IX Barwniki antocyjanowe

Barwniki to związki chemiczne absorbujące światło w zakresie widzialnym. Pod względem budowy chemicznej stanowią grupę bardzo zróżnicowanych związków. Najogólniej można je podzielić na związki zawierające azot - tutaj należą barwniki pochodne pirolu, a więc chlorofile, a także barwniki pochodne pirymidyny oraz związki bezazotowe - chinoidy, flawonoidy i karotenoidy. Charakterystyczną cechą barwników roślinnych jest to, że występują w komórkach w postaci glikozydowej lub w połączeniu z białkiem.

Istnienie barwnych substancji organicznych jest przykładem wpływu rezonansu elektronowego na właściwości substancji. Rozpatrując wzory barwników można zauważyć, że każdy zawiera długi łańcuch na przemian zmieniających się pojedynczych i podwójnych wiązań węgiel-węgiel, czyli układ tzw. sprzężonych wiązań podwójnych, który może występować w dwu równoważnych formach. Obecność takich struktur rezonansowych jest koniecznym warunkiem, aby związek organiczny był barwnikiem. Substancja jest barwna, ponieważ selektywnie absorbuje światło widzialne. Barwa, którą obserwujemy jest barwą odbitą lub przepuszczoną przez daną substancję barwną. W ten sposób substancja czerwona absorbuje światło niebieskie i zielone, substancja zielona światło czerwone i niebieskie itd. Zdolność absorbowania światła jest konsekwencją rezonansu elektronowego w układzie podwójnych wiązań sprzężonych. Absorpcja światła widzialnego zachodzi przy podwyższeniu sprzężenia. Barwnikami są wszystkie produkty o odpowiednio wystarczającym sprzężeniu na to, aby spowodować pojawienie się intensywnej barwy.

Antocyjany należące do barwników flawonoidowych są charakterystyczne tylko dla roślin wyższych. Najbardziej istotną ich funkcją jest zmiana widma absorpcyjnego wnętrza komórki, a zwłaszcza chloroplastów, co wiąże się z wykorzystaniem innych długości fal świetlnych do fotosyntezy, a także tworzenie barw u roślin. Antocyjany charakteryzują się całą gamą barw, od jasnoniebieskiej po purpurową. Występują w kwiatach, owocach, liściach, korzeniach i bulwach roślin.

W roślinach antocyjany występują w postaci glikozydów. Glikozydy to związki chemiczne, pochodne węglowodanów, których anomeryczny atom węgla jest związany przez kondensację do atomu niecukrowej grupy. Kondensacja ta zachodzi najczęściej przez atom tlenu, rzadziej węgla, siarki lub azotu. Wiązanie takie nazywa się wiązaniem glikozydowym. Część cukrową takiego związku nazywa się glikonem, a cząsteczkę niecukrową aglikonem. W przypadku glikozydów roślinnych część cukrowa składa się najczęściej z kilku (do 12) cząsteczek cukrów prostych.

W przypadku barwników antocyjanowych cześć aglikonowa nazywana jest antocjanidyną (około 15 typów). Cześć cukrową (glikon) antocyjan stanową z reguły krótkie 1- 3 cząsteczkowe łańcuchy złożone z glukozy lub, rzadziej, innych cukrów np. ramnozy, arabinozy, ksylozy, galaktozy. Przyłączenie cząsteczki cukru do aglikonu występuje najczęściej w pozycji C3, wiązaniem β-glikozydowym. Glikozydowa postać jest korzystna, gdyż dzięki temu antocyjany są dobrze rozpuszczalne w soku komórkowym, natomiast wolne są nierozpuszczalne w wodzie. Cukry wpływają także na trwałość aglikonów.

W grupie antocyjanów wyróżniono 15 typów antocyjanidyn (tych po odjęciu części cukrowej), z których 6 spotykamy w naturze najczęściej. Są to: cyjanidyna (aronia, wiśnie, czerwona kapusta, żurawina), delfinidyna (winogrona, czarne jagody, czarny bez, żurawina), pelargonidyna (pelargonia, truskawka), peonidyna (czarny bez, peonia), malwidyna (winogrona, malwa), petunidyna (petunia). Najbogatszym surowcem antocyjanowym są owoce aronii, które obfitują w różne glikozydy cyjanidyny.

Ryc. 1. Antocyjanidyny

Przykładami powszechnie występujących antocyjanów są: cyjanidyno-3-glukozyd, cyjanidyno-3-rutynozyd, malwidyno-3-glukozyd, malwidyno-3,5-diglukozyd.

Na barwę antocyjan mają wpływ:

1. Metylacja niektórych grup hydroksylowych - zmiana barwy w kierunku czerwonej;

2. Nagromadzenie antocyjanów w roślinach w stosunku do innych barwników - czyli zmiany ilościowe w zależności od gatunku;

3. Kopigmentacja - zmiana barwy w kierunku niebieskiej pod wpływem flawonów i związków pokrewnych; patrz niżej;

4. Kompleksy z metalami - czynnik wywołujący zmianę barwy w kierunku niebieskiej;

5. 
   Wpływ pH; patrz niżej (ryc.2).

Ryc. 2. Wpływ pH na barwę cyjanidyny

W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie konsumentów żywnością barwioną naturalnymi barwnikami. Zmusza to jej producentów do rezygnacji ze stosowania barwników syntetycznych i zastosowania do barwienia żywności naturalnych barwników. Związane jest to ze znacznymi ograniczeniami, gdyż barwniki antocyjanowe są bardzo niestabilne. Z tego powodu poszukuje się bezpiecznej z punktu widzenia zdrowotnego metody stabilizacji antocyjanów. Takim sposobem wydaje się kopigmentacja antocyjanów z innymi związkami np. flawonoidami (ryc. 3).

cukier

flawon cukier

Ryc. 3. Najczęstsze połączenia antocyjanidyny z cukrem i kopigmentatorem

Barwa antocyjanów zależy od pH środowiska, w jakim się one znajdują; w przypadku pH poniżej 7 (kwaśne) są one czerwone, a w pH obojętnym lub zasadowym (pH > 7) mają barwę niebieską lub fioletową. Jeśli jednak występują one w kompleksie z jonami glinu, magnezu lub żelaza III, to mimo kwaśnego odczynu środowiska, również mają barwę niebieską (tak jest np. w kwiatach chabra bławatka).

Nagromadzenie cukru powoduje często wzmożone wytwarzanie antocyjanu. Okorowane lub złamane gałęzie winorośli lub derenia uzyskują krwistoczerwone jesienne zabarwienie liści wskutek przerwania odpływu cukru.

Antocyjany oprócz roli barwników mają prawdopodobnie także inne znaczenie dla roślin. Przypuszcza się, że biorą udział w procesach oddychania. Przypisuje się im zdolność ochrony organizmu przed szkodliwym działaniem promieni X. Flawonoidy wykazują pewne działanie fizjologiczne na żywe organizmy typu: pobudzenie lub zahamowanie czynności serca, ruchów oddechowych czynności mięśni, działanie obniżające lub podwyższające ciśnienie krwi, przeciwwirusowe, bakteriobójcze.

Antocyjany występują szeroko w całym świecie roślinnym. Nie stwierdzono ich tylko u glonów i w rodzinach roślin kaktusowatych i komosowatych (np. komosa, burak czerwony, szpinak). Rodziny te mają swoją, odrębną grupę barwników zwanych betalainami, w skład których wchodzą czerwonofioletowe betacyjany i żółte betaksantyny. Barwniki te występują nie tylko w korzeniu buraka, ale także w kilku innych roślinach i grzybach niespożywanych przez człowieka. Wyjątkiem jest opuncja figowa (Opuntia ficus-indica), która zawiera je w jadalnych owocach. W buraku dominują betacyjany maskujące obecność betaksantyntynów. Barwniki buraka charakteryzują się ograniczoną stabilnością, zależną od wielu czynników. Betacyjany są szczególnie nieodporne na działanie podwyższonej temperatury, a także tlenu. Największą stabilność wykazują przy pH 4 - 5, zaś odczyn zasadowy powoduje ich szybki rozpad. Podczas obróbki cieplnej czerwone barwniki betacyjanowe rozkładają się szybciej niż żółte betaksantyny, zwłaszcza jeśli gotuje się buraki obrane i rozdrobnione. Wywar i buraki nabierają wtedy zabarwienia czerwonobrunatnego, a przy długotrwałym ogrzewaniu żółtobrązowego. Buraki gotowane w skórce zachowują dobrze barwniki, a obniżenie pH roztworu przez zakwaszenie zwiększa intensywność i stopień zachowania barwy.

W burakach ćwikłowych głównym betacyjanem jest betanina (ryc. 4), a główną betaksantyną - wulgaksantyna I i wulgaksantyna II (ryc. 5). Dwie wulgaksantyny różnią się jedynie pojedynczą boczną grupą cząsteczki.

Ryc. 4. Betanina

Ryc. 5. Wulgaksantyna I (po lewej) i II (po prawej)

Antocyjany występują w wakuolach. Nadające barwy kwiatom znajdują się w komórkach epidermy. Kwiaty białe swój efekt barwny uzyskują w wyniku obecności powietrza w tkankach (odbija światło).

Przygotowanie wyciągów

Sprzęt i odczynniki

Zlewka 250 ml (2 sztuki), kolba erlenmajera (2 sztuki), bagietka, probówki (14 sztuk), cylinder miarowy.

Wykonanie

a) antocyjany z kapusty:

Kapustę pokroić w drobniutkie kawałki, wsypać do zlewki 250 ml do poziomu 100 ml.

b) betacyjany z buraka:

Burak pokroić w drobną kostkę i wsypać do zlewki 250 ml do poziomu 100 ml.

Obie zlewki napełnić woda destylowaną do poziomu 250 ml i powoli ogrzewać do wrzenia mieszając bagietką. Po zagotowaniu i ostudzeniu odsączyć roztwory do kolbek erlenmajera.

Ćwiczenia 1. Wpływ pH na barwę barwników

1. Do 2 probówek nalać po 2 ml wyciągu z kapusty, następnie do pierwszej z nich dodać 1 ml

10% HCl, do drugiej dodać 1 ml 10% NaOH. Te same reakcje wykonać na wyciągu z buraka.

Opisać zmiany barwy roztworów w każdym z przypadków.

2. Do 2 probówek nalać po 1 ml wyciągu z kapusty, a następniedo pierwszej probówki dodać 5 ml wody destylowanej (pH ok. 5,0), do drugiej dodać 5 ml wody wodociągowej (pH ok. 7,0)

Występuje wyraźna różnica w zabarwieniu obu roztworów.

Antocyjan czerwonej kapusty (rubrobrassycyna) jest szczególnie silnym i czułym indykatorem.

Ćwiczenie 2. Chemiczne reakcje antocyjanów

1. Reakcja z Pb(CH₃COO)₂

Do 2 ml wyciągu z buraka i kapusty dodać po 0,5 ml nasyconego roztworu Pb(CH₃COO)₂.
Opisać barwy osadów.

2. Reakcja z AlCl₃

Do 5 ml wyciągu z kapusty i buraka dodać szczyptę krystalicznego AlCl₃. Opisać zmiany barwy roztworów.

3. Reakcja z FeCl₃

Do 2 ml wyciągu z kapusty i buraka dodać po kilka kropli 5% FeCl₃. Opisać zmiany barwy roztworów.

Ćwiczenie 3. Kwaśna hydroliza barwnika z buraka ćwikłowego

Do 5 ml wyciągu z buraka dodać 4 ml stężonego HCl i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 min. Następnie przeprowadzić 5-krotną ekstrakcję alkoholem n-amylowym (pod dygestorium!). W tym celu do probówki należy dodać 1 ml alkoholu n-amylowego i wstrząsnąć probówką. Po oddzieleniu się warstw należy odpipetować gruszką warstwę alkoholu (niepotrzebne). Po ekstrakcji powinien pozostać jasno zabarwiony roztwór cukru (ekstrakcja: pozbycie się aglikonu). Obecność cukru w roztworze wykazać znaną już ogólną reakcją na cukry. Scharakteryzować zachodzące procesy i opisać równaniami reakcji chemicznych.

KATEDRA BIOTECHNOLOGII I BIOLOGII MOLEKULARNEJ

PRACOWNIA BIOCHEMII

BARWNIKI ANTOCYJANOWE

Imię i nazwisko: Kierunek i rok: Grupa: Termin zajęć:

1. Cel ćwiczenia

2. Obserwacje

1. Wpływ pH na barwę barwników

2. Chemiczne reakcje antocyjanów

1. Reakcja z Pb(CH₃COO)₂

2. Reakcja z AlCl₃

3. Reakcja z FeCl₃

3. Kwaśna hydroliza barwnika z buraka ćwikłowego

3. Reakcja chemiczna

4. Wnioski

8

---