6,036
1,0	2,574	25	4,326	55	5,126	86	6,080
1,2	2,743	26	4,357	56	5,151	87	6,126
1,4	2,803	27	4,387	57	5,176	88	6,175
1,6	2,856	28	4,417	58	5,202	89	6,227
1,8	2,903	29	4,447	59	5,228	90	6,282
2,0	2,946	30	4,476	60	5,235	91	6,341
2,5	3,040	31	4,504	61	5,278	92	6,405
3,0	3,123	32	4,532	62	5,305	93	6,476
3,5	3,188	33	4,560	63	5,332	94	6,555
4,0	3,249	34	4,588	64	5,358	95	6,645
4,5	3,305	35	4,615	65	5,385	95,5	6,695
5,0	3,355	36	4,642	66	5,412	96	6,751
6,0	3,445	37	4,668	67	5,440	96,5	6,812
7,0	3,524	38	4,695	68	5,468	97	6,881
8,0	3,595	39	4,722	69	5,496	97,5	6,960
9,0	3,659	40	4,747	70	5,524	98	7,054
10	3,718	41	4,772	71	5,553	98,2	7,096
11	3,773	42	4,798	72	5,583	98,4	7,144
12	3,825	43	4,824	73	5,613	98,6	7,197
13	3,874	44	4,849	74	5,643	98,8	7,257
14	3,920	45	4,874	75	5,674	99	7,326
15	3,964	46	4,900	76	5,706	99,2	7,409
16	4,006	47	4,925	77	5,739	99,4	7,512
17	4,046	48	4,950	78	5,772	99,6	7,652
18	4,085	49	4,975	79	5,806	99,8	7,878
19	4,122	50	5,000	80	5,842
20	4,158			81	5,878

Analiza statystyczna

• Wartość średnia

Wartość średnią z pomiarów wyznaczyć korzystając ze wzoru:


(8)

gdzie:

x_i- wynik i-tego pomiaru, i=1,2,...,n,

n- liczebność próby.

• Odchylenie standardowe


(9)

gdzie:

x_i- wynik i-tego pomiaru, i=1,2,...,n,

n- liczebność próby,


- wartość średnia.

Procedura doboru testu istotności różnic pomiędzy średnimi

• 
  

• Test t-Dunnetta

Statystykę t-Dunnetta obliczyć w oparciu o następujące wzory :


(10)


(11)


(12)


Istotna różnica
(13)

gdzie:

v- stopnie swobody,

T- liczba kombinacji,

N- liczba pomiarów w każdej kombinacji,


suma kwadratów pomiarów,


liczba pomiarów w każdym powtórzeniu
suma kwadratów ze średniej,

t- wartość wzięta z tablic Dunnetta (zał.1),

SE- błąd standardowy.

Przykład:

Toksyczność 3 związków chemicznych badano testem inhibicji luminescencji Microtox. Ekspozycja mikroorganizmów trwała 15 min. Po tym czasie mierzono intensywność luminescencji bakterii. Wyniki pomiarów przedstawiają tabele 1-3

Tabela 1. Związek 1

Sample	Conc mg/l	It
Control	0.000	84,93 #
Control	0.000	89,85 #
Control	0.000	89,47 #
1	6.50	77,09
2	6.50	76,64
3	6.50	77,91
4	12.00	64,70
5	12.00	63,39
6	12.00	65,57
7	25.00	41,81
8	25.00	43,72
9	25.00	45,24
10	50.0	10,41
11	50.0	13,07
12	50.0	8,61

Tabela 2. Związek 2

Sample	Conc mg/l	It
Control	0.000	93,90 #
Control	0.000	91,93 #
Control	0.000	100,02 #
1	3.75	98,41
2	3.75	91,13
3	3.75	89,41
4	6.50	70,37
5	6.50	68,40
6	6.50	69,75
7	12.00	53,75
8	12.00	55,59
9	12.00	55,29
10	25.0	40,66
11	25.0	39,28
12	25.0	39,15

Tabela 3. Związek 3

Sample	Conc mg/l	It
Control	0.000	92,05 #
Control	0.000	91,80 #
Control	0.000	91,90 #
1	12.00	68,51
2	12.00	66,31
3	12.00	64,14
4	25.00	56,96
5	25.00	58,41
6	25.00	64,28
7	50.00	46,37
8	50.00	43,26
9	50.00	40,97
10	100.0	30,77
11	100.0	27,40
12	100.0	28,02

Dla podanych wartości oblicz:

1. Średnią wartość inhibicji luminescencji dla danego stężenia

2. Odchylenie standardowe wartości średniej

3. Procentowy efekt inhibicji luminescencji

4. Metoda logarytmiczno - probitową wyznacz wartość IC50 (wartość odczytaj z równania prostej, podaj współczynnik korelacji Pearsona R)

5. Określ istotność różnic toksyczności związków 1,2 i 3

Literatura:

1. Walker C.H., Hopkin S.P., Sibly R.M., Peakall D.B.: Podstawy ekotoksykologii. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002.

Strona | 9

Zmiany fizjologiczne

Zmiany w populacji

ekosystem

Skład gatunkowy zbiorowiska

Substancja skażająca

Reakcje na poziomie organizmu

Zmiany biochemiczne

Wydłużający się czas wystąpienie reakcji

Wzrastająca trudność przypisania reakcji działaniu konkretnych substancji

Wzrastające znaczenie reakcji

Dawka ksenobiotyku [mg/kg]

Efekt

LC₅₀

LOEL

NOEL

logarytm stężenia

Śmiertelność (%)

100

50

PROBITY

Logarytm stężenia

Wykres logarytmiczno-probitowy

Wykres zależności efektu toksycznego od stężenia

stężenie

---