Diagnostyka molekularna w medycynie

Główne kierunki analizy DNA

Genomowy DNA

Amplifikacja DNA Hybrydyzacja molekularna

Amplifikacja in-vitro - Southern Blot

PCR - Northern Blot

- Dot Blot

- DNA Fingerprinting

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

• metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów nukleinowych,

• polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną, które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze,

• w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich temperatur,

• proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,

• odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,

• badany kwas nukleinowy może być denaturowany i unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.

• proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,

• odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,

• badany kwas nukleinowy może być denaturowany i unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej.

Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:

• DNA - DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,

• DNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,

• RNA - RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z komplementarna cząsteczką RNA.

Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest zróżnicowana:

RNA -RNA > DNA -RNA > DNA -DNA

Sondy molekularne

W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi molekularne np. klonowanie lub sondy syntetyzowane chemicznie (zwykle o długości 10 - 50 nukleotydów).

Zalety sond syntetycznych:

- stosunkowo łatwa dostępność,

- możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,

- nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,

- krótki czas hybrydyzacji,

- wysoka selektywność.

Znakowanie sond molekularnych

Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie radioizotopu ³²P w miejsce niepromieniotwórczych atomów fosforu.

Można tego dokonać poprzez:

- przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty fosfonowej [γ ³²P] ze znakowanego ATP na koniec 5' cząsteczki sondy

lub

- wbudowując w łańcuch sondy [γ ³²P] - deoksyfosfonukleozydy w procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).

W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.

Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny lub digoksygeniny. Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas w procesach dwustopniowych:

Etap I:

- użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy digoksygeninie,

• streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami (peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).

Etap II:

-w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.

Hybrydyzacja Southern (ang. Southern blot hybridization)

• hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego fragmentu DNA,

• najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA - DNA,

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy.

5. Związanie DNA z filtrem: w temperaturze 80°C lub poprzez naświetlanie UV.

6. Hybrydyzacja z sondą.

7. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii i reakcji barwnych lub fluorescencji

Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:

1. Prehybrydyzacja:
- eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze,

- w celu zminimalizowania tła dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe.

2. Właściwa hybrydyzacja:

- wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi,

- wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze stężenie soli, dodatek formamidu,

- częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli.

3. Płukanie filtru:

- usunięcie niezhybrydyzowanej sondy - jest to warunek specyficznego obrazu hybrydyzacji.

Hybrydyzacja Southern umożliwia:

- wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje) większych niż 50 pz,

- badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA - RFLP (restriction fragment length polymorphism).

Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc restrykcyjnych.

Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.

Hybrydyzacja Northern (ang. Northern blot hybridization)

Jest to metoda służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych genów(badanie ekspresji genów).

Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:

-rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach denaturujących,

• przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,

• utrwalenie RNA na membranie,

• hybrydyzacja RNA z sondą,

• odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.

Sonda daje sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

Hybrydyzacja DOT - BLOT

- metoda półilościowa,

- umożliwia jednoczesne wykrywanie i identyfikację wielu próbek na tym samym filtrze,

- pozwala na bezpośrednie stosowanie komórek hodowanych in vitro lub bakterii w miejsce kwasów nukleinowych,

- stosowana do wykrywania wirusów w diagnostyce chorób zakaźnych zwierząt chodowlanych.

DNA Fingerprinting (genetyczny odcisk palca)

• Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.

• Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.

• Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów DNA.

• Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) - zmienna liczba tandemowych powtórzeń.

Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.

Metedyka:

- trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych miejscach,

- rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny pocięte fragmenty DNA,

- przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,

- detekcja.

W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do kilkudziesięciu loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. DNA fingerprint.

Zastosowanie:

- badania medyczno - sądowe,

- ustalanie ojcostwa.

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)

• Należy do najczęściej stosowanych technik biologii molekularnej.

• W znaczny sposób przyśpieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.

• Umożliwia specyficzną amplifikacje in vitro wybranych odcinków DNA i RNA.

• Charakteryzuje się wysoką czułością.
  Rys historyczny

• Izolacja polimerazy DNA z Thermus aquaticus (Chien 1974).

• Wydłużanie starterów przy udziale fragmentu Klenowa polimerazy I z E.coli (Panet i Khorana 1974).

• Cykliczne wydłużanie starterów (Saiki i wsp. 1985).

• Zastosowanie termostabilnej polimerazy (Mullis i Faloona 1987, Saiki i wsp. 1998).

• Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).
  Rekordy

1. Długość fragmentu 6 kpz (obecnie 40 kpz fag lambda)

Ponce MR, Micol JL. PCR amplification of long fragments.

Nucleic Acids Res. 20, 623, 1992

2. Pojedynczy włos

Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabauch S.A., Erlich H.A.

DNA typing from single cells. Nature 340, 35-42, 1988

3. Pojedyncza komórka

Li H., Gyllensten U.B., Cui X., Saiki R.K., Erlich H.A., Arnheim N.

Amplification and analysis of DNA sequences in single human

sperm and diploid cells. Nature 335, 414-417, 1988

4. Pojedynczy oocyt

Coutelle C., Williams C., Handyside A., Hardy K., Winston R.,

Williamson R. Genetic analysis of DNA from single human

oocytes: a model for preimplantation diagnosis of cystic fibrosis.

Br. Med.. J. 299, 22-24, 1989

Założenia reakcji

• Technika enzymatycznej amplifikacji określonych sekwencji DNA.

• Specyficzność reakcji zapewniają dwa startery komplementarne do sekwencji docelowej.

• Czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów ponad 1 000 000 razy mimo obecności innych sekwencji.

• Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc.
  Przebieg reakcji

Cykle reakcji PCR:

• Denaturacja wstępna - 92-95 ºC

• Cykle (25-35)

Denaturacja - 92-95 ºC

Wiązanie starterów - 40-62 ºC

Synteza - 68-72 ºC

• Synteza końcowa - 68-72 ºC

• Przechowywanie - 4 ºC

Skład mieszaniny reakcyjnej

1. Matryca DNA (RNA)

2. Startery

3. dNTP

4. MgCl₂

5. Polimeraza Taq

6. Bufor
Matryca

1. Ilość DNA 1ng - 1μl

2. Wyjściowa liczba matryc 3 x 10⁵

DNA człowieka 1 μg

DNA drożdży 10 ng

DNA E.coli 1 ng

3. Stopień czystości Pomiar UV

Elektroforeza

4. Metoda izolacji Inhibitory
Startery

1. Stężenie 0.1 - 0.5 μM

2. Stężenie wyjściowe 18 - 28 nt

3. Zawartość GC 50 - 60%

4. Tm 55 - 72ºC

5. Stężenie wyjściowe 200 - 1000 pmoli/μl

6. Stężenie robocze 10 pmoli/μl

Uwagi: Zbyt duże stężenie - niespecyficzny produkt.

Dimery starterów - komplementarne końce 3'

dNTP

1. pH 7.0

2. Stężenie wyjściowe 5 - 10 mM

3. Stężenie w reakcji 20 - 200 μM

4. Przechowywanie -20şC

Uwagi: Po 30 cyklach PCR 50% nukleotydów występuje jako dNTP. Korzystniej stosować mniej dNTP niż zbyt dużo. 20 μM każdego dNTP wystarcza do syntezy 2.6 ng DNA

lub 10 pmoli sekwencji o długości 400 pz.

MgCl₂

1. Jony Mg²⁺ wiązane są przez

Startery

Matrycę

Polimerazę

dNTP

2. Stężenie 0.5 - 2.0 mM
Polimeraza

1. Stężenie 0.5 - 5 jedn./100 μl

2. Przechowywanie -20ºC

3. Okres półtrwania 92.5ºC 2 godz.

92.0ºC 40 min.

97.5ºC 5 min.

4. Temperatura 68 - 72ºC

5. Synteza 30 - 100 nt/sek. (2 kpz/min)

Uwagi: Za dużo polimerazy - niespecyficzne produkty

Za mało polimerazy - brak produktu

Najczęstszy błąd - za dużo cykli

Liczba matryc Liczba cykli

3 x 10⁵ 25 - 30

1.5 x 10⁴ 30 - 35
Bufor

1. pH 8.3 - 8.8

2. Tris-HCL 10 - 50 mM

3. Sole <50 mM

4. „Wzmacniacze” reakcji

DMSO, Żelatyna, BSA, Tween 20

Przebieg

1. denaturacja 94-95ºC - rozplecenie podwójnej nici DNA, czas ok. 30-60s

2. wiązanie starterów - przyłączanie (hybrydyzacja) starterów do matrycy ustalana doświadczalnie w zależności od składu nukleotydowego starterów czas ok. 30-60 s

3. synteza nici przez polimeryzację Taq 72ºC- na tym etapie zachodzi właściwa amplifikacja pożądanego fragmentu genu czas ok. 30-60s

- reakcja PCR prowadzi do wzrostu ilości pożądanego fragmentu DNA

-przerost ilości produktu wzrasta 2^n, gdzie n oznacza liczbę cykli, tak więc liczba matryc wzrasta wykładniczo np., po 30 cyklach liczba matryc wynosi 107 374 824 (2^30)

-produkty jednego cyklu amplifikacji służą jako matryca dla następnego cyklu

-produkt PCR jest dwuniciowym fragmentem DNA, którego końce określone SA przez sekwencję obu starterów

Analiza produktów PCR

1. Elektroforeza w żelach agarozowych

- barwienie bromkiem etydyny,

- autoradiografia.

2. Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych

- barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie,

- autoradiografia, fluorografia.

• Elektroforeza to rozdział cząsteczek posiadających ładunek w polu elektrycznym

• Ruchliwość elektroforetyczna jest proporcjonalna do ładunku i odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki, zależy tez od kształtu

• Elektroforeza agarowa odbywa się w żelu agarowym zanurzonym w buforze do elektroforezy

• W zależności od wielkości rozdzielanych cząsteczek stosuje się żele o różnym stężeniu. Produkty o wielkości 100-500pz - żel 2% 0,5 - 1 kpz - żel 1,5%

• Produkt PCR zaopatrzony w barwnik zanoszony (?) jest do studzienek

• Po włączeniu napięcia produkt migruje w żelu

• DNA posiada ładunek (-) w polu elektrycznym migruje od katody (-) do anody (+)

• W zależności od wielkości cząsteczki, kształtu produkt PCCR z różną szybkością oddala się od miejsca nałożenia. Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwia się (bromek etydyny) i ocenia się w świetle UV

• Produkt PCR powinien być widoczny na żelu w postaci dobrze widocznego prazka o określonej wielkości

Modyfikacje

• RT-PCR (ang. Reverse transcriptase PCR) Matrycą wyjściową jest mRNA, które w procesie odwrotnej transkrypcji jest przepisywane na komplementarne DNA (ang. complementary DNA - cDNA). Następnie cDNA ulega amplifikacji, jak w zwykłym PCR.

Zastosowanie: Badanie ekspresji genów.

• PCR multipleks - Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie reakcyjnej kilku par starterów.

Zastosowanie: Jednoczesna amplifikacja kilku regionów jednego lub kilku genów. W jednej reakcji uzyskać można nawet 13 amplikonów.

• PCR-RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism PCR) - Połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną. Produkty amplifikacji poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego i porównuje wzór powstałych prążków.

Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów. Analiza bezpośrednia - mutacje. Analiza pośrednia - polimorfizmy

• Real-time PCR (PCR w czasie rzeczywistym) - Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor. Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze komputera.

Zastosowanie: Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w materiałach klinicznych. Umożliwia monitorowanie postępów leczenia (określenie wyjściowego poziomu wiremii lub bakteriemii jest wskazaniem koniecznym do rozpoczęcia właściwego leczenia).

• Nested-PCR (PCR gniazdowy) - Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna (komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji) i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do pierwszej pary starterów). Produkt powstały po amplifikacji z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody.

Zastosowanie: Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych.

• RAPD-PCR (ang. random amplified polymorphic DNA) - Wykorzystywana, gdy nieznane są sekwencje specyficzne. Stosuje się krótkie uniwersalne startery, którymi amplifikuje się zbiór produktów, a ich liczba i długość są zależne od sekwencji nukleotydowej matrycy oraz warunków reakcji.

Zastosowanie: Określenie zmienności genetycznej bez informacji o sekwencji analizowanego DNA

• RACE-PCR (ang. rapid amplification of cDNA ends)- Technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości sekwencji gdy znany jest tylko fragment.

Zastosowanie: Klonowanie cDNA.

• ASA-PCR(ang. allele specific amplification)- Technika umożliwiająca wykrywanie mutacji przy pomocy specyficznych oligonukleotydów. Oprócz starterów flankujących stosuje się starter w pełni komplementarny do allela z mutacją lub startery, z kórych jeden jest w pełni komplementarny do allela z mutacją a drugi do allela niezmutowanego. Startery są tak zlokalizowane, że w wyniku PCR powstają produkty różniące się długością w zależności od genotypu użytej próbki DNA.

Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji.

• Competitive-PCR (PCR konkurujący)- W mieszaninie reakcyjnej umieszcza się DNA badane oraz DNA kontrolne o znanym stężeniu. W wyniku konkurowania o reagenty ilość produktu DNA kontrolnego będzie odwrotnie proporcjonalna do ilości DNA badanego w probówce.

Zastosowanie: Ocena ilościowa produktu.

Zastosowanie

-sekwencjonowanie

-hybrydyzacja

-analiza funkcji i ekspresji genów

- mikrobiologiczne - wykrywanie bakterii, wirusów, pasożytów (np. wirus HIV, prądki gruźlicy)

-diagnostyka prenatalna

-onkologia - wykrywanie mutacji w onkogenach, genach supresorowych, monitorowanie przebiegu choroby, określenie predyspozycji do chorób nowotworowych

-wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych

-transplantologia - badania zmienności genów HLA decydujących o przyjęciu/odrzuceniu przeszczepu

- medycyna sadowa - badania ojcostwa, kryminalistyka, identyfikacja osobnicza

-wykrywanie GMO

Mikromacierze DNA

Zastosowanie badań molekularnych

-wykrywanie mutacji związanych z chorobami

-monitorowanie chorób o podłożu genetycznym

-śledzenie sposobu dziedziczenia mutacji genetycznych w rodzinach oraz ustalenie nosicielstwa chorób genetycznych

-określenie ekspresji genów

-identyfikacja mutacji - określenie rodzaju mutacji

-w kryminalistyce do identyfikacji osób, ustalenia spraw przestępstw w oparciu o badania sladów biologicznych

-w dochodzeniu ojcostwa

Metoda DNA microarray (mikromacierze DNA, mikrosiatki DNA, mikromoduły DNA, mikroprocesory DNA, chipy DNA)

Półilościowa metoda wykrywania

-genów lub ich fragmentów

-ekspresji genów

-mutacji w genach

oraz porównania genów np. w celu badania ich ewolucji.

Przy użyciu zestawu kilkiset lub kilku tys. sond oligonukleotydowych, które umieszczone SA w postaci plamek na jednaj płytce o wielkości mikroskopowego szkiełka nakrywkowego tworząc tzw. chipy genowe

Rodzaje macierzy

• Ze względu na budowę sond

-mikromacierze oligonukleotydowe - na płytce naniesione są krótkie na ogół 25-70 nukleotydowe sekwencje sond

-mikromacierze cDNA - sondy znacznie dłuższe zazwyczaj odpowiadające pełnym sekwencjom mRNA, co w praktyce oznacza zazwyczaj kompletną sekwencję wariantu genu

• Ze względu na wykrywanie sekwencji

-mikromacierze do badania ekspresji genów najczęściej stosowane -sondy w obrębie sekwencji mRNA

+macierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów)

+macierze pokrywające genom ( do badania ekspresji obszarów pozagenowych)

+macierze do badania splicingu

-mikromacierze do badania sekwencji genów

+macierze SNP - odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA

Etapy metody

1. synteza jednoniciowych sond DNA w milionach kopii każda umieszczenie w postaci plamek na jednaj płytce i przymocowanie chemiczne lub elektryczne do podłoża

- wszystkie kopie unikalnej sondy zgromadzone są w jednaj plamce o powierzchni ok. 90x90μm

2. przygotowanie badanego (jednoniciowego) DNA lub cDNA (przepisane z mRNA) wyizolowanego z komórki

3. wyznakowanie fluorochromem (np. Cy 3,Cy 5) badanego materiału

4. wprowadzenie badanego materiału do plamek z poszczególnymi sondami

-DNA lub cDNA jest wiązany do sond na zasadzie komplementarności zasad (hybrydyzacja)

5. niezwiązany lub słabo związany DNA lub cDNA jest usuwany na etapie odpłukiwania.

Detekcja

-DNA lub cDNA wcześniej wyznakowany fluorochromem w celu umożliwienia wizualizacji hybrydów

-plamki z hybrydami oświetlane światłem laserowym (…)

-obraz sczytuje ilościowo (za pomocą lasera lub mikroskopu)

-intensywność sygnału dla poszczególnych sond jest proporcjonalna do ilości kw. nukleinowego o danej sekwencji w próbce oraz siły wiazania

Analiza

-dane z mikromacierzy trzeba poddać wstępnej obróbce

-analiza zeskanowanego obrazu - obliczenia intensywności sygnału dla każdej sondy

-odjęcie sygnału sondy

-normalizacja danych - modyfikowanie wartości ekspresji w celu dostosowania do całości eksperymentu lub do zamierzonego rozkładu, niezbędna dla porównywania intensywności między macierzami

-sumaryzacja danych - podsumowanie wartości dla grup sond.

Może być wykonywane dla każdej grupy sond osobno lub za pomocą globalnego modelu dla całego doświadczenia.

Umożliwia

- udoskonalenie i ułatwienie diagnostyki chorób o podłożu genetycznym oraz prognozowanie ich przebiegu

-zindywidualizowanie toku leczenia poszczególnych pacjentów w zależności od ich swoistej postaci choroby

Obawy Genechip (?)

-drobny ślad biologiczny (kropla krwi, włos) ->brama do wiedzy o całym genomie

-automatyzm i szybkość badania

-potencjalne sytuacje

*zatrudnienie ->elita genetyczna

*ubezpieczenie- >dyskryminacja

*wybór partnera życiowego -> eugenika

*wybór embrionu -> eugenika

BADANIA CYTOGENETYCZNE

Badania cytogenetyczne - genetyka komórki jądrzastej; bada się chromosomy w metafazie, oznaczenie kariotypu, liczby i struktury chromosomów

Kariotyp konstytucyjny - ten, z którym się rodzimy; z krwi, płynu owodniowego

Kariotyp nabyty - powstał w wyniku choroby(np. nowotwory); ze szpiku

Komórki człowiek są diploidalne, czyli mają 46 chromosomów.

Monoploidie - gamety

Poliploidie - komórki mięśniowe, wątrobowe, magakariocyty w szpiku

Wskazania do analizy kariotypu:

- cechy fenotypowe wskazujące na dany zespół chromosomowy

- obecność wad rozwojowych, cech dysmorfii, upośledzenie umysłowe

- niepowodzenie rozrodu: samoistne poronienia, urodzenie dzieci z wadami o nieznanej etiologii, niepłodność nieznanej etiologii

- brak cech dojrzewania płciowego

- pierwotny lub wtórny brak miesiączki

- niedobór wzrostu o nieznanej etiologii

- nieprawidłowa budowa zewnętrznych narządów płciowych, obojnactwo

- występowanie strukturalnej aberracji chromosomowej w rodzinie

- badania prenatalne: wiek matki 35 rż, aneuploidia u dziecka z poprzedniej ciąży

- wystąpienie zespołu o genetycznie uwarunkowanej niestabilności chromosomalnej np. zespół Blooma, anemia Fanconiego

- zespół kruchego chromosomu X

- aberracje u jednego z partnerów

- pokrewieństwo rodziców

-nieprawidłowości w przesiewowym badaniu USG

- choroba recesywna z chromosomem X u kobiet

- kliniczne zaburzenia wzrostu

Materiał do analizy cytogenetycznej:

1. Krew obwodowa - limf T

2. Fibroblasy - gdy wynik kariotypu konstytucyjnego krwi obwodowej nie odpowiada fenotypowi pacjenta

3. Komórki kosmówki - droga aspiracji przez powłoki brzuszne, między 8 a 11 tyg; materiał trzeba oczyścić z tkanki matczynej

4. Amniocyty - komórki płodu pochodzące z owodni - skóra, ukł pokarmowy, moczowy; (amnipunkcja wczesna: 11-14 tyg, późna: 15-17 tyg)

5. Szpik kostny (białaczki) - kariotyp nabyty

6. Komórki guzów litych: płyny wysiękowe, biopsja guza. Należy mechaniczne rozdrobnić tkanki, wrzucić do naczynia hodowlanego, dodać kolagenozę. Powstaje pierwotna zawiesina komórkowa przeznaczona do hodowli

7. krew pępowinowa

Etapy hodowli:

1. Pobranie:

- jałowe pobranie krwi na heparynę o temp 37 st.C

- ok. 5 ml (krew), 2-4 ml (szpik)

2. Zakładanie hodowli komórkowej (w 2 sterylnych flakonach

- 4 ml pożywki RPMI z 1 ml płodowej surowicy cielęcej lub surowicy AB

- mitogen np. LF-7 (mukoproteina z wyciągu z fasoli), PHA - fitohemaglutynina (0,2 ml)

- antybiotyk

- krew

Mitogen dodajemy w zależności od rodzaju białaczki

Warunki hodowli: 37 st.C, 5% CO2, 24 - 72 h, wilgotność. Na 1,15 h przed zakończeniem hodowli dodajemy kolcemid, aby zahamować powstawanie wrzeciona kariokinetycznego.

3. zahamowanie hodowli i opracowanie:

- odwirowanie 1500 obr/min przez 10 min

- supernatant odlewamy, ważny jest osad; komórki muszą pęknąć

- szok hipotoniczny (0,075 M KCl, 37 st.C): 40 min - szpik kostny, 30 min - krew

- odwirowanie 1500 obr/min przez 10 min

- 3x utrwalanie w mieszaninie metanol : lodowaty kwas octowy w stosunku 3 : 1 (4 st.C, I utrwalacz - 30 min, II i III - 15 min)

Materiał taki kładziemy na szkiełko i szukamy metafaz. Ważne, aby uzyskać chromosomy o dużej rozdzielczości prążkowej (400, 550 lub 1250).

Metody otrzymywania chromosomów większej rozdzielczości w stadium profazy i prometafazy:

1. naturalna - wyszukiwanie metafaz profazalnych i prometafazalnych

2. zapobieganie spiralizacji przez dodanie substancji interkalujących (bromek etydyny, aktynomycyna D), które hamują kondensację.

3. zablokowanie cyklu komórkowego przejściu G1-S - najczęściej stosowany metotreksat; synchronizacja hodowli za pomocą ametopteryny lub tymidyny w celu zwiększenia w hodowli liczby komórek w stadium profazy i wczesnej metafazy.

Techniki prążkowe - umożliwiają precyzyjną identyfikację każdego chromosomu, identyfikację brakującego lub dodatkowego materiału chromosomowego(o wielkości co najmniej 4Mb), wybarwienie konkretnych fragmentów:

- GTG (prążki G, trypsyna, Giemsa) - najczęściej stos. do oceny kariotypu ,tą metodą uzyskuje się 300-400 prążków ciemnych i jasnych charakterystyczne dla każdej pary chrom. Prążki ciemne zawierają skondensowaną chromatynę = heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą w pary zasad A-T, zawierającą stos. mało aktywnych genów. Jest to obszar wolnoreplikujący (replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów, dużo par C-G, obszary te replikują się wcześnie. Aby widoczne były mutacje musi być min. 400 prążków na kariotyp. W profazie i prometafazie rozdzielczość jest max.(występuje Ok. 500-850 prążków na kariotyp-możliwe jest stwierdzenie mikromutacji).

- GTW (pr.G, trypsyna, b.Wrighta)

- CBG (prążki C, Ba(OH)2, Giemsa) - Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną (występuje ona w centromerach wszystkich chromosomów, w okolicach satelitarnych chromosomów akrocentrycznych-13,14,15,21,22, na końcu ramienia długiego chromosomu Y); dotyczy chromosómów 1,9,16

- QFQ (pr.Q, fluorochrom, quinakryna) - wybarwiają się okolica centromeru chromosomu 3, okolica centromeru i regionu satelitarnego chromosomów akrocentrycznych 13, 14, 15, 21, 22 oraz odcinki dystalnej ramion długich chromosomu Y

- RHG (pr.R, hydroliza na ciepło, Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG, metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.

- AgNOR - organizatory jąderkowe traktowane azotanem srebra; stosowane przy białaczkach, bo występuje duża proliferacja i duże organizatory jąderkowe

Technika GTG - jeden chromosom z pary jest dłuższy i ma mniejszą odległości między prążkami (osoba zdrowa). Przy chromosomie 1, 9, 16 i akrocentrycznych może dojść do bloku heterochromatyny i wtedy należy wykonać CBG.

Kariogram - zestaw poukładanych parami chromosomów

Grupy chromosomów:

A - 1, 2, 3 - duże metacentryczne

B - 4, 5 - duże submetacentryczne

C - 6 - 12, X - średnie submetacentryczne

D - 13 - 15 - duże akrocentryczne

E - 16 - 18 - małe submetacentryczne

F - 19 - 20 - najmniejsze submetacentryczne

G - 21 - 22, Y - małe akrocentryczne

Chromosom Y- heterochromatyna w długich ramionach

ABERRACJE CHROMOSOMOWE

Aberracje - zaburzenia w liczbie lub strukturze chromosomów; mutacje materiału genetycznego widoczne pod mikroskopem świetlnym (najmniejszy widoczny dodatek lub delecja wynosi ok. 0,13%, czyli 4 mln pz), do aberracji może dochodzić spontanicznie lub pod wpływem działania czynników mutagennych takich jak :promieniowanie UV, jonizacja, wysoka temperatura i inne.

- liczbowe (nieprawidłowa liczba chromosomów)

* aneuploidia - 2n - 1, 2n +1 (złe rozchodzenie się chromosomów = nondysjunkcja)

* poliploidie - 3n, 4n; powstają: z zapłodnienia komórki jajowej przez 2 lub więcej plemników, zaburzenia podziału zygoty, zaburzenia podziału dojrzałego jaja lub plemnika i powstanie gamety diploidalnej;

- strukturalne (komórki somatyczne zawierają jeden lub więcej chromosomów nieprawidłowych; mogą dotyczyć autosomów lub chromosomów płci):

* zrównoważone - nie ma zmiany w ilości materiału genetycznego, np. translokacja wzajemna, inwersja; skutki nie zawsze są widoczne: zmiana ramki odczytu; są przyczyną powstawania w mejozie gamet z nieprawidłowym zestawem chromosomów. Może być przekazana na następne pokolenie jako zrównoważona lub niezrównoważona

* niezrównoważone - zwiększenie materiału, np. duplikacja, addycja lub ubytek - delecje; skutki fenotypowe są widoczne

1. Aberracje strukturalne

a) Translokacje - przemieszczenie materiału pomiędzy chromosomami:

- wzajemne - wymiana materiału między 2 chromosomami np. t(8;22)(q34;q11); powstaje w wyniku złamań chromosomów niehomologicznych lub przez przypadkową rekombinacje między chromosomami podczas mejozy

- robertsonowskie = fuzje centryczne; dotyczy chromosomów akrocentrycznych grupy D i G, w których złamanie następuje w centromerze lub blisko niego; powstaje chromosom z 2 centromerami; krótkie ramiona zawierające nieczynną genetycznie heterochromatynę są eliminowane

- insercje - jeden chromosom ma 2 pęknięcia, a drugi jedno, np. ins(6;18)(q21-22;q221)

b) Inwersje - chromosom pęka w dwóch miejscach i dochodzi do odwrócenia materiału genetycznego 180 st

- paracentryczne - złamanie w obrębie jednego ramienia np. inv(6)(q25;q31)

- pericentryczne - złamanie w obrębie dwóch ramion łącznie centromerem np. inv(6)(p22;q31)

Duplikacje - podwojenie fragmentu chromosomu np. dup(6p)

Chromosom kolisty - powstaje przez delecję części terminalnej ramiona krótkiego bądź długiego „lepkie” końce, które łączą się; układa prążków jest zachowany; są one niestabilne i w czasie podziału powstaje chromosom dicentryczny

Izochromosom - powstaje w wyniku poprzecznego podziału centromeru; duplikacja jednego ramienia i delecja drugiego; skutki fenotypowe: najczęściej ilościowe zmiany letalne np. i(X)(p10) oraz i(X)(q10)

Chromosomy markerowe - pochodzenie i mechanizm powstawania jest nieznany. Najczęściej jest to chromosom akrocentryczne lub metacentryczne.

Addycja - dodatkowy materiał chromosomowy nieznanego pochodzenia np. add(19)(p13)

Chromosom pochodny - znane są okolice i centromer danego chromosomu der(6)t(6;18)

c) Delecje - utrata fragmentu chromosomu

- terminalna - złamanie w części dystalnej chromosomu np. del(6)(q34)

- interstycjalna - podwójne złamanie np. del(6)(q25;q34)

- chromosom pierścieniowy - 2 delecje terminalne -> powstają lepkie końce, które łączą się

- mikrodelecje - utrata fragmentu, którego wielkość zbliżona jest do granicy rozdzielczości mikroskopii świetlnej. Można je wykryć za pomocą specjalnych technik biologii molekularnej.

Jeżeli aberracja chromosomowa obecna jest we wszystkich komórkach somatycznych, mówimy wówczas o homogenności.

Mogą jednak istnieć różne linie komórkowe - z aberracja i bez, nazywamy to mozaikowością.

Może mieć również miejsce mozaikowatość gonadalna -> komórki somatyczne i gonady mają różny kariotyp

FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITHU (FISH)

FISH łączy w sobie elementy cytogenetyki klasycznej i metod molekularnych.

Zasada metody: hybrydyzacja polega na tworzeniu dwuniciowych kompleksów między sondą molekularną a badanym jednoniciowym fragmentem DNA lub RNA (zgodnie z zasadą komplementarności).

fragm. DNA znakowany i doprowadzany do formy 1- niciowej przez ogrzanie i gwałtowne ochłodzenie → nakładany na wysuszone powietrzem, zdenaturowane preparaty chromosomów → przyłączona do odpowiadających jej w chromosomie sekwencji sonda molekularna widoczna w mikroskopie.

Metoda mapowania sklonowanych sekwencji DNA stos. standartowo, wynik 1-2 dni!

Znakowanie nieizotopowe oparte na wbudowywaniu biotyny do sondy DNA. Miejsce hybrydyzacji wykrywane przy użyciu antybiotyny (streptawidyny) sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym. Kompleks analizowany w mikroskopie fluorescencyjnym zhybrydyzowane sekwencje musza być odlegle od siebie o min. 1 Mb.(chromosomy metafazowe) większa rozdzielczość metody przy użyciu mniej skondensowanych chromosomów w jądrach interfazowych (tu możliwe rozróżnienie sygnałów odległych o 50-100 kb), jeszcze większa rozdzielczość w met. gdzie włókna chromatynowe uwalniane są ze szkieletu białkowego (fiberFISH) tu możliwe rozróżnienie sekwencji odległych o mniej niż 10 kb.

Sonda molekularna - fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów jest specyficzna względem badanego regionu. Sondą może być:

- syntetyczny lub naturalny gen lub jego fragment

- syntetyczny oligonukleotyd

- cDNA

- fragment chromosomu

- fragment genomowego DNA

Metody otrzymywania sond:

- klonowanie odpowiedniego fragmentu DNA

- synteza chemiczna (20 - 50 pz)

- sondy złożone otrzymuje się przez klonowanie całego chromosomu, cięcie go enzymami restrykcyjnymi, elektroforeza, denaturacja

Fluorochrom- rodamina barwnik czerwony, FITC zielony, czerwień Texasu czerwony, DAPi niebieski

FISH - metainterfazalny

• materiał po hodowli, rozmaz krwi lub szpik kostny, musi być utwardzony

• szkiełko odtłuszczone

• chromosomy nie mogą być w cytoplazmie, utrudniona jest penetracja sondy

• materiał nie może być zbyt gęsto i zbyt rzadko naniesiony na szkiełko

Etapy hybrydyzacji:1.Sporządzanie i wyznakowanie sondy; 2. Przygotowanie preparatu; 3. Denaturacja sondy i preparatu; 4. Hybrydyzacja

Etapy:

1. materiał na szkiełko

2. dehydratacja szkiełka (alkohol)

3. nałożenie sondy

4. zaklejenie szkiełka klejem

5. denaturacja materiału i sondy

6. hybrydyzacja w 37st, 12h, ciemność

7. odpłukiwanie

8. nałożenie PAPi

9. detekcja sondy

10. analiza

1. mikroskop fluorescencyjny

2. źródło promieniowania- lampa rtęciowa

3. zestaw filtrów

4. aparat cyfrowy lub system komputerowy

Sondy

1. specyficzne (unikatowe)

2. złożone (malujące) dla całego chromosomu lub ramienia

3. komplementarne do sekwencji powtórzonych

Typy sond molekularnych:

Ad. A

- do identyfikacji mikrodelecji

- geny fuzyjne

- submikroskopowe aberracje

- w czasie metafazy i oraz jądra interfazowe

- fuzje genowe - analizuje się przy białaczkach - 95% pacjentów z CML ma t(9;22)(q34;q11) z fuzją genową BCR/ABL1 (tzw. PH) i ABL1/BCR (9q+)

- identyfikacja pewnych genów istotnych w rozwoju nowotworów

Mikrodelecje zespoły:

- Williamsa 7q11.23

- DiGoerga 22q11.2

- Millera Diekera 17p13.3

- Cri Du chat sp15

- Retinoblastoma 13q14

- Pradego-Willera/ Angelmana 15q12

Ad. B

• w czasie mateafazy

• chromosomy markerowe

• dodatkowy materiał chromosomowy

• złożone lub ukryte translokacje

• aneuploidie

• zaburzenia ilości chromosomów płci

- zastosowanie do translokacji wzajemnych, translokacji złożonych - 3 lub więcej chr

- M FISH = Mulitcolor FISH - różne kolory dla każdej pary

Ad. C

• w czasie metafazy oraz jądra interfazowe

• centromerowe- α satelitarne DNA komplementarne do tandemowych powtórzeń (171 pz)

• telomerowe- komplementarne do telomerów składających się z krótkich sekwencji powtarzalnych

• komplementarne do heterochromosomów konstytutywnych

- wykorzystuje się je przy przeszczepach, w celu sprawdzenia jak się przyjęły, gdy dawca i biorca różnili się płcią = chimeryzm przeszczepowy)

Zastosowanie sond i FISH'a:

- wykrywanie addycji chromosomowych nieznanego pochodzenia

- identyfikacja chromosomów markerowych

- wyjaśnienie charakteru translokacji złożonych

- wykrycie mikrodelecji

- wyjaśnienie złożonych aberracji struktury

- identyfikacja aberracji liczbowych

- badanie struktury i organizacji chromosomów (mapowanie i ekspresja genów)

CHOROBY MONOGENOWE

CELE ANALIZY GENETYCZNYCH UWARUNKOWAŃ DOBROSTANU CIĄŻY

• Ocena ryzyka wystąpienia u płodu:

- chorób uwarunkowanych genetycznie

- wad rozwojowych

• Wyodrębnienie ciąż wysokiego ryzyka i rozpoznanie patologii genetycznych; współudział w kształtowaniu dalszych decyzji diagnostycznych i leczniczych

• Określenie ryzyka genetycznego dla następnej ciąży

RYZYKO GENETYCZNE

• Jest oceniane jako prawdopodobieństwo wystąpienia zdefiniowanego zaburzenia

• Powinno być ocenione ilościowo

• Dotyczy zawsze określonej pary

MAŁE < 5 %

TEORETYCZNE : WYLICZONE Z PRAW

MENDLA DLA CH. JEDNOGENOWYCH,

RODZINNYCH ABERRACJI STRUKTURALNYCH CHROMOSOMÓW

ŚREDNIE 5 - 10 %

ZMODYFIKOWANE: jw. Z UWZGLĘDNIENIEM

DODAT KOWYCH POPRAWEK

DUŻE > 10 %

EMPIRYCZNE : Z OBSERWACJI POPULACYJNYCH, DLA CH. WIELOGENOWYCH, ABERRACJI LICZBOWYCH CHROMOSOMÓW, ZESPOŁÓW WAD

TEORETYCZNE:

- wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych

- rodzinnych aberracji strukturalnych chromosomów

- zmodyfikowane: jw. z uwzględnieniem

dodatkowych poprawek

EMPIRYCZNE:

- z obserwacji populacyjnych, dla chorób wielogenowych, aberracji liczbowych chromosomów, zespołów wad

TECHNIKI DIAGNOSTYKI GENETYCZNEJ

• Analiza rodowodowo - kliniczna

Dane o zachorowaniach, utratach ciąż, niepłodności w zakresie wszystkich krewnych I°, wsparte dokumentacją lekarską, fotograficzną itp. Weryfikacja charakteru dziedziczenia; niekiedy może być nietypowy w określonej rodzinie. Taki sam fenotyp może wynikać z różnych uwarunkowań. Zapis symboliczny umożliwia lepszą orientację w uwarunkowaniach.

• Analiza fenotypu

• Analizy laboratoryjne

- diagnostyka cytogenetyczna

• diagnostyka molekularna DNA i RNA

• diagnostyka biochemiczna

Dziedziczenia autosomalne dominujące i recesywne

• Wg Mc Kusicka z roku 2000 - 11 000 chorób monogenowych

• - 10671 cechy zlokalizowane na autosomach

• - 624 na chromosomie X

• - cechy monogenowe - cechy mendlowskie

• * zasady segregacji

• * zasady niezależnego doboru

Prawa Mendla

Zasada segregacji: organizmy rozmnażające się w sposób płciowy posiadają geny, które występują parami, ale tylko jeden gen danej pary jest przekazywany potomstwu.

Zasada niezależnego doboru: geny zlokalizowane w różnych loci są przekazywane kolejnym pokoleniom niezależnie.

PRAWDOPODOBIEŃSTWO GENETYCZNE

PRAWDOPODOBIEŃSTWO jest to procentowa możliwość wystąpienia danego wyniku w serii zdarzeń

Genotyp - genetyczna budowa jednostki w badanym locus.
Fenotyp - rzeczywisty obraz fizyczny lub kliniczny danej jednostki. Jest wynikiem współdziałania pomiędzy genotypem i czynnikami środowiskowymi.
Rodowód - określa związki pomiędzy członkami rodzin i pokazuje, którzy z nich są dotknięci chorobą genetyczną, a którzy nie.

Dziedziczenie autosomalne dominujące

• 1/200 osób

• chory rodzic może przekazać swoim dzieciom gen „zdrowy” lub „chory”

• prawdopodobieństwo - 1/2

• - osobnicy obu płci wykazują cechę chorobową w równych proporcjach

• - dana cecha pojawia się w każdym pokoleniu (pionowy schemat przekazywania choroby)

• chora heterozygota przekazuje cechę połowie swoich dzieci

CHOROBY JEDNOGENOWE AUTOSOMALNE DOMINUJĄCE- PENETRACJA GENU

• manifestuje się „w pionie” niezależnie od płci, niekiedy częste mutacje de novo ( wtedy izolowana, ryzyko rośnie z wiekiem ojca), ale zwykle wywiad dodatni ryzyko rzeczywiste zwykle mniejsze od teoretycznego ze względu na niższą penetrację i ekspresję mutacji

• ekspresja zależna od genów modyfikujących i środowiska, penetracja od charakterystyki mutacji

• niekiedy homozygoty nie przeżywają do terminu porodu

• Zróżnicowany obraz choroby

• Wpływ na ekspresje genu ma środowisko

• Zjawisko „luki genetycznej” osoba bez objawów jest nosicielem

Defekty białek strukturalnych, Predyspozycje do nowotworów, Fakomatozy, Pląsawica Huntingtona,

PKD, Otoskleroza i in

Dziedziczenie autosomalne recesywne

• rodzice osób chorych na choroby recesywne to heterozygotyczni nosiciele

• 1/4 potomstwa będzie zdrowymi homozygotami, 1/2 fenotypowo zdrowymi heterozygotami, 1/4 homozygotami, u których wystąpi choroba

• Choroby występują u jednego lub kilku członków rodzeństwa, ale nie we wcześniejszych pokoleniach

• mężczyźni i kobiety chorują w równych proporcjach

• średnio 1/4 potomstwa dwóch heterozygotycznych nosicieli będzie dotknięta chorobą

• najczęściej choroba ujawnia się w związkach pokrewieństwa (większe prawdopodobieństwo posiadania wspólnych genów)

Choroby a. recesywne:

• choroba manifestuje się „w poziomie”,

• wywiad rodzinny często ujemny

• występuje równie często u obu płci, częstsze w małżeństwach krewniaczych ryzyko zmodyfikowane zwykle równe teoretycznemu często możliwa identyfikacja nosicieli

Mukowiscydoza, Bloki metaboliczne, Retinitis, Defekty reparacji DNA, SLO, Immunodeficyty i in.

CHOROBY SPRZĘŻONE Z X

• manifestują się w pionie współwystępując zazwyczaj z płcią

• mogą być dziedziczone recesywnie lub dominująco

• recesywny mogą manifestować się u kobiet (homozygota, delecje X),

• u kobiet obligatoryjne nosicielstwo, mozaikowość somatyczna

• dominujące manifestują się u kobiet i mężczyzn, męskie hemizygoty i żeńskie homozygoty niekiedy nie dożywają do terminu porodu

Hemofile A i B, DMD/BMD, AIS, FRA-X, nsXMR, SMA, Retinitis, Alport S., OFDS, Incontinentia pignenti, Krzywica oporna na vit D

NIETYPOWE CHOROBY JEDNOGENOWE

• CHOROBY SPRZĘŻONE Z CHROMOSOMEM Y: TYLKO W LINII MĘSKIEJ, DEFEKTY SPERMATOGENEZY,

• MUTACJE GENOMU MITOCHONDRIALNEGO: DZIEDZICZENIE MATCZYNE

• MUTACJE DYNAMICZNE: ANTYCYPACJA, w dziedziczeniu dominuje zwielokrotnienie 3 nukleotydów, objawy po przekroczeniu krytycznej ilości powtórzeń, w każdym kolejnym pokoleniu ujawnia się szybciej i jej przebieg jest cięższy

Np. Pląsawica Huntingtona, zespół łamliwego chromosomu X

DZIEDZICZENIE WIELOGENOWE, WIELOCZYNNIKOWE

Dziedziczenie wielogenowe - odnosi się do tych procesów, w których choroba lub wada jest rezultatem sumującego się efektu działania jednego lub wielu genów i czynników środowiskowych

KRYTERIA DZIEDZICZENIA WIELKOCZYNNIKOWEGO:

• Istnieje podobna wielkość ryzyka powtórnego wystąpienia choroby (zwykle 2-10%) u krewnych I stopnia

• I dziecko z rozszczepem podniebienia - ryzyko powtórzenia dla kolejnego dziecka 4%

• Rozszczep podniebienia u jednego z rodziców - ryzyko dla dziecka 4%

• Niektóre choroby wykazują szczególną zależność od płci

• Wrodzone zwężenie odźwiernika - częściej u chłopców

• Wrodzone zwichnięcie stawów biodrowych - częściej u dziewczynek

• Ryzyko powtórzenia się choroby w rodzinie spada gwałtownie w miare oddalania się pokrewieństwa względem osoby chorej

• Ryzyko powtórzenia się rozszczepu wargi dla kuzynostwa - 0,5%

• ryzyko wystąpienia wady u dziecka urodzonego z kolejnej ciąży zależy od tego, czy wada wystąpiła u dzieci z ciąż poprzednich

• Ryzyko ponownego urodzenia dziecka z rozszczepem wargi i podniebienia wynosi 4%, jeśli rodzice już mają dziecko z ta wadą

• 9% - po urodzeniu dwojga dzieci z tą wadą

• ryzyko wystąpienia wady u kolejnego potomstwa zależy od ciężkości wady

• Gdy dziecko ma wrodzony brak unerwienia błony śluzowej długiego odcinka jelita grubego, istnieje większe ryzyko, że wada ta wystąpi u kolejnego rodzeństwa, niż wtedy, gdy wada dotyczy niewielkiego odcinka jelita

• dziedziczenie wieloczynnikowe jest rozpoznawane po wykluczeniu innych typów dziedziczenia

Czynniki teratogenne:

Endogenne: WRT

Egzogenne: biologiczne, chemiczne i fizyczne

Teoretyczna częstość występowania samoistnych mutacji dla jedne generacji kom 10 do 7 na gen. Zmiany dotyczą wszystkich poziomów- chromosomy, geny, nukleotydy, częstość mutacji nawet 1000x

Konsekwencje biologicznych mutacji dotyczą pojedynczej kom lub całego organizmu

Mutacje może spowodować- zanik cyklu komórkowego, „kom drzemiąca” która ponownie może wejść do cyklu po zadziałaniu promotorów

Mutagenoza- mutacja kom rozrodczych

Kancerogenoza- transformacje nowotworowe, somatyczne

Teratogeneza- indukcja wad wrodzonych, uszkodzenie zarodka

Uszkodzenie kom płciowych:

- zmalenie płodności

- poronienia

-dziecko z aberracjami, chorobą nowotworową

Uszkodzenie somatyczne:

- okres prenatalny: przed, w trakcie i po (teratogeneza) organogenezie

- okres postnatalny (wpływ rakowiczy), indukcja transformacji nowotworowej

Karcogeneza:

- indukcja

-promocja

-progresja

Proces transformacji nowotworowej wynika z kumulacji zmian: genetycznych i epigenetycznych.

Zależność między wzrostem narażenia a ryzykiem indukcji procesów nowotworowych jest: BEZPROGOWA i LINOWA.

Wzrost narażenia nie jest równe ciężkości przebiegu.

Teratogen:

- zarodek lub płód

-zaburzenie podziału lun funkcji kom

- tworzenie się i rozwój narządów u płodu

Efekt teratogenny to skutek uszkodzenia wielu kom:

-zmiana ekspresji genów

-zaburzenia apoptozy

-zaburzenia migracji

-zaburzenia poliferacji

-zaburzenia syntezy i funkcji białek

-zaburzenia produkcji energii

Zmiany:

1. anatomiczne (dysplazje, malformacje, deformacje, dystrupcje)

2. funkcjonalne (ślepota, głuchota, upośledzenie rozwoju umysłowego)

Talidomid- fokomelia, blokuje IGF-1 i FGF-2, które są odpowiedzialne za regulacje transkrypcji, podjednostki av i β3 integryn stymulujących angigeneze w kończynach. Sekwencje promotorowe genów IGF-1 i FGF-1 oraz av i β3 nie posiadają sekwencji TATA, ale sekwencje powtarzalne GG.

Kw rehineidowy- reguluje wzrost szkieletu, RARs oraz RXRs, zaburzenia w syntezie RARs zaburzają proces tworzenia chrząstek

Nikotyna - wzrost ekspresji c-fosforanów, indukuje apoptozę prawidłowych kom prowadzi do zaburzenia procesów różnicowania kom neuronalnych.

Wady wywołane są przez teratogenny:

- toksoplazma

- różyczka

- ospa wietrzna

- alkohol etylowy

- talidomid

Efekt dawki- po przekroczeniu jest wzrost wystąpienia i ciężkości uszkodzeń płodu

Promienie jonizujące:

-uszkodzenie OUN 10-100 radów

-białaczki wieku dziecięcego, 3,5% populacji a w wieku 1-2 aż 5%

Genopatie- na komórki rozrodcze przed zapłodnieniem

Blastopatie- uszkodzenie zapłodnionej komórki do 14 dnia po zapłodnieniu, zasada „wszystko albo nic”

Embriopatie- 14-60 dzień po zapłodnieniu

Fetopatie- po 60 dniu od zapłodnienia (śmierć, zaburzenie funkcjonowania, upośledzenie wzrostu, dysfunkcja OUN)

-poronienie

-opóźniony rozwój płodu

-przedwczesne porody

-wzrost śmiertelności

Wady budowy ciała

• Malformacje - wady rozwojowe narządu lub części ciała powstające w wyniku zaburzenia ich rozwoju w pierwszym trymestrze ciąży, co prowadzi do niepewnej lub nieprawidłowej morfogenezy

• Deformacje - nieprawidłowości budowy, kształtu lub ułożenia jakiejś części ciała spowodowanych jej uciskiem wewnątrz macicy

• Dystrupcje - wady wynikające z zaburzenia prawidłowego dotychczas rozwoju danego układu lub narządu

1. DEFORMACJE

• wady powstające zwykle w III trymestrze ciąży pod wpływem czynników mechanicznych

• Przyczyny:

• wady rozwojowe macicy, np. macica dwurożna

• mała macica

• mała miednica

• guzy macicy (mięśniaki, włókniaki)

• małowodzie

• nieprawidłowe ułożenie płodu

• choroby ograniczające możliwości poruszania się płodu - zaburzenia neurologiczne, pierwotne choroby mięśni, wady stawów

• zdeformowaniu ulegają najczęściej kości, stawy i chrząstki

• po urodzeniu - widoczne w postaci:

- skręcenia lub skrzywienia kości

- ograniczenia ruchomości stawów

- spłaszczenia nosa i uszu

• większość deformacji podlega samoistnemu odkształceniu w ciągu kilku miesięcy lub lat

• sekwencja deformacyjna - gdy ucisk mechaniczny wywołuje wiele deformacji, np. sekwencja Potter

SEKWENCJA POTTER:

• agenezja nerek

• małowodzie

• ucisk wewnątrzmaciczny :

- deformacje wygięciowe kończyn

- przykurcze stawowe

- „twarz Potter”

Zespół Crouzona

• najczęstsza kraniosynostoza

• charakteryzuje się przedwczesnym zarośnięciem szwów wieńcowych i hipoplazja środkowej części twarzy z uwypukleniem czoła

• początek w 1 rż

• zarośnięcie szwów - 3rż

• spłycenie oczodołów

• uwypuklenie gałek ocznych

• przewlekłe zapalenia spojówek i rogówek

• niedosłuch przewodzeniowy

• nie stwierdza się wad kończyn

• AD

• mutacje FGFR2

Zespół Aperta (acrocephalosyndaktylia)

• zaburzenie zarastania wszystkich szwów czaszkowych, poza szwem węgłowym

• wysoka czaszka ze zmniejszonym wymiarem przednio-tylnym

• płaska środkowa część twarzy

• wyraźnie zaznaczone bruzdy nadoczodołowe

• płytkie oczodoły

• skośno-dolne ustawienie szpar powiekowych

• syndaktylia „rękawicowa” (2,3 i 4 palca)

• bloki kostne kręgów szyjnych

• opóźnienie rozwoju psychoruchowego - u większości

• AD

• mutacje FGFR2

Zespół Pfeiffera

• charakterystyczna - kranosynostoza szwu wieńcowego , niekiedy - strzałkowego

• brachycefalia

• wysokie czoło

• hiperteloryzm

• mały nos z pogłębioną nasadą

• szerokie kciuki i paluchy

• częściowa syndaktylia 2 i 3 palców dłoni oraz 2,3 i 4 palców stóp

2. PRZERWANIA (disruptio)

• są wadami morfologicznymi wynikającymi z przerwania lub zakłócenia pierwotnie prawidłowego procesu rozwojowego

• w przeciwieństwie do deformacji - nie sa wyłącznie skutkiem działania sił mechanicznych, ale mogą być wywołane przez niedokrwienie, wylew krwi lub zrosty tkankowe

• mogą być skutkiem działania czynnika teratogennego lub pojawiać się z nieznanej przyczyny

• występują sporadycznie ( w przeciwieństwie do deformacji, malformacji i dysplazji)

• sekwencja przerwania - jeśli czynnik wywołujący przerwanie powoduje wiele defektów

ZESPÓŁ PASM OWODNIOWYCH

• przerwanie dotyczy różnych tkanek

• lokalizacja uszkodzenia nie odpowiada określonym granicom anatomicznym embriogenezy

3. MALFORMACJE

• są to zmiany wywołane przez pierwotne zaburzenie rozwoju w okresie zarodkowym

• charakteryzują się trwałymi wadami budowy

• im później powstaje defekt, tym prostsza jest malformacja

• mogą być wywoływane przez 3 typy zaburzeń morfogenezy:

- niecałkowita (najczęściej)

- nadmierna

- ektopiczna

• malformacje:

- ograniczone

- zespół malformacyjny ze zmianami w wielu układach

4. DYSPLAZJE

• są to stany, w których nieprawidłowa organizacja lub czynność komórek określonej tkanki ustroju prowadzą do zmian budowy ujawniających się klinicznie

• większość dysplazji - choroby monogenowe:

• dysplazje kostne

• dysplazje ektodermalne

• wrodzone defekty kolagenu

• choroby spichrzeniowe

• wyjątkiem dysplazji niegenetycznego pochodzenia - odpryskowce (hamartoma), t.j. naczyniaki i znamiona

• zmiany dysplastyczne mogą nasilać się przez całe życie

DYSPLAZJA TANATOFORYCZNA

• znacznego stopnia skrócenie kończyn

• wąska, „gruszkowata” klatka piersiowa

• hipotonia mięśniowa

• brak odruchów ścięgnistych

• wypukłe czoło, płaska nasada nosa, wytrzeszcz gałek ocznych

• deformacja czaszki w kształcie liścia koniczyny (Kleeblattschadel)

ACHONDROPLAZJA:

• skrócenie odcinków bliższych kończyn

• duża głowa z wydatnymi guzami czołowymi, niedorozwojem szczęk i prognacją żuchwy

• niski wzrost

• krótkie i szerokie dłonie

• opóźnienie rozwoju motorycznego

ZESPÓŁ MARFANA:

• arachnodaktylia

• szczupła sylwetka

• klatka piersiowa szewska lub kurza

• skolioza, lordoza piersiowa

• gotyckie podniebienie

• zwichnięcie soczewek, krótkowzroczność, ew. niebieskie twardówki

• wypadanie płatka zastawki dwudzielnej/niedomykalność

• poszerzenie części wstępującej aorty/rozwarstwienie aorty

TYPY WAD WRODZONYCH:

WADY DUŻE

• Wady, które upośledzają czynność ustroju lub skracają życie, np. zespół Downa, rozszczep wargi, zaćma, przerostowe zwężenie odźwiernika

• 2-3% noworodków

WADY MAŁE (anomalie)

• z reguły mają znaczenie kosmetyczne

• są pomocne w rozpoznawaniu zespołów, mogą być wskazówką, że istnieją inne, większe zaburzenia morfogenez

• większość małych wad to malformacje

• występują najczęściej na obszarach o złożonej budowie, t.j twarz, dłonie

Przykłady małych anomalii:

• wyrośla na kości potylicznej

• dołki, wyrośla przeduszne

• hiperteloryzm

• różnobarwność tęczówek, ubytek tęczówek

• zmarszczka nakątna

• rozdwojony języczek

• klinodaktylia V palca, syndaktylia

• pojedyncza bruzda zgięciowa dłoni

• dodatkowe wiry włosów

• biały kosmyk

• plamy „cafe au lait”

• spodziectwo

SKOJARZENIA WAD WRODZONYCH

• są to nielosowe połączenia wad, których poszczególne składowe występują razem częściej, niż mogłyby występować przypadkowo

• np. skojarzenie VACTERL

• Vartebral anomalies

• Anal atresis

• Cardiac abnormalities

• Tracheo-Esophageal fistula

• Renal abnormalities

• Limb abnormalities

SEKWENCJE WAD

• oznaczają, że jeden podstawowy defekt wywołuje kaskadę zmian strukturalnych, które wydają się nie być ze sobą powiązane

• pierwotny defekt jest najczęściej malformacją

• przykłady:

• sekwencja Pierre-Robin

• sekwencja otwartej wady cewy nerwowej

• sekwencja skąpowodzia (Potter)

SKOJARZENIA WAD WRODZONYCH

• są to nielosowe połączenia wad, których poszczególne składowe występują razem częściej, niż mogłyby występować przypadkowo

• np. skojarzenie VACTERL

• Vartebral anomalies

• Anal atresis

• Cardiac abnormalities

• Tracheo-Esophageal fistula

• Renal abnormalities

• Limb abnormalities

SEKWENCJE WAD

• oznaczają, że jeden podstawowy defekt wywołuje kaskadę zmian strukturalnych, które wydają się nie być ze sobą powiązane

• pierwotny defekt jest najczęściej malformacją

• przykłady:

• sekwencja Pierre-Robin

• sekwencja otwartej wady cewy nerwowej

• sekwencja skąpowodzia (Potter)

---