Ćwiczenie VI 29. 10. 2001

Temat: Metody hodowli i identyfikacji bakterii tlenowych i mikroaerofilnych.

Zapotrzebowanie na tlen:

• bakterie bezwzględnie beztlenowe (tlen działa na nie zabójczo) - w składzie enzymów oksydacyjnych zawierają tylko dehydrogenazę

• bakterie względnie tlenowe (rosną zarówno w warunkach tlenowych jak i w beztlenowych) - w składzie enzymów zawierają dehydrogenazy, katalazy, oksydazy cytochromowe (ale tylko niektóre)

• bakterie bezwzględnie tlenowe (rosną tylko w obecności tlenu) - w składzie enzymów zawierają dehydrogenazy, katalazy, oksydazy, peroksydazy

• bakterie mikroaeofilne (do wzrostu potrzebują mniejszej ilości tlenu niż w powietrzu atmosferycznym, stęż. O₂ do 5 %), nie rosną na podłożach stałych w atmosferze tlenowej, w warunkach beztlenowych wzrastają słabo albo wcale np. Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni; optymalny wzrost tych bakterii odbywa się w atmosferze stanowiącej mieszaninę gazów: 5 % O₂, 10 % CO₂, 85 % N₂ (hodowla w generatorach)

Niektóre bakterie potrzebują zwiększonego stężenia CO₂ od 5 - 15 %. Stosuje się generatory do hodowli lub cieplarki z przepływem CO₂. Najprostszy sposób ich wyhodowania to umieszczenie płytki z hodowlą w eksykatorze, zapalenie świeczki i zamknięcie eksykatora np. Neisseria (czynnik etiologiczny rzeżączki), Haemophilus influenze (bakterie kapnofilne).

Hodowla bakterii beztlenowych:

1. metody fizyczne

2. metody fizykochemiczne

3. metody chemiczne

4. metody biologiczne.

Metody fizyczne - hodowla w wysokich słupkach agarowych. Przed posiewem, ogrzaniem podłoża do temperatury 55 stopni C ulega ono upłynnieniu. Schładzamy do temperatury 46 - 48 stopni C i wprowadzamy materiał za pomocą ezy lub pipetą lub też za pomocą wymazówki na samo dno podłoża. Zalewamy podłoże parafiną. Zestalamy przez dalsze ochłodzenie

.

Zagotowanie pożywki (10 - 20 min.), szybko schładzamy pod strumieniem bieżącej zimnej wody. Posiewamy materiał i przykrywamy warstwą jałowej parafiny.

Hodowla w aerostatach - metalowe naczynia z dwoma bocznymi kranami i manometrem. Przez jeden kranik wypompowuje się zawarte w eksykatorze powietrze, poprzez drugi na to miejsce wprowadzany jest gaz - mieszanina N, H i CO₂.

Specjalne podłoża:

• podłoże Wrzoska - podłoże płynne z kawałkami wątroby

• podłoże Hübnera z papką mózgową

• podłoże Wróblewskiego z kłębkami waty

Po posianiu podłoże zalewamy parafiną w celu odcięcia dopływu tlenu.

Metody fizykochemiczne - wykorzystuje się aerostaty, na ich dnie znajdują się substancje pochłanaiające tlen na drodze reakcji chemicznej np. pirogallol i nadtlenek potasu.

Metody chemiczne - tlen ze środowiska usuwa się na drodze chemicznej. Wykorzystywana jest reakcja łączenia się tlenu i wodoru w obecności katalizatora palladowego w wyniku czego powstaje H₂O.

Metody biologiczne:

1. metoda Fortnera - obok materiału badanego, w którym podejrzewamy florę beztlenową, posiew się bakterie bezwzględnie tlenowe (np. Bacillus, Serratia marcesens). Płytkę uszczelniamy plasteliną lub parafiną. W I etapie rosną bakterie tlenowe dopóki obecny jest O₂ w środowisku. Po wyczerpaniu O₂ zaczynają rosnąć bakterie beztlenowe.

2. coraz częściej wykorzystuje się podłoża z tioglikanem sodowym lub kwasem tioglikanowym, podłoża płynne zawierające związki, które obniżają potencjał oksydoredukcyjny umożliwiając wzrost bakterii beztlenowych.

Bakterie beztlenowe:

1. przetrwalnikujące - Gram (+), laseczki z rodzaju Clostridium

2. nieprzetrwalnikujące

• Gram (+) - pałeczki (Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Actinomyces, Lactobacillus), ziarniaki (Peptostraptococcus)

• Gram (-) - pałeczki (Bacteroides, Fuzobacterium, Porferomonas, Prevotella, Volinella, Mobilencus, Megamonas, Leptotrichia, Anaerospinylium, Centipeda), ziarniaki (Veilonella)

Bakterie beztlenowe nieprzetrwalnikujące to flora bakteryjna człowieka - błona śluzowa gardła, nosa, migdałków, także przewodu pokarmowego, dróg moczowo - płciowych. W niektórych miejscach stosunek bakterii beztlenowych do tlenowych u człowieka wynosi 1000:1.

Czynniki predysponujące do zakażeń bakteryjnych to:

• upośledzenie mechanizmów odpornościowych

• przerwanie ciągłości tkanki

• urazy

• inwazyjne metody leczenia (po zabiegach operacyjnych)

• długotrwała antybiotykoterapia (zmiany ilościowe i jakościowe mikroflory człowieka na korzyść bakterii beztlenowych).

Zakażenia endogenne - bakterie beztlenowe.

Zakażenia egzogenne - zakażenia szpitalne.

Zakażenia endogenne - w obrębie miejsc naturalnego bytowania (zakażenia stomatologiczne - czynnik próchnicy, zapaleń przyzębia, ropnych zakażeń w obrębie jamy ustnej - ropnie okołozębowe).

Przyczyny przewlekłego zapalenia zatok i ucha środkowego, zakażenia oczu, zakrzepowe zapalenie żył, ropnie narządów wewnętrznych, płuc, wątroby, zapalenie jajników, otrzewnej, wyrostka robaczkowego. Mogą być przyczyną patologii ciąży, zakażenia skóry i tkanek miękkich, ropnych zapaleń stawów, kości i szpiku.

Materiały badane:

• ropnie (ropnie głębokie - materiał pobrany igłą i strzykawką, po pobraniu igła zgięta lub zatkana, by nie było dopływu tlenu; ropnie powierzchniowe - wymazówka z dna zmiany ropnej) - transport w podłożu transportowym lub w próbówce z trioglikolanem

• płyny ustrojowe (nie powinien być pobierany mocz ze środkowego strumienia, ale nakłucie pęcherza)

• kał - przy zakażeniu Clostridium

• górne drogi oddechowe (aspiraty przedtchawiczne) lub materiały bezpostaciowe z płuc (bronchoskopia).

Preparaty z pobranych materiałów barwi się metodą Grama. Wykonuje się odczyn immunofluorescencji bezpośredniej. Przy wysiękach i płynach ustrojowych - chromatografia gazowo - cieczowa.

Podłożą hodowlane:

• nieselektywne

• selektywne

• specjalne

Podłoża nieselektywne - najczęściej agar tryptozono - sojowy (TSA) lub podłoże z krwią (5 % krwi króliczej lub baraniej z dodatkiem L- cystyny, wyciągu drożdżowego, witaminy K₁ i treniny).

Podłoża selektywne - podłoże KV (kanamycyna i vankomycyna) - selektywne dla Bacteroides, Fusobacterium i Veilonella; podłoże PV (paramomycyna i vankomycyna) - selektywne dla Bacteroides fragilis, Prevotella, Porferomonas, Fusobacterium i Veilonella.

Inkubacja w temperaturze 35 - 37 stopni C przez 48 - 72 h, niektóre nawet do 96 h. Podłoża przetrzymuje się do 14 dni (Actinomyces, Propionibacterium, Eubacterium).

1

---