ENZYMY

Enzym - biokatalizator, białko o zdolnościach katalizatora.

Katalizator - substancja, która zwiększa szybkość reakcji lecz sama nie ulega przemianom. Budowa i właściwości katalizatora po reakcji są takie same jak przed reakcją.

Aby umożliwić zajście reakcji możliwe są dwie strategie:

• Dostarczenie określonej ilości energii, aby cząsteczki substratu ponieść z ich podstawowego poziomu energetycznego na poziom odpowiadający barierze energetycznej co uzyskujemy przez ogrzanie mieszaniny reagującej

• Użyć katalizatora, który obniży energie aktywacji do poziomu umożliwiającego rozpoczęcie reakcji w danej temperaturze

Energia aktywacji - najmniejsza ilość energii, którą trzeba dostarczyć 1 molowi substratu, aby stal się reaktywny

ATP (adenozynotrójfosforan) - jest uniwersalnym akumulatorem i przenośnikiem energii. Jeden z wielu w organizmie związków, z którego czerpie on energię do życia i jego przejawów. Wszystkie procesy energetyczne służą, w końcowym rozrachunku, do tworzenia ATP lub jego redukcji. Związek ten nie jest magazynowany, tylko tworzony na bieżąco. (źródło: http://pl.wikipedia.org/wiki/ATP)

Energia aktywacji kJ/mol	Połowiczny czas reakcji I rzędu w temperaturze 27^0C
62,7 125,4	0,007 sek 38 godz
Zmniejszenie energii 2x	Przyspieszenie reakcji 20 mln x

Wszystkie enzymy są białkami i są syntetyzowane przez żywe organizmy. Struktury białek:

• Pierwszorzędowa: wiązania kowalentne. Sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydu

• Drugorzędowa: łańcuch polipeptydu o strukturze helisy

• Trzeciorzędowa: przestrzenne, trójwymiarowe pofałdowanie polipeptydu - kłębuszek

• Czwartorzędowa: przestrzenne połączenie podjednostek - kilka podjednostek połączonych w makrocząsteczkę

Struktury III- i IV- rzędowe są aktywne enzymatycznie. W cząsteczce tworzy się centrum aktywne, tj. miejsce przyłączenia substratu.

W skład enzymu wchodzi cząsteczka białka, ale może nią być związany kofaktor, tj. część niebiałkowa.

Kofaktorami mogą być niskocząsteczkowe związki organiczne lub jony metali. Są one obecne w centrum aktywnym enzymu. Wyróżnia się trzy typy kofaktorów:

• Koenzymy - związki organiczne luźno związane z białkiem - enzymem (zwykle witaminy)

• Grupy prostetyczne - ściśle związane z białkiem

• Kofaktory = zwykle jony metalowe

HOLOENZYM = APOENZYM + KOFAKTOR

Apoenzym i kofaktor współdziałają ze sobą w katalizie reakcji chemicznych. Ten sam kofaktor (koenzym) może wchodzić w skład wielu różnych enzymów i może katalizować odmienne reakcje chemiczne. Może być jednak tak, że obecność danego koenzymu wiąże się tylko z katalizą jednego rodzaju reakcji - swoistość enzymu.

Do odpadów zanieczyszczających środowisko - enzymy o szerokim spektrum działania

Do leczenia chorób - enzym wyspecjalizowany

Enzymy wykazują specyficzność:

• Wobec jednej reakcji chemicznej

• Wobec jednego substratu

Zasada zamka i klucza - przestrzenne dopasowanie

Enzymy pozakomórkowe posiadają szeroka specyficzność np. enzymy trawienne.

Reakcja enzymatyczna wymaga fizycznego połączenia się substratów z centrum aktywnym enzymu.

Utworzenie kompleksu

SUBSTRAT + ENZYM = KOMPLEKS E-S <─> ENZYM + PRODUKT

Rys. 1 Komplementarne wiązania chemiczne

Szybka dyfuzja pozwala spotkać się enzymowi z substratem.

Typowy enzym może związać się z substratem i go „obrobić” z szybkością 1000 x na sekundę!!

Dlaczego? Ponieważ ruch na poziomie cząsteczkowym jest niezmiernie szybki.

Dyfuzja = „chaotyczny ruch” - działa dobrze tylko na krótkich dystansach

Liczba obrotów - górna granica aktywności

Szlak metaboliczny

A → B → C → D → E → F

e1 e2 e3 e4 e5

substrat produkt

związki pośrednie

e - energia

W większości przypadków szlak przemian obejmuje wiele etapów. Po drodze powstają produkty pośrednie, aż w końcu tworzony jest produkt końcowy. W reakcji bierze udział wiele enzymów.

In viva - w organizmie żywym

In vitro - w laboratorium

In silica - w komputerze

Reakcje inhibicji

• Inhibicja kompetecyjna (współzawodnicza), substrat i inhibitor współzawodniczą o dostęp do centrum aktywnego. Budowa inhibitora jest bardzo podobna do substratu. Zwiększając stężenie cząsteczek substratu zwiększamy jego szanse na kontakt z centrum aktywnym.

• Inhibicja niewspółzawodnicza - inhibitor wiązany jest przez enzym w innym miejscu, poza centrum aktywnym. Dochodzi wówczas do odkształcenia allosterycznego cząsteczki enzymu. Oznacza to, że centrum aktywne traci swój układ konformacyjny i tym samym przestaje być aktywne. Także substrat nie może się związać z aktywnym centrum. Zwiększenie stężenia substratu nic nie daje, gdyż nie zwiększa się szansa na jego przyłączenie.

• Hamowanie przez substrat i przez produkt - przy zwiększonym stężeniu substratu nie następuje zwiększenie szybkości reakcji, gdyż prawdopodobnie cząsteczki substratu przyłączone do centrum nakładają się na siebie co utrudnia reakcję - duże stężenie produktu faworyzuje z kolei reakcję w odwrotnym kierunku - enzymy, które służyły rozwalaniu substancji (depolimerazy), będą mogły je teraz syntezować (syntazy)

Sposoby wyrażania aktywności enzymów

• Aktywność enzymu - szybkość katalizowanej reakcji

• Szybkość reakcji może być mierzona przez pomiar zmian stężenia substratu lub produktu w czasie reakcji

• Międzynarodowa Jednostką Aktywności Enzymatycznej (IU) jest taka ilość enzymu, która powoduje przekształcenie 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującego pełne wysycenie enzymu 1J (ang. U) = μM/min

Jednostki aktywności przelicza się na 1 mL lub 1 g badanej próbki, która zawiera enzym.

Czynniki wpływające na aktywność enzymów:

• 
  Stężenie substratu i stopień jego rozpuszczalności

K_m - takie stężenie substratu przy którym szybkość reakcji osiąga połowę maksymalnej wielkości (im mniejsza K_m tym szybsza reakcja)

Rys. 2 Wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu - krzywa Michealisa.

Rozpuszczalność - wszystkie enzymy są rozpuszczalne. Gdy substrat jest nierozpuszczalny to reakcja zachodzi gorzej niż gdyby był rozpuszczalny.

• 
  Temperatura reakcji

Każdy enzym ma swoją temperaturę minimalną i maksymalną, które wytyczają temperaturowy zakres działania enzymu. Najważniejsza jest znajomość temperatury optymalnej (wraz z zakresem działania jest podawana przez producenta).

• pH

Enzymy działają zwykle w wąskim zakresie pH.

pH optimum - pH przy którym stwierdza się najwyższą szybkość reakcji.

• Siła jonowa roztworu - zasolenie (bo w solach są silne wiązania jonowe)

• Obecność inhibitorów i czynników denaturujących

• Obecność kofaktorów/koenzymów i aktywatorów

• Hamujący efekt obecności produktów reakcji

Produkcja enzymów

Enzymy pozyskuje się przez ekstrakcję i odfiltrowanie z organizmów zwierzęcych i roślinnych.

Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego:

• Bakterie

• Grzyby (drożdże, pleśnie)

Chodzi o naprawdę wyrafinowane szczepy o niezwykłych uzdolnieniach. Potem je modyfikujemy.

Źródła enzymów:

• Rozdrobniona masa roślinna

• Rozdrobnione tkanki zwierzęce (trzustka, soki żołądkowe, wątroba)

• Hodowle mikroorganizmów

• Hodowle wgłębne

• Hodowle w podłożu stałym

Bioreaktor - sporządzamy pożywkę hodowlaną, która musi być bardzo sterylna. Zapewniamy to przez ogrzewanie mieszaniny w reaktorze w temperaturze 121⁰C przez 15 minut. Następnie chłodzimy, dodajemy mikroby. Proces może zachodzić tlenowo (pleśnie) lub beztlenowo. Musi być określone pH, T, stymulatory wzrostu. Staruje hodowla. Jest mieszanie. Mikroby rosną i zachodzi reakcja. Powstaje produkt - związek chemiczny, który może zakumulować się w komórce, bądź wydzielić na zewnątrz. Jeśli jest w komórce to musimy go wyodrębnić, a nie jest to takie proste, ponieważ trzeba się przebić przez ścianę komórkową. Nawet jeśli nam się uda, to w komórce jest mnóstwo związków, a nam chodzi tylko o jeden. Stosujemy różne metody separacji.

Produkcja preparatów nieczyszczonych

Surowiec: masa roślinna; materiały zwierzęce; podłoże przerośnięte mikroorganizmami; ciecz pohodowlana

Wymieszanie z nośnikiem (nie będzie się sklejało, lepiej się suszy)

Rozdrobnienie i dobre wymieszanie

Suszenie

Gotowy, suchy, sproszkowany preparat

Preparaty ciekłe niezagęszczone

Materiał roślinny Hodowla wgłębna

Materiał zwierzęcy

Porośnięte podłoże

Ekstrakcja ciało stale/ciecz

Separacja zawiesin (koagulacja, filtrowanie, wirowanie, ew. sedymentacja)

Roztwór enzymów (musimy błyskawicznie zużyć, bo inaczej sfermentuje)

Preparaty ciekłe zagęszczone

Roztwór enzymów

Wyparka próżniowa ultrafiltracja, odwrócona osmoza

Chłodzenie

Koncentrat

Chromatografia jonowymienna

Chromatografia powinowactwa

Sączenie żelowe

Oczyszczony koncentrat enzymów

Preparaty suche

Oczyszczony koncentrat enzymów

Stabilizatory, nośniki

Suszenie rozpyłowe lub fluidalne lub sublimacyjne

(zamrażamy i dajemy tylko tyle ciepła, żeby lód odparował)

Standaryzacja

Gotowy produkt

Standaryzacja - jakość musi być stabilna, jednakowa

Stabilizacja - trwałość (dodawanie konserwantów, antyoksydantów)

Oczyszczanie białek

• Chromatografia jonowymienna - wykorzystanie ładunku białka do jego selektywnej separacji (siły elektrostatyczne)

• Chromatografia powinowactwa - przyłączenia białka do matrycy za pomocą specyficznych ligandów: analog substratu lub produktu, przeciwciało, analog inhibitora, kofaktor/koenzym

• Specyficzne białka są eluowane przez dodatek reagentu, który współzawodniczy o połączenie do ligandu

• Chromatografia żelowa

• Na bazie rozmiarów cząsteczki

• Do separacji wykorzystuje się porowate matryce. Małe cząsteczki penetrują do wnętrza matrycy i przez to droga ich wypływu jest dłuższa i później opuszczają kolumną

• Duże cząsteczki wypływają szybciej

• Elektroforeza - mamy płytkę, na która nanosimy żel i przykładamy prąd. Przykładamy grzebień, żeby w żelu było rowki. Do rowków nakładamy substancje. Włączamy prąd i powstaje pole, wytwarzają się bieguny i substancje się przesuwają - jedna dalej, drugie bliżej

Roztwór enzymów Wytrącanie acetonem lub alkoholem

Wypalanie (NH₄)₂SO₄

Wirowanie

Rozpuszczanie (+dializa)

Koncentrat

Chromatografia

Stabilizacja

Standaryzacja

Oczyszczony koncentrat enzymów

Biotechnologia - Enzymy 7/7