ĆW.1 KWASY NUKLEINOWE I FUNKCJONOWANIE GENOMU

Biologia molekularna w medycynie:

1. diagnostyka

• choroby dziedziczne

• nowotwory,

• choroby infekcyjne

ustalenie pokrewieństwa, badanie śladów biologicznych

• medycyna sądowa

• transplantologia

• leczenie

• wytwarzanie leków metodami rekombinacji DNA

• klonowanie genów

• biotechnologia

• terapia genowa

• budowa molekularnego podłoża chorób

Synteza nowej nici idzie od 5' do 3' nowej nici a na starej 3' do 5'. Polimeraza przesuwa się tylko w jednym kierunku, a nić opóźniona się zagina i na niej synteza fragmentów Okazaki.

Białka wspomagające replikację:

1. ligazy - tworzenie wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami, łączenie fragmentów Okazaki

SSB - stabilizacja jednoniciowego DNA (single strand binding)

2. helikazy - rozrywanie wiązań wodorowych w dwuniciowym DNA

3. topoizomerazy - relaksacja skręcenia podwójnego helisy

- grupy I - nacinają jedną nić

- grupy II - nacinają obie nici jednocześnie (gyrazy)

koniec replikacji - u prokaryota zakończenie znajduje się naprzeciwko ori

- u eukaryota - na końcu nici

telomery - końcowe odcinki chromosomów, w komórkach somatycznych są krótsze niż w zarodkowych

• nie kodują białek,

• zapobiegają sklejaniu się chromosomów,

• odpowiadają za właściwe umiejscowienie chromosomów w jądrze komórkowym,

• chronią przed skracaniem się informacji kodowanej w chromosomach w kolejnych podziałach komórki.

Telomery: >1000x 5'-TTAGGG-3'

Denaturacja DNA musimy podgrzać do temp 95˚C, wtedy nici się rozplątują.

telomeraza - odwrotna transkryptaza(białko), zawiera matrycę tRNA,(w kom. zróżnicowanych nie działa, chyba że jest to kom. nowotworowa) występuje w:

• kom. embrionalnych

• kom. nowotworowych

• nowotworowym nabłonku

• szpiku

• kom. macierzystych

gen- fragment DNA zawierający informację o sekwencji aminokwasów jednego białka lub rRNA lub tRNA

genom- wszystkie geny danego organizmu

geny nasze nieciągłe introny i eksony (więcej intronów)

sekwencje powtarzające się niekodujące

w genomie człowieka





rozproszone (IRS) tandemowe (satelitarne)



1. krótkie SINES 1. minisatelity

np. Alu, (ok. 280 pz) 10 - 100 pz

2. długie LINES 2. mikrosatelity

np. L1, (6 tys. pz) 1 - 6 pz

W sekwencjach rozproszonych w jednym miejscu jedna kopia, następna kopia sekwencjach w innym miejscu

W sekwencjach tandemowych zgrupowane, w jednym miejscu wiele kopii, kopie sekwencji powtarzających się zblokowane w jednym miejscu 1 za 2 (do ustalenia ojcostwa, identyfikacji osób; są bardzo zmienne w populacji)

Sekwencje tandemowe:

1. powtórzenia seryjne (kopie sekwencji powtarzalnej w jednym locus leżą jedna za drugą)

2. występują w tysiącach loci w całym genomie, w różnych chromosomach

3. nie kodują białek

4. duża zmienność w populacji (różna liczba powtórzeń danego motywu w danym locus)

5. wykorzystywane w diagnostyce i medycynie sądowej.

Minisatelity

• jednostka powtarzająca się ma długość 7 - 100 pz

• powtarza się w jednym locus od 2 do kilkuset razy

• przykład: telomery

Mikrosatelity:

• jednostka powtarzająca się ma długość 1 - 6 pz

• powtarza się w jednym locus od 5 do 100 razy

• najczęściej w sekwencjach flankujących i intronach

• ok. 100 tys. loci w genomie

(CA)_n (A) _n (AAAT)_n n=5-100

Promotor - poprzedza sekwencje kodującą

Gen ulega ekspresji transkrypcja + syntetyzowane białko

Sekwencje regulatorowe:

• promotory

• sekwencje wyciszające (wyciszanie intronów w jądrze dopiero po tym transportowane do cytoplazmy)

• sekwencje wzmacniające

redagowanie drobne zmiany dotyczące pojedynczych nukleotydów, różnią się od wyjściowego DNA

Modyfikacje potranslacyjne:

• fałdowanie białka

• proteolityczne usuwanie peptydów

• przybranie??? przez białko odpowiedniej struktury

• Wycinanie fragmentów

• przyłączanie:

- małej grupy chemicznej (acetylacja, metylacja, fosforylacja)

- łańcucha cukrowego (glikozylacja)

- łańcucha lipidowego (acylacja)

Wpływ mutacji na ekspresje genu:

• brak białka

• mniejsza ilość białka

• nadmierna produkcja białka

• białka skrócone

• białko o zaburzonej funkcji

Mutacje

1. pojedynczy nukleotyd (punktowe)

• delecja, insercja, zmiana nukleotydu na inny

2. fragment DNA (odcinkowe)

• delecja, insercja, duplikacja, inwersja

• ekspansja, dynamiczna (zwielokrotnienie liczby kopii) niestabilnych powtórzeń trójnukleotydowych

1. aberracje chromosomowe

• nieprawidłowa liczba chromosomów

• izochromosom (utworzenie z jednego chromosomu 2: jednego z ramion krótkich i drugiego z ramion długich)

• translokacja (wymiana fragmentów pomiędzy dwoma chromosomami)

• inwersja

• delecja i insercja

• aberracje strukturalne (duże delecje, złamanie i nieprawidłowe połączenie fragmentów chromosomów).

Izochromosom ma dwa ramiona krótkie lub dwa długie.

Efekty mutacji punktowych:

• mutacja „cicha” (niema) - nie wywołuje zmiany aminokwasu w białku

• mutacja zmiany sensu (miss-sens) - kodon prawidłowy zamieniony na inny kodon innego aminokwasu

• nonsens - powstanie kodonu STOP, przedwczesne zatrzymanie translacji

• ominięcie kodonu STOP

Polimorfizm

• Wystepowanie w populacji różnych form allelicznych danego genu / sekwencji.

• Zmienność występująca u co najmniej 1% populacji.

• Nie powoduje (choć może być czynnikiem ryzyka) chorób, żadnych zmian patologicznych.

• Może dotyczyć:

• pojedynczego nukleotydu (SNP, single nukleotide polymorphism)

• fragmentu DNA (np. liczby powtórzeń sekwencji satelitarnych w danym locus)

Enzymy restrykcyjne-wyst. u bakterii, chronią przed obcym materiałem genetycznym (np. przed wirusami) np. EcoRI

G \ AATTC

CTTAA \ G tworzą sie lepkie końce!!!

rekombinacja - wprowadzenie genu do wektora

klonowanie- rekombinacja +wprowadzenie do bakterii i namnożenie, czyli powielenie genu w żywej komórce za pośrednictwem wektora.

przecinamy wektor enzymem restrykcyjnym i łączymy ligają z klonowanym DNA.

Żeby wyizolować fragment DNA z genu to:

• PCR - powielanie genu

• użycie enzymów restrykcyjnych (bakterie je posiadają, niszczą obce DNA np. wirusa po wniknięciu do komórki) tną enzymami restrykcyjnymi:

- lepkie końce

- tępe końce

Ten wycięty gen przez wektor (plazmid, bakteriofag) wprowadzamy do kom.

Bank genów

• trawienie DNA nuklazą restrykcyjną

• wprowadzenie fragmentu DNA do plazmidów

• wprowadzenie wektorów do bakterii

• powstaje biblioteka genowa

ĆW.2. METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ

Cytogenetyka interfazalna - dotyczy chromosomów spoczynkowych. W interfazie chromosomy są niewidoczne, bo zawarte są w rozwiniętej chromatynie. Komórki w organizmie ludzkim większą część czasu przebywają w interfazie. W metafazę przechodzą po to, aby podzielić się na 2 równe części. Komórki interfazowe można również analizować pod względem zachowania się materiału genetycznego, w tym chromatyny odpowiadającej poszczególnym chromosomom.

Hybrydyzacja, zastosowanie w:

• lokalizacja aberracji (chromosom Philadelphia)

• mapowanie genu

• miejsce transkrypcji

• poziom transkrypcji

• infekcja wirusowa

• ekspresja specyficzna

• liczba chromosomów

Schemat hybrydyzacji:

dwuniciowy DNA


denaturacja 100°C lub pH >13

+denaturowana znakowana sonda molekularna (jednoniciowa)

DNA denaturowany (2 jednoniciowe łańcuchy)

Hybrydyzacja:

- denaturacja nici

- przyłączenie wyznakowanej sondy

- detekcja

Hybrydyzacja Southhern:

- cięcie enzymami restrykcyjnymi i rozdział w żelu

- przeniesienie z żelu na błonę nylonową bo żel utrudnia łączenie się sondy

- hybrydyzacja z sondą (denaturacja, łączenie z sondą)

Hybrydyzacja punktowa:

- czy bakterie mają dany gen odporności

- diagnostyka mukowiscydozy (sonda jedna rozpoznaje mutacje, sonda druga sekwencje prawidłową)

Hybrydyzacja FISH fluorescencyjna in situ:

- lokalizowanie genów na chromosomach

- translokacje

- nie trzeba doprowadzać komórki do interfazy (do metafazy)

- identyfikacja chromosomów (np. czy będzie dziewczynka)

- każda sond jest wyznakowała markerem o innej długości fali

- analiza aberacji chromosomów

Najnowsza metoda

Mikrochipy (mikromacierze) - poszukiwanie ekspresji tysięcy genów.

• sondy przyczepiane na płytce

• izolacja mRNA z komórek i przepisywanie na cDNA, bo cDNA jest dużo bardziej stabilna niż mRNA

• cDNA nanosimy na tę płytkę

• tam gdzie znajdują się komplementarne sondy, połączą się one z cDNA

• naświetlamy lampą halogenową i obserwujemy świecenie w odpowiednich miejscach

• wiemy, jakie geny z bad. kom. ulegają ekspresji, jakie nie ulegają

W każdym kwadraciku są odpowiednie sondy do genów, które nas interesują

Zasada metody PCR (cykliczne (25 - 40 krotne) powielenie procesu amplifikacji wybranych sekwencji DNA

1. denaturacja DNA (95°C)

2. swoiste przyłączenie starterów do 3' końcowego amplifikowanego fragmentu (55-70°C)

3. synteza i wydłużanie nowych łańcuchów DNA do miejsc wyznaczonych przez startery (72°C)

Starter - ok. 20 nukleotydowe sekwencje DNA, określa już długość otrzymanego produktu.

Dopiero po trzecim cyklu otrzymujemy konkretne fragmenty, które nas interesują, czyli produkty produktów pożądanej długości (2 takie cząsteczki)

Analiza produktów PCR:

- elektroforeza DNA w żelu agarozowym/poliakrylamidowym (pojawienie się prążka na konkretnej wysokości świadczy, że jest dany fragment)

- identyfikacja zmian w DNA

- mutacji punktowych

Metoda PCR-RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, identyfikacja zmian w DNA:

- mutacji punktowych

- sekwencji powtórzonych

powodujących powstawanie lub zmienianie miejsc trawienia enzymami restrykcyjnymi(=enzymami bakteryjnymi)

SSCP - polimorfizm konformacji pojedynczych nici DNA. Jest to metoda skriningowa. Porównanie konformacji jednoniciowych struktur. Daje 50% prawdopodobieństwo znalezienia mutacji. Ta metoda nie wykrywa mutacji punktowych, służy np. do diagnostyki mukowiscydozy. Rozplecione nici Dna przyjmują konformację charakterystyczną, po mutacji będzie inna konformacja i będzie to można wykryć w zelu agarozowym po elektroforezie)

PCR-HDA (heterodupleks) - porównanie konformacji dwuniciowych struktur DNA, też metoda skriningowa.

Tu po denaturacji => renaturacja tworzą się hetero- i homodupleksy oceniamy potem w elektroforezie

Ta metoda pozwala wykryc 80% mutacji

Nested PCR (gniazdowy PCR albo zlokalizowany); 2 pary starterów; etapy:

- amplifikacja genomowego DNA ze starterami zewnętrznymi (1 normalny etap PCR)

- amplifikacja uzyskanego w pierwszej reakcji produktu ze starterami wewn. (specyficznymi)

Zwiększa specyficzność i czułość reakcji np. poszukiwanie wirusów.

platau - w reakcji PCR - osiągane jest takie stężenie produktów, że one same denaturują i nie można więcej cykli zrobić. Trzeba pobrać część i od nowa, żeby uniknąć efektu platau (produkty konkurują ze starterami)

Multiplex PCR

- amplifikacja w jednej probówce różnych fragmentów tego samego genu lub kilku ważnych genów

- użycie kilka par starterów

Cel

- ocena poziomu ekspresji

- produkty, które powstają muszą mieć różną długość, bo inaczej powstanie 1 prążek

- wykrycie delecji lub powstawania dodatkowych kopii genów, używa się np. w dystrofii mięśniowej tracone (delecja) egzony genu kodującego dystrofię objawy chorobowe, im wiecej egzonów tym wygląda gorzej

- wykorzystanie w medycynie sądowej (analiza sekwencji powtórzonych - bardzo różnorodne u różnych ludzi), potwierdzenie ojcostwa, DNA z miejsca zbrodni.

RT-PCR

• tworzenie na matrycy RNA nici c DNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy (rewers transcriptaze)

• wykorzystanie do analizy ekspresji genów do poszukiwania wirusów RNA

• wykonanie analizy Real-Time PCR

Real - Time PCR

• umożliwienie śledzenia przyrostu produktów PCR w czasie rzeczywistym

• sonda ma barwnik i wygaszacz na różnych końcach

• gdy produkt przyrasta….., aż odpadnie wygaszasz i widać wtedy barwę.

• PCR połączony z hybrydyzacją

Oprócz starterów są też fragmenty, które są komplementarne do badanego przez nas genu na sondzie. Te fragmenty są wyznakowane: na jednym końcu mają wygaszacz a na drugim wzmacniacz. Podczas PCR te fragmenty są wbudowywane dla produktu PCR, wygaszacz jest odłączany, pozostaje wzmacniacz, który emituje światło.

Sekwencjonowanie DNA, analiza sekwencji DNA (gdy przy PCR dodamy nukleotydy terminujące w każdej probówce jest inny nukleotyd terminujący)

nukleotyd terminujący (dodaje się dideoksynuleotyd) ma zablokowaną grupę przy cukrze i nie może łączyć się z kolejnymi nukleotydami

- izolujemy DNA

- w każdej probówce kilka tys. matryc

- przyłączają się nukleotydy terminujące

- w każdej probówce jest inny nukleotyd terminujący i sekwencjonowanie zakończy się na tym nukleotydzie

- na żelu widoczne są różnice długości o 1 nukleotyd

Western Blotting - analiza białek

1. elektroforeza (w żelu) białek = rozdział białek

2. elektrotransfer - przekładamy białka z żelu na (nitrocelulozę) membranę

3. immunodetekcja - dodajemy mleko, bo ono blokuje miejsca gdzie nie ma białka, a dopiero potem przeciwciała:

• p. pierwszorzędowe (specyficzna dla białka)

• p. drugorzędowe (przeciw pierwszorzędowym) połączone z enzymem

• rozdział białek na żelu poliakrylowym

• podgrzewamy

• dodajemy SDS - znosi ładunki własne białek, ale nadaje ładunek (-) aby białka wędrowały wg masy

• nanosimy na żel, najszybciej wędrują krótkie fragmenty, najdłużej długie

• białko przenosi się z żelu na membranę przy przyłożonym napięciu

• przeciwciałami I-rzędu identyfikujemy białka na membranie, przeciwciała II-rzędu łączą się z przeciwciałami II-rzędu

• należy dodać jeszcze substraty dla tego enzymu z przeciwciał II rzędowych,

• obserwujemy świecenie

Metody biologii molekularnej:

1. w diagnostyce wirusa HIV

1. testy III generacji opierają się na poszukiwaniu przeciwciał anty-HIV (2-3 tydz.)

2. testy IV generacji - poszukiwanie w surowicy pacjenta białka p24 (2 tydz.)

3. western blotting - rozdzielenie białka wirusa + surowca badana = identyfikacja rodzaju przeciwciał wytworzonych przez układ odpornościowy pacjenta

4. PCR - poszukiwanie RNA wirusa lub DNA wirusa w kom. pacjenta; także żeby sprawdzić skuteczność leczenia

2. PCR w krwiolecznictwie badanie obecności wirusa WZW typu C, możliwość wykrycia RNA HIV w osoczu już po 1-2 tyg. od ekspozycji

3. epidemiologia molekularna bada genetyczną zmienność czynników infekcyjnych

Choroby wielogenowe dziedziczone grupy genów, które wspólnie decydują o występowaniu pewnej cechy (większość cech biologicznych człowieka jest dziedziczona właśnie w ten sposób), np. dziedziczenie grup krwi - cecha.

Choroby:

• wady serca

• schizofrenia

• miażdżyca

• rozszczep wargi i podniebienia

• cukrzyca typu I i II

Diagnostyka:

• analiza sprzężeń - markery sekwencji niekodujących = markerem jest polimorficzny fragment genomu lub pojedyncza zmiana nukleotydu sprzężona z genem.

• Mikromacierz DNA

Aberracje chromosomowe - zaburzenia genetyczne, np. zespół Downa, Klinefeltera, Turnera.

Antycypacja - objawy choroby mogą narastać w kolejnych pokoleniach (spr. PCR + żel agarozowy).

Chromosom Philadelphia - gen funkcyjny odpowiedzialny za powstawanie białaczki (przewlekła białaczka szpikowa)

Diagnostyka prenatalna i neonatalna, źródło DNA:

• Komórki trofoblastu w 10-11 tydz. ciąży

• Płyn owodniowy ok. 15 tyg. ciąży

• Jądrzaste komórki płodu wyizolowane z krwi matki (młode erytrocyty z hemoglobiną płodową)

• Pojedyncze komórki blastomeru pochodzące z trzydniowego zarodka

• DNA płodowe krążące w krwioobiegu matki ok. 3% puli DNA jest DNA płodu

Choroby jednogenowe:

• występują u ok. 1% noworodków żywo urodzonych, stanowiących 10-25% przyczyn hospitalizacji w szpitalach dziecięcych

• są odpowiedzialne za ok. 7% martwych urodzeń i zgonów w okresie porodowym

• problem mogą stanowić choroby, których objawy mogą ujawnić się u dorosłych np. choroba Huntingtona, dystrofia, nosicielstwo

• w katalogu McKusicka (2002) skatalogowano ok. 13762 chorób uwarunkowanych genetycznie

Metody biochemiczne:

• nie mają możliwości diagnozowania tak dużej ilości genów

• mają możliwość diagnozowania chorób dla których jest znany produkt genu

• umożliwiają diagnostykę ok. 100 chorób z 10000 grupy

ĆW.5 BIOTECHNOLOGIA W MEDYCYNIE; TERAPIA GENOWA - PERSPEKTYWY I OBAWY

Podstawowe techniki inżynierii genetycznej:

• Technika rekombinowania DNA (łączenie in vitro różnych jego fragmentów)

• Klonowanie genów za pomocą komórek bakteryjnych

Rekombinantowe produkty dla lecznictwa - związki wytwarzane przez genetycznie zmodyfikowane drobnoustroje lub hodowle komórkowe.

Np.

• Leki białkowe

• Szczepionki

• Antybiotyki

• produkcja tańsza, wydajniejsza, bezpieczniejsza, uzyskanie substancji zmodyfikowanych

gen




rekombinacja

wprowadzenie do komórki bakteryjnej




namnażanie





przenosimy do wektora ekspresyjnego


wprowadzenie do komórek producenta

hodowla komórek producenta na dużą skalę




wyodrębnienie i oczyszczenie białka

DOBÓR WŁAŚCIWEGO SYSTEMU EKSPRESJI:

Wektor konstrukcja: odpowiedni promotor + sekwencje regulujące

BIORCA	WEKTOR
bakterie	plazmidy, fagi
rośliny/ kom. roślin in vitro	pochodne wirusów roślinnych bakterie Agrobacterium
zwierzęta/ kom. zwierzęce in vitro	pochodne wirusów zwierzęcych, np.: wirus krowianki, adenowirusy, retrowirusy

Różnice między aparatami genetycznymi Procariota i Eucariota utrudniają klonowanie w komórce bakteryjnej genów organizmów wyższych.

Geny eucariotyczne egzony + introny (nieciągłość genów)

Komórki bakteryjne nie ma intronów, brak enzymów odpowiedzialnych za potranslacyjne modyfikacje białek, klonowanie cDNA (brak intronów) lub klonowanie syntetycznego genu

Komórki biorcy:

• brak zagrożenia chorobotwórczego

• brak zanieczyszczenia produktu toksynami

• wydajna ekspresja obcego genu

• zahamowana właściwa struktura i funkcje wytwarzanego białka

Np.:

• bakterie E.coli

• niższe Eucariota drożdże i inne grzyby: Sacharomyces cerevisie, Pichia pastoris

• wyższe Eucariota komórki jajnika chomika (CHO - Chinese hamster ovary) lub pochodzące z jego nerki

Jednym z pierwszych związków otrzymanych metodami inżynierii genetycznej była INSULINA:

• otrzymywane z trzustek wieprzowych (metoda tradycyjna)

• chemiczno-enzymatyczne modyfikacje (lata 70)

• rekombinowana insulina E.coli (1982r.)

• badania nad zmodyfikowana insulina o ulepszonych właściwościach

Inne to:

• hormon wzrostu człowieka - HGH (karłowatość przysadkowa)

• folikulostymulina - FSH (bezpłodność)

HGH i FSH początkowo otrzymywane z przysadek, ale rozwój chorób prionowych

• 
  VIII czynnik krzepnięcia (hemofilia) izolowane z krwi; zakażenia chorobami

• Albumina (marskość wątroby) wirusowymi

• tPA=tkankowy aktywator plazminogenu (zawał mięśnia sercowego)

• interferony (schorzenia wirusowe, nowotworowe, immunologiczne)

• IL2 (rak nerki)

• hirudyna - kiedyś z pijawek (lek przeciwzakrzepowy)

Produkty niebiałkowe: witaminy, aminokwasy, antybiotyki zastosowanie technologii rDNA - ulepszanie szczepów drobnoustrojów: wydajniejsza synteza, otrzymywanie produktów zmodyfikowanych

GMO - organy modyfikowane genetycznie

Organizm transgeniczny - organizm wyższy z wprowadzonym heterologicznym genem, dziedziczonym zgodnie z prawami genetyki

Etapy transgenezy: wprowadzenie DNA

integracja z genomem

ekspresja genu

dziedziczenie

Metody: 1. wstrzyknięcie in vitro do zapłodnionej kom. jajowej (np.: zdeformowane

zarodki)

2. modyfikacje genetyczne pierwotnych komórek zarodkowych (ES) i ich

wprowadzenie do zarodka w stadium blastocysty implantacja do macicy samicy część potomstwa to organizmy transgeniczne

3. infekcje wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem wirusowym

Wykorzystanie zwierząt transgenicznych:

1. model badawczy myszy; badanie dziedziczenia nowotworów i chorób uwarunkowanych genetycznie

2. zwierzęta hodowlane:

• zwiększona masa i odporność na choroby, zmieniony skład mleka

• pozyskiwanie białek o znaczeniu leczniczym

• jako dawcy organów do ksenotransplantologii

Np.:

• obniżenie stężenia laktozy lub α-laktoalbuminy i β-laktoglobuliny korzystne dla alergików

• wprowadzenie genów kodujących białka mleka ludzkiego (częściowe zastąpienie białek z mleka krowiego)

• zwierzęta transgeniczne jako ”żywe bioreaktory”

• produkcja białek leczniczych: leczniczych-1-antytrypsyna (owce); tkankowy aktywator plazminogenu (bydło); czynniki krzepnięcia krwi ( kozy); hemoglobina (świnie); laktoferryna (krowa -> białko wytwarzane w gruczole mlekowym, krwi, moczu), także jaja kurze.

ROŚLINY TRANSGENICZNE:

• ulepszone walory spożywcze

• rzepak, ziemniak, pomidor, kukurydza, len, soja, ogórek, sałata, groch, marchew, kapusta, seler

• warunki: otrzymana roślina transgeniczna powinna:

- wykazywać prawidłową, niezdegenerowaną morfologię

- być płodna i przekazywać nową cechę kolejnym generacjom

- potwierdzeniem stabilnej integracji obcego genu z DNA jest jego prawidłowe dziedziczenie zgodnie z prawami Mendla

• funkcje: badanie podstawowych funkci genów i ich produktów; ułatwienie uprawy, zwiększenie plonu, otrzymywanie surowców roślinnych roślinnych o wyższej jakości, zwiększenie odporności roślin na owady, grzyby; bakterie, wirusy, herbicydy; otrzymywanie modyfikowanych związków stosowanych w lecznictwie

• źródło: 1. doustnych szczepionek (tytoń - HbsAg; pomidor - białko wirusa wścieklizny; ziemniak - enterotoksyna E.coli; sałata - HbsAg)

2. przeciwciał - diagnostyka medyczna, miejscowa immunoterapia

3. biofarmaceutyków (rzepak, ziemniaki), (sałata - HbsAg - wzw typu B) (tytoń - glukocerebrozydaza, hirudyna, erytropoetyna, ludzka albumina osocza)

Otrzymywanie:

1. metoda wektorowa z Agrobacterium

2. metody biolistyczne

3. mikroiniekcja

4. elektroporacja

5. fuzje protoplastów z liposomowymi kapsułkami zawierającymi DNA

Perspektywy:

• skrócenie czasu potrzebnego do otrzymania nowej odmiany rośliny

• uzyskanie roślin o zwiekszonej odporności, lepszych walorach smakowych

• szczepionki, przeciwciała, biofarmaceutyki

SZCZEPIONKI NOWEJ GENERACJI:

Szczepionki tradycyjne:

- żywe atenuowane drobnoustroje (możliwość rewersji do formy zjadliwej)

- zabite (inaktywowane) bakterie lub wirusy (domieszka żywych patogenów)

- podjednostkowe (antygeny wyizolowane) (obecność składników dodatkowych

wywołujących efekty uboczne)

- toksoid bakteryjny

Strategie tworzenia szczepionek z wykorzystaniem technik rekombinacji DNA (rDNA):

1. atenuowane - nieodwracalna atenuacja patogenu na poziomie genetycznym - uniemożliwia powrót do cech zjadliwości

2. żywe wektory - dostarczają do szczepionego organizmu białka antygenowe

drobnoustrojów chorobotwórczych

3. szczepionki podjednostkowe - otrzymywane w drobnoustrojach

niepatogennych bakterii i grzybów (wprowadzenie do nich genów kodujących

antygen)

Zalety: stabilność, brak niepożądanych objawów, bezpieczne wytwarzanie, możliwość szybkiej modyfikacji dostosowanie do zmian patogenu.

Np.: rekombinowany HbsAg

Ad.1. Szczepionki atenuowane:

- atenuacja tradycyjna - metody chemiczne, termiczne, hodowle w specjalnych warunkach

- inżynieria genetyczna - nieodwracalne, delecja genów odpowiedzialnych za chorobotwórczość, patogen ma uniemożliwione namnażanie.

Ad.2. Żywe wektory:

1. ekspresja odpowiedniego genu z organizmu patogennego w niechorobotwórczych bakteriach lub wirusach

2. komórki lub wiriony zawierające obce antygeny

3. żywa szczepionka wywołuje odpowiedź immunologiczną

wektory: wirusy: adenowirusy, picornawirusy, poxiwirusy, wirus krowianki, vacinii

bakterie atenuowane: salmonella, BCG, pałeczki krztuśca

Ad.3. Szczepionki podjednostkowe:

- tradycyjny sposób - antygen pozyskiwany z materiału pobranego od chorych (np. krew), albo z hodowli chorobotwórczych wirusów/bakterii

- inżynieria genetyczna - wytwarza składniki organizmów patogennych przez niechorobotwórcze bakterie czy drożdże zawierajace wprowadzony gen kodujący białko antygenowe (p/WZW typu B - S. cerevisiae): (badania - fragment C toksyny tężcowej)

WIRUS KROWIANKI:

- wirus laboratoryjny

- ma wielu gospodarzy

- łatwy do hodowli in vitro

- DNA replikuje się w cytoplazmie

Szczepionki genetyczne (DNA):

- wprowadzenie genu kodującego białko antygenowe bezpośrednio do szczepionego organizmu synteza antygenu wywołującego reakcję immunologiczną.

zalety: wysoka trwałość preparatów, niski koszt produkcji

wady: wbudowanie wprowadzonego DNA w genom człowieka, wpływ długotrwałej stymulacji na układ immunologiczny

Np.: przeciw grypie, wściekliźnie

Szczepionki przeciwnowotworowe:

- podawanie antygenów charakterystycznych dla komórek nowotworowych z dodatkiem silnego adiuwanta i wykorzystaniem komórek wirusowych

Wstępne badania: zrekombinowane wirusy vaccinia z wprowadzonym genem kodującym.

TERAPIA GENOWA

Gen terapeutyczny





Wirusowy DNA plazmidowy DNA






Zrekombinowane wirusy ”nagi DNA” komplexy ze związkami



kationowymi




TRANSFER TRANSFER





komórki docelowe




EKSPRESJA

efekt fenotypowy

Terapia genowa:

1. somatyczna- korekta w komórkach określonej tkanki organizmu dojrzałego (wprowadzony gen nie może dostawać się do komórek rozrodczych, defekt genetyczny powstaje w organizmie może być dziedziczony)

2. germinalna - na komórkach rozrodczych lub zarodku we wczesnym etapie rozwoju

Wprowadzenie genu:

• in vivo: płuca, mięśnie, watroba, tkanka nerwowa wprowadzamy bezpośrednio do organizmu

• ex vivo: hepatocyty, kom. macierzyste szpiku, kom. z krwi obwodowej pobieramy z organizmu, wprowadzamy gen, namnażamy i wprowadzamy

z powrotem do organizmu

Sposoby wprowadzania do komórek genu terapeutycznego:

1. zmodyfikowane wirusy

retrowirusy

adenowirusy (mogą same być immunogenne)

AAV (wirusy towarzyszące adenowirusom)

pochodne wirusa opryszczki

2. niewirusowe nośniki DNA: np. liposomy, polimery

3. metody fizyczne (stosowane do transferu DNA „in vitro”), bezpośrednio wprowadzone do komórek za pomocą:

„pistolet genowy”

elektroporacja

ultradźwięki

wprowadzanie pod ciśnieniem płynu zawierającego DNA

Warunki sukcesu terapii genowej:

1. nakierowanie terapii na odpowiednie komórki (wprowadzenie genu terapeutycznego możliwie selektywnie do właściwych komórek)

2. integracja genu z komórką; gen terapeutyczny musi utrzymywać się w komórce jak najdłużej

3. aktywacja genu terapeutycznego, expresja na odpowiednim poziomie, powstające białko funkcjonuje prawidłowo

4. brak szkodliwych efektów ubocznych, np.: mutacje, inercja.

Przykładowe strategie terapii genowej:

1. komplementacja defektu genetycznego

• głównie choroby jednogenowe, dziedziczące się recesywnie lub sprzężone z płcią

• wprowadzenie do odpowiednich komórek docelowych prawidłowego genu (cDNA, bez intronów)

• nie eliminuje się defektu, ale kompensuje jego efekty biologiczne

• mukowiscydoza, SCID (ciężki złożony niedobór odporności, brak deaminazy adenozyny ADA), hemofilia A i B (mutacje w genach czynników krzepnięcia krwi VIII i IX), fenyloketonuria, zaburzenia w cyklu mocznikowym, dystrofia mięśniowa DMD

• zablokowanie działania genu

• strategia antysensu - poziom translacji (RNA łaczy się z mRNA blokując translację, w cytoplazmie zawada przestrzenna)

• strategia triplexu - poziom transkrypcji

• rybozymy

• sRNA (interferujące RNA)

• np.: choroby spowodowane mutacjami dominującymi, nowotwory (hamowanie ekspresji onkogenów, genów czynników wzrostu), AIDS

3. modyfikacja genetyczna komórki (wprowadzenie genu kodującego nową cechę fenotypową)

• geny kodujące białka aktywujące układ immunologiczny (np. cytokiny), można wprowadzić doguzowo

• geny wielolekowej oporności (MDR)

• geny antyangiogenne (endostatyna, angiostatyna)

• geny proangiogenne (VFGF) miażdżyca

• w chorobach nowotworowych

4. selektywne niszczenie komórek

• geny „samobójcze” (efekt sąsiedztwa)

• geny indukujące apoptozę (geny szlaków apoptotycznych, np.: kaspazy

• nowotwory (komórki nowotworowe), AIDS (komórki zainfekowane)

Terapeutyczne oligonukleotydy:

1. hamowanie ekspresji zmutowanego genu

2. korekta mutacji, rewersja zmutowanego genu

Terapeutyczny gen:

1. kompensacja defektu genetycznego

2. eliminacja komórek

3. nowe cechy fenotypowe

Problemy terapii genowej:

- objawy uboczne po podaniu wektora wirusowego np.: efekt cytotoksyczny

- reakcje zapalne (zwłaszcza adenowirusy)

- możliwość onkogennego działania retrowirusów, np.: białaczki

- możliwość „domieszki” wirusów typu dzikiego wśród wektorów

- reakcja immunologiczna organizmu na nowe białko, kodowane przez wprowadzony gen

- krótkotrwały efekt terapii

- niski poziom białka

Próby terapii genowej (przykłady):

• choroby genetyczne:

SCID (ciężki złożony niedobór odporności; brak ADA, deamiznazy adenozyny), hemofilia B, rodzinna hipercholesterolemia, mukowiscydoza, dystrofia mięśniowa, niedobór α-1 antytrypsyny, ch. Gauchera

• nowotwory:

mózgu, piersi, okrężnicy, wątroby, płuc, jajnika, prostaty, białaczka, chłoniak, czerniak

• inne: AIDS, miażdżyca

ĆW.6 KOMÓRKI MACIERZYSTE

Terapia komórkowa wykorzystywana do:

1. przeszczepu szpiku

2. transfuzji krwi i preparatów krwinkowych

totipotencjalna komórka macierzysta - komórka zdolna do przeobrażenia się w dowolne kom. org., dzięki niej mogą powstawać listki zarodkowe, a także pępowina i łożysko

multipotencjalna komórka macierzysta - jest w stanie różnicować się do kom. wszystkich listków zarodkowych, nie mogą powstawać dzięki różnicowaniu tej kom. pępowina i łożysko.

pluripotencjalna komórka macierzysta - komórka umożliwiająca otrzymywanie kilku rodzajów komórek, należących do tego samego listka zarodkowego lub do tej samej tkanki, np.: hematopoetyczna komórka pnia (HSC), neuropoetyczna komórka pnia (NSC)

Nieśmiertelność komórek macierzystych dzięki podziałowi asymetrycznemu (podział mitotyczny kom., w wyniku którego powstaja dwie różniące się od siebie fenotypowo komórki)!! Komórka macierzysta ulega samoodnowieniu. dzięki współpracy czynników wzrostu z czynnikami trankrypcyjnymi!!! (taka sama jak macierzysta jest druga powstała komórka)

Samoodnowa zapewnia długotrwałe bytowanie w naszym organizmie.

Nisza komórek macierzystych w niej rozplem kom. macierzystych (ożemy wytworzyć gradient czynników wzrostu). Np.: w mieszku włosowym, w krypcie kosmków jelitowych (na dnie komórki macierzyste kom. dojrzewające kom. dojrzałe). 3-5 miesięcy odnowa kosmków jelitowych.

Zmiany epigenetyczne patern metyzacji, w czasie procesu różnicowania, zmiany metylacyjne fragmentu DNA (bardzo trwałe, nie można ich cofnąć) + transróznicowanie (przejście w bok) bardzo trudne.

Hierarchiczne modele różnicowania w biologii molekularnej - jak otrzymać (izolować) komórki macierzyste!?

1. kom. embrionalne klonowanie zapłodniona komórka zygota usuwany DNA matki i ojca wprowadzany materiał genetyczny innego człowieka

• klonowanie reprodukcyjne kontynuuje rozwój aż do dorosłego organizmu

• klonowanie terapeutyczne do badań, przerwanie embriogenezy, np.: różnicowanie w tkanki, np.: komórki trzustki, neuron, mięśnia sercowego

2. komórki płodowe np.: z poronień, z płodów:

• autologiczne

• syngeniczne

• alogeniczne

• ksenogeniczne

• komórki macierzyste dorosłych: mieszek włosowy i krypty jelitowe

• krew pepowinowa, szpik hematopoetyczne komórki macierzyste, ale także i inne kom. macierzyste wg. prof. Ratajczaka

plastyczność w odpowiednich warunkach komórki hematopetyczne mogą pokonać barierę listków zarodkowych i przejść np. w ektodermę

Embrionalne komórki nie stwarzają problemu odrzutu!

Klonowanie nie jest wolne od problemów technicznych i trudno pozyskać wystarczającą ilość kom. jajowyh. Klonowanie udaje się w nielicznych przypadkach. Konieczne jest opanowanie umiejętności kierowania procesem różnicowania kom. embrionalnych do potrzebnych pochodnych. Samych komórek embrionalnych nie da się stosować w terapii!

Teratomy nowotwory

Hodowla embrionalnych kom. macierzystych w medium zawierających zwierzęce składniki zmienia ich immunogenność.

Nie klonujemy ssaków bo kom. embrionalne maja zmiany epigenetyczne.

Musimy in vitro wykonać różnicowanie, musimy utrzymać je w ryzach.

STOCHASTYKA - komórka macierzysta sama decyduje czy stanie się erytroblastem, megakariocytemczy czymś innym.

Sposób stochastyczny = losowy

Aplikacje:

• choroba Parkinsona

• choroba Alzheimera

• zawał mięśnia sercowego

• cukrzyca

• regeneracja rdzenia kręgowego

Nowotwory nie pochodzą z komórek dorosłych, ale z komórek macierzystych albo progenitorowych. ale mają też swoje własne komórki macierzyste niszczymy komórki nowotworowe ale komórka macierzysta przezywa stąd wznowy!!!!!!

ZWIERZĘTA CHIMEROWE:

• mysz z ludzkimi komórkami rozrodczymi

• koza z ludzkim sercem

• brak dawców

ĆW.7 PODSTAWY MOLEKULARNE CHOROBY ALZHEIMERA

Otępienie - zespół objawów wywołanych chorobą mózgu, zwykle przewlekłą lub o postępującym przebiegu, charakteryzuje się zaburzeniami wyższych funkcji korowych, t.j. pamięć, myślenie, orientacja, rozumienie, liczenie, zdolność do uczenia się, język, ocena.

Często poprzedzane przez zaburzenia emocjonalne, zachowania i motywacji.

Przyczyna otępień:

- choroba Alzheimera

- otępienie naczyniopochodne

- LBD

- FTD.

- depresja

- niedobór witaminy B12

- alkoholizm

- nowotwory i infekcje

- polekowe

- niedokrwienie

- zaburz. Metaboliczne

Amyloidozy - grupa chorób o zróżnicowanej etiologii, których wspólna cechą jest występowanie depozytów amyloidowych w obrębie zajętych narządów.

Sporadycznie angiopatia mózgowa z amyloidozą.

Amyloidoza:

1. układowa:

• pierwotna „AL” (prekursor lekkich łańcuchów immunoglobulin serce, skóra, przewód pokarmowy, włókna nerwowe)

• rodzinna:

# gorączka śródziemnomorska SAA odkładanie białka AA (apolipoproteina A o

wysokiej gęstości - jest białkiem ostrej fazy)

# amyloidoza rodzinna typ fiński modyfikuje działanie aktyny

• amyloidozy wtórne (białko SAA):

# w przebiegu przewlekłych zapaleń (gruźlica, zapalenie kości)

# związane z dializą Aβ2-m

• amyloidoza starcza

2. narządowa:

• rak rdzeniasty tarczycy (kalcytonina)

• cukrzyca typu II (polipeptyd amyloidowy wysp trzustkowych)

• amyloidoza przedsionka serca (czynnik natriuretyczny)

• amyloidozy mózgowe

Amyloidozy mózgowe:

- A-β AD (ch. Alzheimera), MAO-τ

- zespół Dorna Aβ

- HCHWA - I - cystatyna C (rodzinny krwotok mózgu)

- HCHWA - D - Aβ

- tauopatie

Patogeneza amyloidoz: białko ulega przemianie fizyko-chemicznej staje się nierozpuszczalne i oporne na enzymy proteolityczne (odkładanie się złogów w obrębie danych narządów i następczo stopniowa utrata jego funkcji!

Gromadzenie amyloidu:

• aktywacja mikrogleju uwalnianie cytokin, reakcja astrocytów, aktywacja układu dopełniacza wzrost ilości toksycznych wolnych rodników nasilenie wybuchu tlenowego - zachwianie równowagi jonowej (napływ jonów Ca do wnętrza kom. co powoduje dysregulację szeregu białek wiążących wapń i z wiązaną z tym apoptozę

Amyloid - techniki histochemiczne:

• eozynochłonny

• PAS-dodatni

• srebrnochłonny

• metachromatyczny

• żółto-zielona fluorescencja po zabarwieniu tioflawiną S lub czernią Saturna

• dwułomność w świetle spolaryzowanym po zabarwieniu czerwienią Kongo

• struktura β-fałdowa

• oporność na enzymy proteolityczne

• nierozpuszczalność w fizjologicznych roztworach NaCl

• wystepuje z innymi białkami osoczowymi, np.: apolipoproteiną E, apolipoproteiną I

Amyloid nierozgałęzione włókna, średnica 8-10nm, nieokreslona długość, struktura β-harmonijki (kartki) kilka fragmentów białka biegnie równolegle do siebie i struktura ta jest stabilizowana przez wiązania wodorowe tworzone pomiędzy grupami NH i CO sąsiadujących nici aminokwasowych.

Przemiana konfirmacyjna białek do β-harmonijki zależy od mikrośrodowiska, w którym się znajdują podobne do tych, jakie panują w lizosomie wszystkie odkładają się w tej samej postaci.

Zmieniony proces zwijania białek mutacje w genach je zwijających

CHOROBA ALZHEIMERA: (50%)

Choroba zwyrodnieniowa OUN charakteryzująca się postępującym deficytem funkcji poznawczych, zwłaszcza pamięci oraz innymi zaburzeniami zachowania takimi jak apatia, pobudzenie i objawy psychotyczne.

Cechy neuropatologiczne występowania zwyrodnienia neurofibrylarnego i złogów amyloidu zewnątrzkomórkowo pod postacią blaszek amyloidowych(rdzeń zbudowany z Aβ) oraz kongiofilnej angiopatii.

Aβ - amyloid gromadzący się w mózgu w chorobie Alzheimera, zwłaszcza Aβ1-42

Klasyfikacja ze względu na wiek:

forma wczesna EOAD (mylona ze schizofrenią)	forma późna LOAD
< 65 r.ż.	≥ 65 r.ż.
1-5% przypadków	95%
rodzinna	rodzinna (gdy 2 osoby w rodzinie chore)
sporadyczna	sporadyczna (bez uwarunkowań genetycznych)

Rodzinna LOAD i EOAD dziedziczenie autosomalne dominujące

Wieloczynnikowa (czynniki środowiskowe + genetyczne) postać rodzinna LOAD
i sporadyczna EOAD

Czynniki ryzyka:

• ↓ edukacji (edukacja zmniejsza ryzyko wystąpienia usprawnienie kom. mózgu)

• uraz głowy

• wiek

• HTZ - brak (hormonalna terapia zastępcza) zapobiega, jej brak pogarsza)

• czynniki naczyniowe nadciśnienie

• HSV-1 wirus opryszczki zwłaszcza w połączeniu z APOE (E4)

• czynniki genetyczne:

• βAPP, PS1, PS2, (sprawcze)

• APOE (czynnik ryzyka)

• Płeć nie ma znaczenia!!!!!!

Etapy rozwoju AD:

1. wczesny - otępienie łagodnie nasilone:

• zaburzenia pamięci, do których dołączają stopniowo zaburzenia innych funkcji poznawczych t.j. języka, agnozji wzrokowo-przestrzennej, funkcji wykonawczych;

• patologiczna nietrwałość śladu pamięciowego!!!! Np.: przeczytamy coś i nie pamiętamy;

• zapominanie - jest jednym z procesów pamięci;

• apatia, utrata zainteresowań, drażliwość;

• zaburzenia pamięci, na początku rzadko trudności z uczeniem się;

• niektóre zaburzenia zachorowania, apatia, utrata zainteresowań, drażliwość;

• chorzy przestają podejmować niektóre trudniejsze zadania zdając się na decyzje opiekuna.

1. pośredni:

• otępienie umiarkowanie nasilone;

• stany nieadekwatnego pobudzenia lub spowolnienia;

• zapominamy to co się działo kiedyś;

• zaburzenia zachowania;

• objawy psychiatryczne, zwłaszcza wypowiadanie urojeń (okradanie, opuszczanie, zdrady małżeńskie);

• zaburzenia rytmu snu i czuwania;

• zespoły błędnego rozpoznania, stany agresji;

• trudności w ubieraniu się, w posługiwaniu się sztućcami;

• halucynacje, zaburzenia lękowe.

2. otępienie głęboko nasilone:

• rozpad procesu mówienia, spostrzegania;

• nie rozpoznajemy osób;

• brak mimiki twarzy;

• symptomy neurologiczne związane z uszkodzeniem neuronu ruchowego;

• utrata umiejętności;

• zaburzenia chodu i upadku;

• odruchy patologiczne;

• nietrzymanie moczu i stolca;

• objawy pozapiramidowe;

• napady drgawkowe (10%) chorych.

Podstawy molekularne:

Aβ - peptyd długości 39-43 aa

βAPP - białko prekursorowe amyloidu β

• 
  βAPP695 - neurony

• β751 - (domena Kunitza) glej produkowane

• β770 - (zawiera antygen MRC-ox2) glej + domena Kunitza w ukł. nerwowym

W prawidłowych komórkach Aβ1-40 z niewielką domieszką Aβ1-42(43) jest dłuższy, bardziej szkodliwy.

Aβ1-42 25% ogólniej puli wewnątrz komórki.

Tylko neurony produkują wewnątrzkomórkową formę Aβ.

βAPP glikozylowane integralne białko błonowe typu I:

• C-koniec - cytoplazmatyczny

• domena śródbłonowa - transmembranowa

• N-koniec (domena zewnątrzkomórkowa)

Rola βAPP (uczestniczy w):

• regulowaniu przeżywalności neuronów;

• wzroście neurytów;

• plastyczności synaptycznej;

• adhezji komórek;

• tworzeniu nowych wypustek sekretarza połączeń neuronalnych (podłoże procesów pamięci);

• ochronny wpływ na komórki nerwowe (obniża wewnątrzkomórkowy poziom Ca).

Występuje w dwóch szlakach:

1. szlak nieamyloidogenny procesowanie przez α-sekretazę i γ-sekretazę powstaje fragment wewnątrzkomórkowy o właściwościach regulacyjnych oraz fragment zewnątrzkomórkowy - rozpuszczalny peptyd sβAPPα

2. szlak amyloidogenny kaskada amyloidowa procesowanie przez β-sekretazę i γ-sekretazę powstaje peptyd amyloidu o długości 40, 42, 43 AA (w warunkach fizjologicznych powstaje niewielka ilość)

Bardziej toksyczne 42AA.

Procesowanie:

Białko APP - w błonie





α-sekretaza

(w warunkach fizjologicznych)

fragment wewnątrzkomórkowy fragment zewnątrzkom. (C83)


sAPPα

γ-sekretaza

nie może powstać peptyd Aβ bo za krótki fragment C83

jeśli natomiast zadziała β-sekretaza!! (też w fizjologicznych ale w mniejszej ilości)

Białko APP - w błonie





β-sekretaza

fragment wewnątrzkomórkowy fragment zewnątrzkom. (C99)


sAPPα

γ-sekretaza

peptyd Aβ + C59/57 ZŁOGI

α-sekretaza

- przecina βAPP w obrębie sekwencji Aβ, powstaje αAPPs oraz peptyd C83

- aktywność α-sekretazy: ADAM10 (aktywność hamowana przez cholesterol) i ADAM(17) lub TACE (nazwa wymienna), ADAM9 protezy adamolizynowe

β-sekretaza

- przecina βAPP z N-końca i powstaje βAPPs i C99 (99aa)


- BACE 1 (beta - site APP) śródbłonowe proteazy

- BACE 2 aspartylowe

BACE 2 miejsca aktywne i m-ca te zawierają aminokwasy o silnie konserwatywnej sekwencji., nie musi jako pierwsza część α lub β-sekretaza, może to być γ-sekretaza.

γ-sekretaza:

- przycina C-koniec (substratem jest C99 lub C83)

- preseniliny mają aktywność γ-sekretazy lub tworzą kompleksy z γ-sekretazą

Preseniliny - protezy asparaginianowe integralne białka błonowe o masie cząsteczkowej P1 45 kDa, P2 50 kDa

P1 gen na chromosomie 14 pS1

P2 gen na chromosomie 1 pS2

Położone w części N-końcowej i w obrębie pętli reszty serynowe fosforylowane P1 bardziej podatne na fosforylacje.

60% ich reszt aminokwasowych - konserwatywna pełnia podobna rolę

Metabolizm βAPP:

chromosom 19 - APO-E

chromosom 21 - białko prekursora amyloidu

moduluje rozwój embrionalny

trawienie Noch

trawienie innych białek

ulega proteolizie do dwóch części i jest aktywne

produkty trawienia preselininazy: N 20kDa, C 30kDa transportowane do kompletu makromolekularnego βA łączy się ze sobą i odkłada w postaci złogów

Mutacje w obrębie genów prowadzą do choroby Alzheimera!

Ilość mutacji:

APP - 20

PSEN1 (presenilina) - 135 warunkują najwcześniejsze postacie AD

PSEN2 - 10

Są to najczęściej mutacje typu zmiany sensu, nie znaleziono na razie mutacji nonsensownych czy delecji.

Jeżeli mutacje w 3 genach (chromosomy 1, 14, 19, 21) DA rodzinny w 100% występuje.

Rezultaty mutacji:

• wzrost całkowitej sekrecji Aβ

• nadprodukcja formy Aβ1-42

• zmniejszenie produkcji Aβ1-40

Jedynym potwierdzonym czynnikiem w sporadycznej i późnej rodzinnej AD jest
Apo-E!! Gen ApoE na chromosomie 19. białko produkowane w wątrobie i mózgu metabolizm lipidów, transport cholesterolu i lipidów cholesterol reguluje wytwarzanie Apo-E.

Polimorfizm apolipoproteiny E:

• ε2, ε3, ε4 (formy te różnią się 2 aa, może być 6 kombinacji - bo po 1 genie od każdego rodzica)

• genetyczny czynnik ryzyka

• obecność allelu ε4

• wraz z liczbą ε4 ↑ ryzyko

• obniża się wiek zachorowań

• ε2 ↓ ryzyko

Apo-E ε2 czynnik ochronny, chroniący przed AD.

Patologia AD:

• blaszki amyloidowe

• zwyrodnienie włókienkowe neuronów = zwyrodnienie neurofibrylarne Alzheimera (NFT) wystepuje w :

• komórkach piramidowych kory nowej,

• hipokamie,

• ciałkach migdałowych

• jądrach podstawy

• zlokalizowane głównie wewnątrzkomórkowo po śmierci kom. cienie zewnatrzkom.

• patologiczne fosforyzowane białko MAP-τ - główny składnik

• nici neurofilowe (NT):

• zgrupowanie włókien w bliskim sąsiedztwie NFT

• włókienka tworzące delikatna siateczkę

• składnikami molekularnymi są białka MAP-τ i ubikwityna

• lokalizacja NT niezależna od blaszek amyloidowych

• dystroficzne neuryty (DN) struktury owalne lub sferyczne, zawierają mitochondria oraz liczne, otoczone błonami wtręty, główny składnik włókienkowy - PHF

• zwyrodnienia ziarnisto - wodniczkowe wakuole z centralnie zlokalizowaną ziarnistością, która jest reaktywna wobec przeciwciał skierowanych przeciwko tubulinie, niektórym epitopom tau, są ubikwitynowane

• angiopatia kongofilna:

• pozakomórkowe odkładanie amyloidu w ścianach naczyń, głównie małych tętnic i tętniczek, opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu

• główny składnik to Aβ1-43

• ciała Hirano równolegle położone filamenty, białko MAP-τ, nie są ubikwitynowane

Rodzaje blaszek amyloidowych:

• prymitywe (neurytyczne) rozdęte neuryty bez rdzenia amyloidowego, mniejsze niż starcze

• klasyczne (starcze) rdzeń otoczony koroną dystroficznych neurytów i wypustek astrocytów w korze i w hipokampie ich liczba nie koreluje ze stopniem otępienia

• wypalone sam rdzeń, zbity amyloid

• rozlane (dyfuzyjne) delikatne włókna bez rdzenia i neuronów dystroficznych

KOLOSTRYNINA:

• komplex białek występujących w siarze ssaków

• spowolnienie efektów chorobowych i polepszenie ogólnych funkcji behawioralnych,
  z wyraźnym usprawnieniem zdolności zapamiętywania (początkowe i średnio zaawansowane stadium choroby)

• indukuje cytokiny hamujący wpływ na powstawanie złogów amyloidowych w mózgu

• Colostrynin - nazwa handlowa

Tauopatie wspólną cechą heterogennej grupy chorób tauopatii jest występowanie w neuronach i komórkach gleju wtrętów utworzonych z hiperfosforylowanego białka MAP-τ!

gen kodujący MAP-τ - chromosom 17 16 egzonów, u człowieka 11 z nich ekspresja w OUN

6 głownych izoform zaleznych od alternatywnego splicingu mRNA egzonów 2, 3 i 10 10 najważniejszy (bo powstają 3 lub 4 motywy! Cokolwiek to znaczy!) C-koniec domeny odpowiedzialny za wiązanie mikrotubuli.

Nadmierne gromadzenie tych izoform nadmierna fosforylacja bialka MAP-τ nadmierne wiązanie z mikrotubulami jeśli niedobór fosforylacji złe wiązanie ZŁOGI śmierć komórki

MAP-τ głównie w komórkach nerwowych regulowanie procesu stabilizacji i integracji cytoszkieletu oraz kom. oligodendrogleju stabilizacja mikrotubul

Choroby w których występuje patologia MAP-τ:

1. choroba Alzheimera

2. otępienie z ziarnami argryrofilnymi

3. zwyrodnienie korowo - podstawne

4. zespół Dorma

5. choroba Picka

6. postępujące porażenie nadjądrowe

Są to choroby o podłożu dziedzicznym lub sporadycznym.

Tego nie było na zajęciach :

Choroba Picka (1-7% otępień) zaburzenia osądu i emocjonalne:

• w fazie wczesnej zaburzenia zachowania, językowe, objawy neurologiczne;

• w fazie pośredniej objawy wyraźnego deficytu pamięci;

• w fazie w pełni rozwiniętej choroby ogniskowe deficyty poznawcze

• zanik płatów czołowych i skroniowych

• ciężar mózgu 750-900g

• wygląd „zasuszonego orzecha włoskiego”

CHOROBA PARKINSONA

150-200 na 100tys. populacji

Postać rodzinna, 9 loci - 3 geny: A - synukleina, parkina, UCHL-1

parkina

- aktywność E3 ligazy ubikwityny

- niewielki zanik kory, mikroskopowo - ciało Levy'ego, neuryty Levy'ego

- brak otępienia

- 3 klasyczne objawy:

-drzenie spoczynkowe

- spowolnienie ruchowe

- wzmożone napięcie mięśniowe

- oraz::

-zaburzenia wegetatywne

- mikrografia

- jednostronny początek

- twarz maskowata - amimiczna

- od około 50 roku życia

- leczenie raczej objawowe,

otępienia z ciałami Levy'ego

- około 20% otępień przejawia objawy: zaburzenia poznawcze i pamięci, o zmiennym nasileniu

- zaburzenia pamięci mniej nasilone niż w AD

- halucynacje wzrokowe

- parkinsonizm

- rozlany zanik mózgu

- zawroty głowy, omdlenia, zaburzenia świadomości, nadwrażliwość na neuroleptyki, urojenia

Patologia:

- (nie ma zaników w parkinsonizmie)

- rozlany zanik mózgu

- mikroskopowo ciała Levy'ego klasyczne i korowe (w istocie czarnej i korze mózgu)

- zgąbczenie

- zmiany typu Alzheimera

ĆW.8 CYKL KOMÓRKOWY

Komórki glejowych dzielą się do 30 roku życia.

Populacje komórek możemy podzielić na:

• Niedzielące się:

• Kom. nerwowe

• Kom. mięśniowe

• Szybkodzielące się:

• Kom. krwiotwórcze

• Szpik

• Kom. rozrodcze

• Limfocyty

• Śródbłonek

• nablonek

• Wolnodzielące się:

• Hepatocyty

• Kom. trzustki

• Fibroblasty

I. Faza G1 = faza wzrostu

• długość (6-12h) decyduje o długości całego cyklu

• wzmożona wymiana chemiczna z otoczeniem

II. Faza G₀

• komórki tracą zdolność syntezy DNA i dzielenia się

• zawierają swoiste białka, inne rodzaje mRNA, bardziej skondensowana chromatyna

III. Faza S

• długość (8h) wyznacza względnie stały czas replikacji DNA

• podwojenie ilości DNA

• zwiększenie masy i objętości komórki

• synteza cykliny B

IV. Faza G2

• 3-4 godziny

• synteza białek

• nadprodukcja składników niezbędnych do odtworzenia błony komórkowej

• 2 x RNA

V. Faza M

• 0,5-1 godziny

MITOZA

W późnej fazie G1 jest zlokalizowany punkt restrykcyjny R (po przekroczeniu tego punktu komórka musi dalej się dzielić).

Faza S - stały czas (krócej w przypadku bruzdkowania zygoty), zaburzona replikacja uszkodzenia DNA

Faza M - zaburzenia rozdziału chromosomów

Regulacja cyklu:

• granica faz G1/S (punkt kontrolny intra S lub replikacyjny)

• kontrola integralności materiału genetycznego

• uruchomienie mechanizmów naprawczych i zatrzymanie cyklu przed wejściem w fazę S

• granica faz G2/M (metafaza/anafaza)

• kontrola prawidłowości kondensacji i segregacji materiału genetycznego

• kontrola tworzonego wrzeciona

Białko p53 (fosforyzowany przez kinazę MAP zależną od … genów)

• forma aktywna, fosforowana

• gen supresorowy (17p13.1)

• strażnik genomu, utrzymuje stabilność genomu

• 5 regionów o wysokiej homologii międzygatunkowej, miejsca najczęstszego wystąpienia mutacji

• w punkcie G1/S - opóźnia przebieg cyklu umożliwiając naprawę DNA

• jeden z najczęściej uszkodzonych genów w chorobach nowotworowych (50% nowotworów)

• odziedziczenie zmutowanego genu - zespół Li - Fraumeni

• zahamowanie transformacji nowotworowej i wzrostu nowotworu

• w punkcie G2/M - zapobiega złamaniom chromosomów (utracie materiału genetycznego)

• indukowanie apoptozy przy uszkodzonym DNA

białko pRb w formie fosforyzowanej aktywne

substraty:

• kuspany - działają na białko regulatorowe i strukturalne (np. laminy)

• lustony - białka decydujące o aktywności DNA

• forma hipofosforylowana

-zapobiega proliferacji komórki

-występuje w fazie G1

- tworzy kompleks z innymi białkami

• forma hiperfosforylowana

• sprzyja proliferacji

• w fazie S, G1 i M

• uwalnia cz. transkrypcyjne

Cykliny	Faza cyklu	Kinazy cyklinozależne
D	G1	Cdk 4, Cdk 6, Cdk 5
E	G1/S	Cdk 2
A	S	Cdk 2
B	S/M	Cdk 1

regulacja cyklu komórkowego:

- kinazy cyklino-zależne serynowo-treoninowe, cdk --- fosforyzacja białek

- cykliny tworzą kompleks z cdk

- CAK - kineza aktywująca cdk, fosforyzuje kompleks cyklina/cdk

-aktywność kinaz białkowych cdk zależy od stanu fosforyzacji i związania w kompleksy

inhibitory cyklinozależnych kinaz:

• INK 4 - hamują kinazy zależne od cykliny D (Cdk 4 > Cdk 6)

• Cip/Kip - inaktywują Cdk 2 zależne od cyklin A i E

• Grupa I - inhibitory Cdk 4 (p14/p16/p18)

• Grupa II - inhibitory Cdk 2 (p21/p27/p57)

Cykliny i rak:

• Gruczolak przytarczyc - podwyższona ekspresja cykliny D1

• Rak wątroby - insercyjna mutageneza genu cykliny A (wirus zapalenia wątroby typu B)

• Zaburzenia proliferacji limfocytów u pacjentów po przeszczepach zakażonych wirusem Ebstein-Barr - nadekspresja (zależna od wirusa) cykliny D

Geny kontrolujące podziały:

• Onkogeny - normalnie występuja w komórce jako protoonkogeny, które pod wpływem jakiejs zmiany lub mutacji przekształcają się w onkogeny (np. K-ras, H-ras)

• Geny supresorowe - hamują wzrost i proliferacje komórek, np.:

• TP53

• RB1

• CDKN 2A

• BRCA 1 - rak piersi, rak jajnika

• BRCA 2 - rak piersi, rak prostaty

Śmierć komórki:

• Apoptozę

• Programowana śmirć komórki

• Nekroza

• Autofagia - samotrawienie

• Katastrofa mitotyczna - defekty w punktach kontrolnych cyklu komórkowego (uszkodzenie DNA powstają komórki aneuploidalne

Martwica = nekroza

- proces pasywny, niezależny od ATP

- proces regulowany i enzymatyczny

- przypadkowa i bierna śmierć komórki, przypadkowe cięcie DNA

- przypadkowa destrukcja komórki wywołana poważnymi uszkodzeniami

- niekorzystne działanie czynników zewnętrznych

- wywołana przez uszkadzające czynniki biologiczne, fizyczne i chemiczne (duże dawki)

- uwolnienie hydrolaz z lizosomów

- wywołanie odpowiedzi układu immunologicznego - rozwinięcie stanu zapalnego

- zaburzenia homeostazy grupy komórek, utrata selektywnej przepuszczalności błony oraz napływ wody i jonów (Na i Ca)

- pęcznienie komórki - cytoplazmy i organelli

- utrata zdolności do zachowania równowagi wodno - elektrolitowej

Programowana śmierć komórki (PCD) - proces, który indukuje śmierć pojedynczej komórki podczas rozwoju organizmu w ściśle określonym czasie i miejscu.

Apoptozę:

- komórki łatwe do zastąpienia są podatne na apoptozę

- morfologiczny opis śmierci komórki

- powstają ciałka apoptyczne!

- obkurczanie cytoplazmy i organelli

- kondensacja i fragmentacja chromatyny

- specyficzne cięcie DNA

- zależna od ATP

- warunki fizjologiczne (utrzymanie homeostazy) i patologiczne

- jest wynikiem ekspresji odpowiednich genów

- w wyniku apoptozy dochodzi do rozpadu komórki

- nie powoduje stanu zapalnego

czynniki indukujace apoptozę:

• Fizyczne - promieniowanie UV, X, szok termiczny

• Biologiczne - hormony (glikokortykoidy,płciowe), cykliny, FAS

• Chemiczne - wolne rodniki, leki (antybiotyki, aspiryna), inhibitory enzymów

czynniki hamujace apoptoze

Szlaki sygnałowe apoptozę:

1. szlak prokaspaza 8,10

2. szlak prokaspaza 9

3. szlak prokaspaza 3,7 - przez G…zym

Kaspazy:

• 2 podjednostki połączone fragmentem łącznikowym + część utrzymująca je w formie nieaktywnej

• proteinazy cysternowe specyficznie przecinające wiązania peptydowe od strony karboksylowanej reszty kwasu asparaginowego

• odcinki DED albo CARD

• w żywej komórce są nieaktywne

• inicjujące 8, 10?

• wykonawcze 3, 6, 7, 9?

Kaspazy:

• syntetyzowane jako zymogen

• aktywną enzymatycznie formą jest tetrametr

• powstaję w wyniku autoprotolizy

Szlak indukowany przez receptory śmierci:

• agregacja receptorów śmierci jako wynik oddziaływań receptor-ligand

• tworzenie kompleksu DISC

• interakcja białko adaptorowe - białko efektorowe (pro-kaspaza 8)

• interakcja receptor - białko adapterowe (DD domena śmierci)

Szlak mitochondrialny:

• uwolnieie z przestrzeni międzybłonowej m.in. cytochromu P-450

• przyłączenie cytochromu c do Apaf 1

• energozależna oligomeryzacja cząsteczki Apaf 1

• interakcja Paf-1 - pro-kaspaza 9 (homologiczny motyw CARD) - utworzenie apoptosomu

• uwolnienie aktywnej kaspazy

Szlak mitochondrialny bywa również nazywany szlakiem zależnym od p53 - translokacja p53 w mitochondriom oddziaływanie z białkami Bcl 2, Bcl X permeabilizacja błony komórkowej uwolnienie cytochromu c …

Geny supresorowe:

- p53

- RB 1 (po fosforylacji uwalnia czynniki transkrypcyjne)

Białka Bcl 2 do protoonkogenów

Białka:

• proapoptyczne: Bax, Bak, Box, Bid, Bad, Puma, Bruf, Noxa, Hrk, Map 1

• antyapoptyczne: Bcl 2, Bcl XL, Bcl W, Mcl 1

Czynniki hamujące i inaktywujące apoptozę

Antyapoptyczne	Proapoptyczne
Białka z rodziny Bcl 2	Białka z rodziny Bcl 2 (Bak, Box, Bax, Bcl XS,Bid)
Bialka IAP - hamowanie kaspar	Smac/Diablo - hamuje białka IAP
Białka szoku cieplnego - cytozolowe HSP60, HSP27	Omi/HtrA - degraduje białka IAP
	Białka szoku cieplnego - mitochondrialne HSP60

Pozytywna regulacja apoptozę:

• aktywacja proapoptycznych białek z rodziny Bcl (translokacja do błon mitochondrialnych, oligomeryzacja i indukcja wypływu cytochromu c)

• hamowanie antyapoptyczne białek Bcl 2/Bcl XL przez PUMA, Noxa i Bid

• inhibicja czynnika hamującego apoptozę IAP przez białko Smac/Diablo (inhibicja IAP) oraz przez proteazę serynową

Bid białko łączące szlak zewnętrzny i wewnętrzny apoptozę.

Kaspazy 8 lub 10 tną Bid krótka forma Bid (= tBid) aktywniejsza mitochondrialnie, szlak wewnętrzny; szlak zewnętrzny pobudzany przez PAS

Apoptozę a choroby wirusowe:

• wirus brodawczaka

• wirus ospy krowiej - wytwarzanie białka hamującego proteazy cysternowej, uniemożliwiające im przeprowadzenie apoptozę

• produkcja substancji stymulujących gospodarza do produkcji własnego białka Bcl2

• wytwarzanie białek homologicznych do Bcl-2:

-wirus Epstein-Barra

-wirus mięsaka Kaposieego

Apoptoza a nowotwory - mutacja białka p53

Apoptozę a HIV:

• wolne białko GP 120 wirusa HIV wiąże się z białkiem cd4 limfocytu

• przeciwciało anty HIV łączy elementy CD4 i generuje ekspresje cząsteczki FAS na powierzchni limfocytu

• przełączenie antygenu powoduje ekspresję ligandu FAS

• połączenie cząsteczki FAS z ligandem FAS tej samej, bądź innej komórki powoduje uruchomienie procesu apoptozę i obumarcie komórek

Choroba Alzheimera

• mutacje genów:

• APP (21q21; prekursorowe białko amyloid)

• PSEN 1 (14q24.3; Presemilina 1)

• PSEN 2 (1q31-q42; Presemilina 2)

• β amyloid (βA) powstaje po trawieniu APP w wyniku enzymatycznej aktywacji β i γ-sekretaz - tworzy agregaty w przestrzeni pozakomórkowej tzw. Plaki, blaszki amyloidowi

• alternatywne βA

• zaktywowane kaspazy wykonawcze (głównie 3) tną białko tau, którego krótsza forma tworzy nieprawidłowe włókniste struktury blokując transport aksonem, konsekwencją tego jest samobójcza śmierć komórki

Progerie:

• Zespół Hutchinsona-Gilforda

• Mutacje genu laminy A (odpowiada za prawidłową organizację otoczki jądrowej, nie powstaje z proliny, …..) - 1q21.2

• Dziedziczenie autosomalne recesywne

• Przyspieszony proces proliferacji skutek błędnie odczytywanych sygnałów pochodzących od czynnika wzrostu

• Zwiększona częstotliwość popełnianych błędów przy podziale komórkowym

• Zmiany w budowie jądra

• Brak odpowiedniej organizacji lamin

• Zespół Wenera

• Częstość występowania 1/ 1 000 000

• Pobudzenie nadmiernej ilości do apoptozę

• Zwiększona częstość występowania mutacji genowych

• Zaburzenia w replikacji DNA

• Mutacje genu helikazy DNA (8p12) gen WRN

• Progeria u osób dorosłych

Apoptozę w zawale serca:

• Rozwój wczesnej pozawałowej niedokrwistości serca jest związany ze zwiększonym wskaźnikiem apoptozy komórek mięśnia sercowego

• Indukowana przez czynniki takie jak:

• Niedokrwienie

• Hipoksja

• Czynniki toksyczne

• Apoptoza w strefie otaczającej obszar martwicy

• Uwalniane w trakcie reperfuzji wolne rodniki i wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia sprzyjają apoptozie

• W przebiegu zawału serca apoptozę miocytów występuje w strefie otaczającej obszar martwicy

• Apoptozę kardiomiocytów jest indywidualna przez czynniki taki jak: …………..

Nie było na zajeciach:

Apoptoza

1. faza indukcji (wzbudzenia) - decyzja o śmierci

2. faza wykonawcza - śmierć komórki

- lawinowa reakcja kaspaz (proteaz serynowych)

- tną substraty polipeptydowe

- zagęszczenie i fragmentacja chromatyny

- powstanie ciałek apoptotycznych

3. faza degradacji i fagocytozy

białko Bax - czynnik promujące apoptozę (silny sygnał śmierci)

białko Bcl-2 - protoonkogen hamujący apoptozę (silny sygnał przeżycia)

aktywuje hamuje

hipoksja ⇒⇒⇒⇒Bax⇒⇒⇒⇒Bcl-2

Apoptoza w warunkach fizjologicznych:

• jelito

• skóra (naskórek)

• macica (menstruacja)

• grasica (selekcja)

• komórki uszkodzone

choroba nowotworowa - konsekwencje nagromadzenia w komórce mutacji w wielu genach kontrolujących jej wzrost i przeżycie

apoptoza a choroby neurodegeneracyjne:

- choroba Alzheimera, Parkinsona, Huntingtona, Lou-Gehringa (stwardnienie zanikowe boczne)

choroby związane z zahamowaniem apoptozy:

- nowotwory..........................................................

- przewlekła białaczka limfatyczna

- infekcje wirusowe

przyspieszenie apoptozy:

- AIDS

- choroby neurodegeneracyjne

Telomery:

• mają długość kilku tys. par zasad (5-15 tys.)

• końcowe odcinki chromosomów, chroniące je przed uszkodzeniem

• sekwencje teloremowe zbudowane z krótkich tandemowo powtórzonych wiele tysięcy razy jednostek niekodujących

• u wszystkich strunowców - sekwencje heksanukleotydowe TTAGGG

• w komórkach somatycznych są krótsze niż w komórkach zarodkowych

• nie są replikowane z resztą genomu, ale są dobudowywane enzymatycznie po każdym podziale

• obecność różnorodnych białek wiążących się z telomerami sugeruje ich dodatkowe funkcje

• naprawa przerw

• w starzejących się komórkach telomery się skracają

• po kilkudziesięciu podziałach osiągają krytyczną długość (1,5 kpz)

ĆW.9 NOWOTWORY

Molekularne podłoże nowotworów: mutacje genów pełniących istotną funkcje w komórkach somatycznych, prowadzące do ich niekontrolowanego podziału.

Nowotwór -

Transformacja nowotworowa (kancerogeneza):

- wieloetapowy proces przebiegający od początkowej ekspozycji na kancerogen do nabycia zdolności do przerzutów

- zmienna wrażliwość na czynniki wzrostowe

- utrata zdolności do zahamowania wzrostu komórek

- zdolność do nieograniczonej liczby podziałów (nieśmiertelność)

- oporność na apoptozę

- angiogeneza (powstają unaczynienia)

- ucieczka przed układem immunologicznym

TP53, RB -> supresory kontrolujące pkt. kontrolne (G1/S, G2/M)

Etapy kancerogenezy:

I preinicjacja

- ekspozycja na kancerogeny (nie ma jeszcze rzadziej mutacji w organizmie)

- całe życie

II Inicjacja

- pojedyncza mutacja i dalsze nagromadzenie mutacji

- od kilku do kilkudziesięciu lat

III Promocja

- selekcja klonalna,

- nabywanie zdolności do migracji

- mniej niż kilka lat

IV Progresja - dalsza selekcja mutacji i zdolność do przerzutów

- od miesięcy do kilku lat

Teorie:

1. standardowe - mutacje w genach supresorowych i onkogenach

2. zmodyfikowane standardowe

- istnieją dwie grupy genów

- zmiany w genie inicjują zmiany w genomie

3. wczesnej modyfikacji - karcerogen uszkadza kilka genów odpowiedzialnych za podział komórek; komórki potomne otrzymują niewłaściwą liczbę chromosomów

4. pananeuploidia - błąd w podziale komórki prowadzi do powstania komórek aneuploidalnych; aneuploidalne komórki umierają, ale część przeżywa i daje początek nowotworowi

zmiany genetyczne są przyczyną rozwoju nowotworu

geny mutatorowe - aktywna w przypadku nieprawidłowego sparowania zasad w nowo syntetyzowanej nici DNA, predysponują do powstawania nowotworów; geny naprawiające DNA przez wycięcie zasady, aktywne w przypadku np. niepolipowatego raka jelita grubego - HNPCC, 6% przypadków raka okrężniczo-odbytniczego. Chorzy z HNPCC mają mutację terminalną tj. w lini zarodkowej; również predysponują do powstania nowotworów (biorą udział w naprawie DNA -> naprawiają DNA przez wycięcie zasady) MSH 2, MCH 1, PMS 1, PMS 2, MSH 6 (glejak wielopostaciowy).

protoonkogeny:

- prawidłowa produkcja protoonkogenów reguluje podziały, wzrost, różnicowanie i dojrzewanie komórek (pozytywne regulatory wzrostu)

- są normalnymi genami występującymi we wszystkich komórek

- uszkodzenie protoonkogenu powoduje jego niekontrolowana większą aktywność

Protoonkogeny:

1. regulatory cyklu komórkowego (stymulują proliferacje komórek)

2. białka biorące udział w apoptozie

3. białka inne np.: tworzące kanały jonowe

Rodzaje produktów protoonkogenów:

• białka wykazujące aktywność kinezy tyrozynowej i serynowej

• czynniki wzrostu (PDGF, FGF), i ich receptory: EGF, M-CSF

• czynniki transkrypcyjne

• białka G związane z błoną cytoplazmatyczna, GTP

• regulatory cytoplazmatyczne

Mechanizm aktywacji protoonkogenów:

• mutacja punktowa np. Ki-RAS w gruczolaku trzustki

• amplifikacja = przemieszczenie np. N-MYC w nerwiaku zarodk.

• translokacja chromosomowa np. C-MYC t(8:14) w chłoniaku Burkitta

• integracja retrowirusowa - poddanie protoonkogenów kontroli silnego promotora lub sekwencji wzmacniających

Aktywność pojedynczych onkogenów nie wystarcza do wystąpienia translokacji.

Onkogeny - geny powodujące nowotwory, może stać się nim gen należący do grupy protoonkogenów, na skutek zmiany w sposobie ekspresji

Onkogenne retrowirusy:

- u zwierząt: RSV (wirus mięsaka Rousa, v-onkogen SRC), BLV (wirus białaczki bydła)

- u ludzi: HTLV-1 i 2 wirus ludzkiej białaczki T-komórkowej

Wirusy DNA u ludzi:

- HPV - wirus brodawczaka ludzkiego

- EBV - wirus Epstein-Barr - rak jamy nosowo - gardłowej

- KSHV - mięsaka Kaposiego

- HBV - zapalenie wątroby typu B

Geny supresorowe:

- prawidłowy produkt ogranicza wzrost i różnicowanie komórek - negatywny regulator wzrostu.

- wyeliminowanie funkcji (poprzez mutacje delecje lub całego genu) przyczynia się do rozwoju nowotworu

- recesywny efekt…………..

- kontrolują przebieg transkrypcji i replikacji

- biorą udział w przekazywaniu sygnałów

Funkcje genów supresorowych:

• w jądrze komórkowym pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych, regulują cykl komórkowy

• w cytoplazmie uczestniczą w przekazywaniu sygnałów pomiędzy błoną komórkową a jądrem

• w błonie komórkowej receptory dla sygnałów zewnątrzkomórkowych i biorą udział w adhezji

Geny podatności na zachowanie na nowotwór:

- BRCA 1, BRCA 2 - dziedziczny rak sutka i jajnika

- MSH 2, MLH 1, PSM 1, PSM 2 - rak jelita grubego na podłożu niepolipowatości

Angiogeneza w procesie nowotworowym:

1. niedotlenienie tkanek

2. wytwarzanie i uwalnianie czynnika wzrostu naczyń np. VEGF

3. związanie z receptorami na powierzchni komórek śródbłonka i ich pobudzenie

4. pobudzenie do syntezy enzymów (metaloproteinazy, aktywator plazminogenu, plazmina)

5. migracja pobudzonych komórek śródbłonka w kierunku komórek nowotworowych

6. przeciąganie i „zakotwiczenie”

Czynniki chemiczne:

1. prekancerogeny (ulegają przemianom metabolicznym w organizmie, nie są bezpośrednią przyczyną)

policykliczne węglowodory aromatyczne: dym tytoniowy, smażone tłuszcze zwierzęce, wędzone ryby i mięso, dym fabryczny i smary, środki konserwujące

aflatoksyna

2. kancerogeny aktywne (ulegają przemianom)

związki alkalizujące

3. kokancerogeny

czynniki współrakotwórcze, dym papierosowy + alkohol, dieta wysokokaloryczna, hormony

Czynniki fizyczne:

1. promieniowanie jonizujące (rentgenowskie, cząsteczkowe, kosmiczne)

• powoduje powstawanie wolnych rodników tlenowych, uszkadzających DNA

• wywołuje białaczkę, nowotwory tarczycy, sutka, płuc, ślinianek i skóry

• promieniowanie ultrafioletowe (UV A, UV B)

• indukuje mutacje

• powoduje powstawanie dinerów pirymidynowych

• powstawanie raka podstawnokomórkowego oraz płaskonabłonkowego skóry i błon śluzowych

Czynniki biologiczne:

Wirusy, toksyny bakteryjne i pasożytnicze; zaburzenia hormonalne np. nadmiar estrogenów; wirusy onkogenne: WZW, HPV, EBV.

Teoria Vogelsteina: ścieżka rozwoju nowotworu -> tor mutagenowi

Transformacji nowotworowej towarzyszy od kilku do kilkunastu niezależnych mutacji w różnych genach, kolejne mutacje coraz bardziej zmieniają fenotyp komórki na nowotwory.

Model Volgelsteina ewolucji genetycznej i histologicznej raka jelita grubego (tzw. Vogelgram)

Ścieżka rozwoju raka jelita grubego:

Normalny nabłonek (utrata 5q APC) hiperplazja nabłonka (hipometylacja DNA) wczesny gruczolak (aktywacja Ki-RAS) pośredni gruczolak (utrata DCC) późny gruczolak (utrata P53) rak przerzuty

Odsetek nowotworów uwarunkowanych rodzinnie wynosi 10-20%, rozwijają się one w wyniku predyspozycji jedno lub wielogenowej.

Grupa genów, których mutacje zwiększają szanse na rozwój nowotworu to geny podatności (wrażliwości, predyspozycji)

Geny ulegają zmianom genu metabolizmu podstawowego komórki

1. utrata genu APC (nabłonek)

2. hipometylacja DNA (nabłonek hiperplazja)

3. aktywacja Ki-RAS (wczesny gruczolak)

4. utrata DCC (pośredni gruczolak)

5. utrata TP53 (późny gruczolak; rak przerzuty)

Dziedziczny niepolipowaty rak jelita grubego HNPCC:

- mutacje genów MHR(MLH1, MSH2, MSH6)

- występowanie ok. 15-20 lat wcześniej

- prawostronna lokalizacja zmian

- agregacja rodzinna choroby

- wieloogniskowość zmian

Zespół Lyncha I - rak dotyczy tylko jelita grubego

Zespół Lyncha II - z rakiem jelita grubego występują nowotwory złośliwe żołądka, nerek, skóry, jajnika lub endometrium.

Kryteria amsterdamskie stwierdzonej HNPCC: (WSZYSTKIE 3 MUSZĄ BYĆ SPEŁNIONE!)

- 3 lub więcej krewnych z histologicznie potwierdzonym rakiem jelita grubego, w tym jeden krewny 1 stopnia w stosunku do pozostałych

- co najmniej w 2 pokoleniach rak jelita grubego

- 1 lub więcej przypadków w rodzinie rozpoznanych przed 50 rokiem życia

Rodzinna polipowatość jelita grubego (FAP) mutacja genu APC:

- autosomalne dominujące

- wiele polipowatych zmian w obrębie jelita grubego

- w 2 dekadzie życia

- prowadzi do powstania nowotworów ok. 40 roku życia

- możliwe współistnienie z nowotworem OUN (zespoł Turcota)

- możliwość polipów i zmian guzowatych w innych narządach

- profilaktyczna kolektomia

Mutacja genu APC - skrócenie białka APC od C-końca i akumulacja β-kateniny w jądrze, efekt dominujący negatywny, skrócone białko wiąże się z białkiem niezmienionym aktywując drugi allel.

Patogenetyczne ścieżki rozwoju glejaka wielopostaciowego de novo

Glejak wielopostaciowy:

- najczęstszy nowotwór OUN

- 4 stopień złośliwości

- większość chorych nie przeżywa 5 lat

de novo: astrocyt glejak pierwotny (glioblastoma) - dotyczy osób starszych, mutacje ekspresji EGFR; wiek 55 lat

progresja astrocytów





gwiaździak G II gwiaździak G III (anaplastczny)





glioblastoma (glejak wtórny - dotyczy osób młodszych, mutacje ekspresji TP53; wiek 35 lat)

Najważniejszym typem w tym guzie oprócz amplifikacji EGFR jest mutacja - wariant III

EGFR v III

- biologicznie nadaje przewagę wzrostową komórkom glejaka w porównaniu z wt. EGFR

- odmienność antygenowa……………………………..?

Skąpodrzewiaki anaplastyczne (kliczne amplifikacje zaburzeń genetycznych)

- częsta obecność LOH 1p i 19q

- LOH 1p jest wyznacznikiem wrażliwości na chemioterapię, na leczenie PCV

Utrata chromosomu 1p i 19q - 100% wrażliwości na chemioterapeutyki

utrata 1p i innego zaburzonego genu - 100%

zachowany chromosom 1p i mutacja TP53 - 33%

zachowany chromosom 1p i wt. TP53 - 18%

Podział raka sutka (na podstawie badań molekularnych)

- in situ rak

- rak inwazyjny

Rak sutka i trzonu macicy są uwarunkowane hormonalnie np. mogą być stymulowane przez raka jajnika nadprodukującego estrogeny. Czynnikiem ryzyka w rakach sutka, trzonu macicy, prostaty jest otyłość, tkanka tłuszczowa produkuje hormony, dieta też ma wpływ.

Rak sutka etiologia:

1. dieta bagatokaloryczna

2. czynniki reprodukcyjne: wczesny początek miesiączkowania, bolesność, późny wiek pierwszej ciąży, późny wiek menopauzy

3. zaburzenia równowagi hormonalnej

4. otyłość

Uwarunkowanie genetyczne raka sutka:

- nieznane 54%

- BRCA 1 - 20%

- BRCA 2 - 20%

- CHEK 2 - 5%

- TP53 - <1%

Genotypowy podział raka sutka:

1. Luminal A, B, C

2. Basal (podtyp bazalny, najkrótszy okres przeżycia): CK 5/6+ ; CK 17+

3. Normal breast-like

4. Erb B2 - positive (Her2+)

Odczyny detekcji w raku sutka:

1. immunohistochemiczny

• HER 2; stopnie 0, +1, +2, +3 - tylko +3 zostaje skierowany do leczenia herceptyną (lek na raka sutka; blokuje ekspresję genu HER2, hamuje jego proliferację)

Zespół dziedzicznego raka sutka i jajnika (HBOC):

- BRCA 1 (185 delAG; 538 insC)

- BRCA 2 (617 delT)

- naprawa dwuniciowego DNA

- regulacja interakcji chromosomów siostrzanych

- zwiększa ryzyko wystapienia nowotworów jajnika, jelita grubego, macicy oraz drugiego sutka

dziedziczny rak piersi - penetracja 30 - 80 %

Nosicielstwo mutacji BRCA2:

• przed 50 r.ż. 33-50%

• przed 70 r.ż. 56-87%

• nowotwór jajnika przed 70 r.ż. 27-44%

Kryteria wrodzonego raka piersi:

• kilka osób w rodzinie

• rozpoznanie przed 35 r.ż.

• rak rdzeniasty piersi

• dwustronny rak przed 50 r.ż.

• rak piersi i jajnika u tej samej kobiety

• rak piersi u mężczyzny

Postępowanie w przypadku stwierdzonej mutacji:

• Samobadanie piersi co miesiąc

• Badanie piersi przez lekarza raz na pół roku

• USG piersi co 6 miesięcy (od 25 roku życia)

• Badanie ginekologiczne co pół roku

• Mammografia co rok (od 35 roku życia)

• USG jamy brzusznej co rok (od 30 roku życia)

• Oznaczanie antygenu Ca 125 co rok (od 35 roku życia)

• Profilaktyczne obustronne usunięcie jajników i jajowodów lub mastektomia (grupa wysokiego ryzyka)

GIST (gastrointestinal stromal tumor) - zmiana w obrębie receptora C-KIT; rzadki nowotwór przewodu pokarmowego wymaga różnicowania z innymi nowotworami mezenchymalnymi (mięsnak ….)

Translokacje chromosomowe:

1. deregulacja onkogenów zlokalizowanych w miejscach złamań chromosomów w skutek przemieszczenia w pobliże elementów regulatorowych; głównie w nowotworach układu oddechowego

2. fuzja fragmentów z genów w miejscach złamań -> utworzenie nowego mozaikowego

transkryptu głównie w rozrostach szpikowych i guzach…

np. chłoniak Burkitta (wynik translokacji genu c-MYC znajduje się pod kontrolą promotora………

Kryteria określające predyspozycje rodzinne do nowotworów:

- pojawienie się nowotworu u osób młodszych, np. rak jelita grubego 45 rok życia

- występowanie obustronne genów w narządach parzystych

- dwa różne nowotwory u tej samej osoby np. rak sutka i jajnika

- nowotwory u kilku krewnych pierwszego stopnia, np.: matka-córka

Większość dziedziczona autosomalnie dominująco.

Dziedziczenie jednogenowe autosomalne dominujące:

- występuje w każdym kolejnym pokoleniu (transmisja pionowa)

- występuje u mężczyzn i kobiet

- pojawia się u blisko 50% krewnych

- coraz młodszy wiek (antycypacja)

W genach supresorowych:

- zespół Li-Franmeni

- mutacje w obrębie genu TP53,

- charakteryzuje się rozwojem szeregu nowotworów;

- tkanki miękkie: mózgu, kory nadnerczy, kości

- rozpoznawany przed 45 rokiem życia

- w przeciwieństwie do innych dziedziczonych zespół nowotworowych LSF wyróżnia się występowaniem wielu różnych rodzajów

- rak piersi, mięsak

- zespół siatkówczaka

Zespoły skórno - mięśniowe = FAKOMATOZY

• stwardnienie guzowate (TSC) = choroba Bourneville'a

• dziedziczony autosomalnie dominująco

• zmiany hamartomatyczne i nowotworowe w OUN a także innych narządach: nerki, wątroba

• SEGA - gwiaździak podwyściółkowy olbrzymiokomórkowych

• mutacje w jednym z dwóch genów: TSC1 lub TSC2

Nerwiakowłókniakowatość:

• obwodowa NF1 (17p) - gen kodujący neurofiblominę, która jest głównym regulatorem w komórkach Schwanna

• ośrodkowa NF2 (22g) - gen supresorowy zbudowany…..

Marker molekularny - każda zmiana (jakościowa i ilościowa), która pojawia się w makrocząsteczkach funkcjonalnych, w danej komórce nowotworowej jako bezpośredni wynik transformacji nowotworowej tej komórki lub postępującego jej klonalnego rozrostu wyróżniamy:

- Marker biochemiczny - zmienione białko lub aktywność enzymatyczna określonego białka, np. α-ketoproteina

- Marker genetyczny - zmiana w strukturze, sekwencji, lub ekspresji materialu genetycznego

Zastosowanie markerów genetycznych:

1. diagnozowanie chorób genetycznych

2. badanie klonalności

3. prognozowanie przebiegu choroby

4. wybór terapii

5. monitorowanie terapii

6. badanie predyspozycji do zapadalności na choroby nowotworowe

Utrata heterozygotyczności - zjawisko w czasie badania na żelu agarozowym wykazujące zniknięcie 1 allela

Poradnictwo genetyczne:

- weryfikacja wystąpienia nowotworu rodzinnego

- opieka nad członkami rodziny zagrożonej wystąpieniem choroby nowotworowej

Geny selekcyjne:

- marker selekcyjny - gen, który nadaje transformowanym komórkom oporność na czynniki selekcyjne np. geny oporności na antybiotyki

- gen reporterowy - nadaje transformowanym komórkom cechę łatwą do wykrycia np. białko zielonej fluorescencji.

Terapia genowa nowotworów:

1. pośrednia

• geny immunomodulujące

• geny antyangiogenne

2. bezpośrednia

• geny samobójcze

• geny proapoptotyczne

geny immunomodulujące:

- poprawa odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza

- białka kodowane przez te geny

- „szczepionki p/nowotworowe”

- peptydy nowotworowe - próby kliniczne w czerniaku

geny antyangiogenne:

- hamowanie komórkowego sygnału pobudzającego rozrost nowych naczyń

- geny angiostatyny i endostatyny

- działanie substancji hamujących

geny samobójcze:

- wprowadzanie genów aktywujących prekursory leków w komórki nowotworowe

- kodowany enzym umożliwia aktywację proleku

- efekt sąsiedztwa

geny proapoptotyczne

- przywracanie wrażliwości komórek nowotworowych na apoptozę

ĆW.10 BIOLOGIA MOLEKULARNA A STARZENIE SIĘ

Pseudogen - jest to niedziałająca kopia genu, zawierająca np.: błędy w obszarze kodującym, co sprawia, że zawartej w nim informacji genetycznej nie można odczytać.

Pseudogeny powstają na drodze duplikacji genu i uszkodzenia dodatkowej kopii lub na drodze retropozycji, czyli odwrotnej transkrypcji mRNA danego genu i integracji do genomu.

Retropseudogeny nie posiadają sekwencji regulatorowych.

Limit Hayflick'a każda komórka ma zaprogramowany wiek, ma określona ilość podziałów, po czym następuje śmierć.

Kom. ludzkie w hodowli dzielą się ok. 50x i umierają.

Mechanizmy starzenia:

1. Telomerowa teoria starzenia

2. Teoria modyfikacji białek

3. Teoria stochastyczna

4. Teoria mutacji genowych

5. Teoria osłabionej naprawy DNA

Ad. 1

• im starsze komórki tym krótsze telomery

• w progeriach obserwuje się szybszą utratę telomerów

• kom. nowotworowe - replikacyjnie nieśmiertelne telomerazy, mają stałą długość telomerów, dzięki aktywności telomerazy

• sekwencje telomerowe (na końcu chromosomu) - bogate w G (TTAGGG)n

• ale!! większość kom. somatycznych ma ogromną ilość podziałów i nie jest możliwe tak silne skrócenie telomerów, aby nastapiła utrata dużej liczby genów, nie zidentyfikowano też żadnego genu, którego utrata powodowałaby starzenie

• nowotwory, które nie mają telomerazy drastyczne przyspieszenie progresji nowotworowej

• z każdym podziałem komórki tracą 50 - 100 zasad

• skrócone telomery mogą być sygnałem do zaprzestania podziałów przez komórkę

• telomeraza = białko + RNA matryca do syntezy krótkiej nici (białko przyłącza nukleotydy do krótkiej nici)

• nowotwory eliminacja p53

Ad.2

• narastające zmiany w białkach uszkadzają komórkowe procesy aż do zablokowania prawidłowego jej funkcjonowania

• za zmianę prawidłowej funkcji białek odpowiadają różne zmiany potranslacyjne powstawanie różnych połączeń między cząsteczkami i ich modyfikacja, np.: białko-białko, białko-lipid; spada synteza białek;

• denaturacja białek

• w starszych komórkach przeważają mechanizmy modyfikacji

Ad.3

• przypadkowe zmiany wprowadzają regularne zmiany (fenotyp starzenia) starzenie jest wywołane przez akumulację uszkodzonych zmian

• uszkodzone makromolekuły gromadzą się poprzez gromadzenie: przypadkowych uszkodzeń nie naprawianych przez systemy kom. lub gromadzenie przypadkowych…?

• im bardziej upakowana chromatyny tym mniejsze prawdopodobieństwo mutacji

Ad. 4 i 5

• Z wiekiem obserwuje się nagromadzenie mutacji (starzenie DNA), które mogą prowadzić do zmian funkcji białek.

• Z wiekiem spada też wydajność naprawy DNA akumulacja mutacji

• Uszkodzenie DNA zatrzymanie replikacji poprzez aktywację genów pkt. restrykcyjnych

• Duże uszkodzenia w obrębie DNA uruchamiają apoptozę. Zabezpiecza to przed rozwojem nowotworów, hamując jednocześnie zdolność do odnowy kom. w populacji kom. niedzielących się.

• Zdolność do naprawy DNA jest proporcjonalna do zapotrzebowania na tlen przez różne gatunki.

• Wysoki współczynnik naprawy DNA występuje w org. długo żyjących. Słoń i człowiek mają najlepsze mechanizmy naprawcze.

• W młodych komórkach wyższy współczynnik naprawy.

• Skrócenie życia po ekspozycji na UV spowodowane dimeryzacją tymidyny w nici DNA i pobudzając system naprawy DNA

• Wydłużenie życia jeśli po ekspozycji na UV przeprowadzono fotoreaktywację (odwrócenie procesu dimeryzacji)

• Mutacja polimerazy uszkodzenie mitochondriów ukierunkowanie do apoptozy

*Teoria akumulacji odpadów w komórce:

• Nagromadzenie lipofuscyny nierozpuszczalne agregaty (30%) skraca życie komórki.

• Teoria wolnorodnikowa reaktywne formy tlenu (ROS) uszkadzają DNA, białka, lipidy, z wiekiem uszkodzenia się gromadzą.

• Podawanie witaminy E (antyoxydantów) nie przedłuża życia!

*Zmiany hormonalne a starzenie:

• Niski poziom hormonu wzrostu (GH), a także IGF-1 oraz osłabienie drogi sygnalizacyjnej zależnej od IGF-1 wydłuża życie

• Mutacje daf-2 (receptor dla IGF-1) i age-1 (kaskada sygnałowa IGF-1 wydłużają życie

• 100-latkowie maja niski poziom IGF-1 oraz wysoką wrażliwość na insulinę

• osoby cierpiące na gigantyzm żyją krócej

*Ewolucyjne teorie starzenia:

1. starzenie jako adaptacja: starzenie jako cecha przystosowawcza, żeby nastepne pokolenia mogły zaistnieć

2. antagonistyczno - plejotropowa: starzenie wynika z akumulacji mutacji, które dają większą rozrodczość w młodym wieku, ale wpływają niekorzystnie w wieku późniejszym

3. disposable soma: komórka ma ograniczoną ilość energii, która może całkowicie poświecić na utrzymanie zdrowej kom.(długowieczność), ale wszystkie organizmy muszą się rozmnażać i dużo energii jest na to zużywane , a na tym z kolei cierpi sama komórka, która akumuluje uszkodzenia, co objawia się starzeniem.

*Dieta niskokaloryczna wydłuża życie szczurów:

niski poziom glukozy, insuliny, cholesterolu we krwi, zwiększenie wrażliwości komórek na insulinę

spadek ciśnienia krwi

lepsza naprawa DNA!

wyższa sprawność umysłowa: lepsza pamięć u starszych zwierząt

mniej kalorii = mniej chorób

wady: zwierzęta rosną wolniej i osiągają mniejszą masę maxymalną; opóźnione

dojrzewanie płciowe; krótszy okres płodności; spadek temp. ciała; wrażliwość na zmiany

temp.

Człowiek: średnia długość życia 75 lat, max.122

*deacylacja p53 i ka70 hamowanie apoptozy

deacylacja DNA się zwija, przebiega pod wpływem NAD

deacetylanySir2 (NAD-zależna…?)i SIRT1 - hamowanie białka PPARγ

Sir2 stabilność rDNA długowieczność

ĆW.11 PRIONY

Priony:

• Śmiertelne choroby neurodegeneracyjne

• Zakaźne w warunkach naturalnych i eksperymentalnych

• Długi okres inkubacji bez odpowiedzi immunologicznej organizmu

• Charakterystyczne zmiany neuropatologiczne i ubytki w tkance mózgowej

pasażowane encefalopatie (amyloidozy) gąbczaste (patogenne jest tylko białko). Jest to białko identyczne, ale inne w strukturze II i III rzędowej.

Amyloidozy - nieprawidłowe fałdowanie bialka, nierozpuszczalne, toksyczne agregaty białkowe odkładają się w tkance w postaci włókien konfiguracji β.

PRION - bialkowa cząsteczka infekcyjna pozbawiona kwasu nukleinowego PROteinaceous INfectious particle

Gen PRNP - koduje prawidłowe komórkowe bialko PrP^C (cellular-c); konwersja do patologicznej formy PrP^SC (Sc- scrapie)

Prion:

• białko (sialoglikoproteina) 1982

• glikoproteina zakotwiczona w błonie komórkowej za pomocą kotwicy GPI (glikozylofosfadylo inozytol) + powtórzenia oktapeptydów wiążące jony Cu 2+ (mostek S-S, który stabilizuje strukturę III-rzędową białka

• peptyd sygnałowy potrzebny do transportu białka przez błonę (jak nie jest potrzebny to jest usuwany)

• produkt genu PRNP

• 2 izoformy

PrP^C - izoforma komórkowa (prawidłowa)

PrP^SC - izoforma patologiczna (infekcyjna) (więcej β-fałd, bardziej złożona 2 i 3 rzędowa budowa, gen dla niego jest na krótkim ramieniu 20 chromosomu)

PrP^res

PrP^d

• konserwatywne białko

• gen kodujący - PRNP (u człowieka chromosom 20)

Białko prionu człowieka:

- 253 aminokwasy

- występuje w wielu tkankach organizmu

- 22 aminokwasy N - końcowe - służą za sygnał peptydowy dla translokacji białka przez błonę

- fragment C - końcowy tworzy 3 helisy α i dwie krótkie przeciwrównoległe nici β.

- dwa miejsca N - glikozylacji - Asp 181 i 197 - produkowane w ER przechodzi przez aparat Golgiego (modyfikacja potranslacyjna) na zewnętrznej powierzchni końców przyczepione za pomocą GPI

- niektóre cząsteczki stale krążą między powierzchnią komórki a szlakiem endocytozy (ok. 1 h) - miejsce konwersji do PrP^SC

- 10% utworzonych cząsteczek jest degradowanych w cytozolu

- 5 h - okres półtrwania

Rola:

• homeostaza wapnia

• odpowiedzialne za procesy uczenia

• regulacja presynaptycznych stężeń miedzi

• aktywność i lokalizacja nieodwracalnej syntazy NO (nNOS)

• transmisja sygnałów na powierzchni komórki

• adhezja komórkowa

PrP^C:

- 43% - α helisa

- 3% struktury β

- monomer w błonach komórkowych

- rozpuszczalna w detergentach wrażliwa na trawienie proteazami (np:. proteinaza K)

- 2 reszty cukrowe występujące na zewnątrz

- ulega ekspresji w różnych rodzajach tkanek

- najwyższy poziom tego białka w mózgu

- gen obecny u ssaków

- przypuszczalnie:

- transport i metabolizm Cu 2+

- przekazywanie sygnału do komórek, kontakt między komórkami

- różnicowanie komórek

- apoptozę

- reakcja na stres

PrP^SC:

- 30% α helisa

- 43% β - fałdowane

- niewrażliwe na proteazy K

- tworzy włókienka + kilkanaście aminokwasów odciętych

- zdolność do tworzenia amyloidu

- nierozpuszczalne w detergentach (trudności z badaniem)

- duże agregaty pozakomórkowo

- albo zjadliwy albo spontanicznie się tworzy, nie namnaża się a przekształca nasze zdrowe białka w białka sc

PrP^S PrP^SC (zmiana konformacji na β, sekwencja aminokwasowi pozostaje taka sama)

Rys.

U zwierząt:

- scrapie - trzęsawka (owce, krowy muflony)

- encefalopatia gąbczasta bydła (choroba szalonych krów, BSE - bovine spongiform encephalo, u kilku gatunków antylop, 3 gatunków onyksa, eluda wielkiego kudu i bizona.

- przewlekła choroba wyniszczająca jeleni (CWD), występuje u kilku gatunków małych jeleni i jelenia królewskiego Wapiti w USA

- encefalopatie przepasażowane, bo przekazywane na inne gatunki zwierząt:

- encefalopatia gąbczasta norek

- encefalopatia gąbczasta kotów - koty domowe, gepard, tygrys, puma

- encefalopatia gąbczasta strusia

Pasażowalne amyloidozy mózgowe u ludzi:

- kuru

- choroba Creutzfelda - Jacoba

- sporadyczna sCJD (1-2 przypadki/1mln populacji; samoistna; z nią możemy mieć doczynienie

- rodzinna fCJD (10% )

- jatrogenna iCJD - przeszczep rogówki, opony twardej (przepasażowanie)

- wariant vCJD (po spożyciu zakażonego mięsa)

- dziedziczne mutacje w genie PRNP, bardzo rzadkie choroby:

- choroba Gerstmanna - Strauslera - Scheinkera

- śmiertelna rodzinna bezsenność (FFI)

choroba Creutzfelda - Jacoba - sCJD sporadyczna:

- 1:1 000 000 osób w populacji na rok

- średni wiek zakażonych - 65 lat

- przyczyna: spontaniczna konwersja PrPc w PrPsc lub czynniki środowiskowe (?Nie wiadomo do końca)

- opisano po raz pierwszy w latach 20-tych XX wieku przez H. Creutzfelda i A. Jakoba

- nie można postawić diagnozy przyżyciowo

- definitywna diagnoza po śmierci

- białko 14-3-3 w płynie mózgowo-rdzeniowym

- definitywna sCJD badanie histopatologiczne:

- typowy obraz neurologiczny lub/i

- stwierdzenie złogów PrP (immunohistochemicznie) zobaczymy na żelu

- lub/i PrP opornego na proteinazę K (Western Blotting) zobaczymy na żelu

- lub/i włókienek związanych ze scapie (ultrastrukturalnie)

Neuropatologia:

- zmiany gąbczaste w głębokich warstwach kory

- zaniki neuronów

- duże rozrośnięte astrocyty

- obecność białka PrPsc ( skupiska między komórkami)

Brak nieinwazyjnych badań potwierdzających definitywnie chorobę, definitywnie post-mordem.

Kryterium diagnostyczne sCJD

- przyżyciowo: prawdopodobna sCJD

- szybko postępujące otępienie (kilka miesięcy)

- co najmniej 2 z objawów:

- mioklonie

- zaburzenia widzenia lub zaburzenie móżdżkowe

- zaburzenia piramidowe/ pozapiramidowe

- ???? mutyzm kinetyczny

- typowy EEG i/ lub dodatni test dla bialka 14-3-3 w płynie mózgowo-rdzeniowym (przy chorobie trwającej poniżej 2 lat)

- badanie:

- EEG

- CT (mogą być zmiany zanikowe w ostatnich stadiach choroby lub brak zmian)

- MR:

- hiperintensywny sygnał w obrębie skorupy jądra ogoniastego
i okołokonarowo

- w ciągu 3 miesięcy intensywność sygnału się zwiększa

- płyn mózgowo-rdzeniowy (białko 14-3-3)

Badania laboratoryjne:

- białko 14-3-3 w płynie mózgowo - rdzeniowym, ale trzeba wykluczyć inne choroby mózgu, uszkodzenia; czułość 96%, swoistość 88%

- białko MAP - τ (1530pg/ml) swoistość 100%, czułość 94,7%

- białko S-100 (czułość 84,2%, swoistość 90,6%)

Bialko 14-3-3:

- normalnie nie występuje w płynie mózgowo-rdzeniowym

- grupa białek

- wiąże się z różnymi białkami komórkowymi

- uczestniczą w regulacji procesów biologicznych: rozwój …, kontrola wzrostu i cyklu komórkowego

- wykonuje się Western Blotting

- występuje w neuronach, z których mogą być uwalniane w wyniku uszkodzenia stąd w płynie mózgowo-rdzeniowym, jeśli dodatkowo jest krew (to pochodzą z erytrocytów a nie koniecznie z uszkodzonych neuronów)

- obecność 14-3-3 może świadczyć o rozpadzie neuronów

- wykrywane w płynie mózgowo-rdzeniowym (Western Blotting) u ok. 90% sCJD i 50% vCJD

- wynik dodatni włączony przez WHO do kryteriów diagnostyki sCJD u chorych z postępującym otępieniem trwającym krócej niż 2 lata

WYNIK PRZYKŁADOWY

„+” 14-3-3 ≠ CJD marker rozpadu neuronów, nieswoisty wyłącznie dla CJD

Inne badania laboratoryjne:

- MAP - tau, S - 100b (ilościowe testy ….) w płynie mózgowo-rdzeniowym

- podwyższony poziom tych białek może towarzyszyć nie tylko przy CJD, ale również innym chorobom

Polimorfizm kodonu 129-tego:

- genotyp heterozygotyczny - 129 ^{Met Val} - 51%

- homozygoty - 129 ^{Met Met} - 38%

- 129 ^{Val Val} - 11%

- v CJD - 129^{Met Met} ???

Homozygoty sa bardziej podatne na choroby prionowe, natomiast jak jest heterozygota - to choruje ale spowolniony rozwój choroby.

Wielkość PrP po deglikozylacji na żelu

- 21 kDa (1)

- 19 kDa (2)

Polimorfizm kodonu 129 (Met lub Val)

- MM

- VV

- MV

Genotyp a choroby pionowe:

- podatność na choroby sporadyczne i jatrogenne

- homozygoty Met/Met i Val/Val

- w chorobach dziedzicznych i wpływ na objawy (łącznie z mutacjami w genie PRNP)

- vCJD - homozygoty Met/Met

Formy białka:

- glikozylacji - 4 typy

- diglikozylowych - z 2 resztami

- monoglikozylowych - z 1 resztą

- bez glikozylacji

Odmiana:

1. MM1 i MV1:

- 70%

- 3,9 miesiąca

- postać Heidenheima, miokloniczna

- szybko narastające otępienie

- mioklonie

- typowe EEG

- objawy wzrokowe i objawy jednostkowe w 40%

2. VV1:

- 18%

- 6,5 miesiąca

- postać móżdżkowa

- objawy początkowe - ataksja, późne otępienie, brak typowego EEG

3. MV2:

- 9%

- 17,1 miesiąca

- postać z blaszkami kuru

- ataksja i postępujące otępienie

- brak typowego EEG

- długi przebieg > 2 lat

4. MM2-T:

- odmiana wzgórzowa

5. MM2-C tj. CJD:

- 2%

- 15,7 miesiąca

- bezsenność, ataksja, otępienie

6. VV2:

- 1%

- 15,3 miesiąca

- postępujące otępienie

- brak typowego EEG

jatrogenna CJD

- postępujący zespół móżdżkowy u chorych leczonych preparatami przysadki mózgowej

- hormon wzrostu

- gonadotropiny

- przeszczep opony twardej

- zabiegi neurochirurgiczne

- przeszczep rogówki

- samoistny CJD z innym rozpoznany czynnikiem ryzyka (np. przeszczep opony twardej, zabiegi neurochirurgiczne, przeszczepy rogówki)

Obraz kliniczny po podaniu GH:

• dominuje zespół móżdżkowy

• zaj. jąder kresomózgowia

• min. zespół otępienny

• brak typowego EEG

wariant CJD (vCJD)

- z chorych na scrapie owiec przerobionych na mączkę kostną na krowy na człowieka

- opisane w 1996 roku

- jest wynikiem przepasażowania encefaloptii gąbczastej bydła (BSE) na człowieka

- średni wiek zakażonych 28 lat (14-74)

- przebieg choroby >12 miesięcy (416 dni)

- 161 przypadków

- nierozszczepienie białka PrPsc nie tylko w OUN, ale także tkanki obwodowe np.: limfatyczne (migdałki, kępki Peyera, przewód pokarmowy, wyrostek robaczkowy)

Najpierw występują objawy psychotyczne, otępienie dopiero w fazie końcowej; objawy bólowe dotyczą kończyn dolnych.

objawy kliniczne:

• zaburzone zachowanie (lęk, agresja, depresja)

• dyzestezja i bóle kończyn dolnych utrzymujące się przez cały okres choroby

• ataksja (wcześnie)

• otępienie (późno)

• brak typowego EEG

• dominują objawy psychotyczne

• nie ma typowego EEG

	sCJD	Vcjd
Średni wiek	66	28
Średni czas trwania (miesiące)	4	13
Objawy psychiatryczne	Rzadko	Często
Postępujące otępienie	Często	Rzadko
Objawy czuciowe	Rzadko	Często
Mioklonie	Często	Często

NIE MA MUTACJI!!! Ani w wariancie ani w sporadycznej!!!

Czy vCJD pochodzi od BSE???

- identyczny obraz neuropatologiczny BSE po pasażu na naczelne

- identyczny okres inkubacji oraz obraz neurologiczny po przepasażowaniu na myszy transgeniczne

- identyczny wzorzec glikozylacji z przewagą form dwuglikozylowanych

Prawdopodobnie:

I A postępująca choroba neuropsychiatryczne

B przebieg > 6 miesięcy

C rutynowe badania nie sugerują innego rozpoznania

D brak wywiadu jatrogennego

II przynajmniej 4 z 5 poniższych objawów:

A wczesne objawy psychiatryczne

B przewlekłe objawy bólowe

C ataksja

D mioklonie lub pląsawica lub dystonia

E otępienie

III A brak typowego zapisu EEG

B MRI obustronnie wzmożony sygnał w poduszce wzgórza

Możliwe; tak jak prawdopodobne, ale bez IIIB

obraz neuropatologiczny vCJD - kwitnące blaszki amyloidowe otoczone wianuszkiem wakuoli

badania laboratoryjne:

- EEG - nieswoiste

- 14-3-3 - w połowie przypadków

- MRI - hiperintensywny sygnał w poduszce > 77% przypadków

- CT

- bad. migdałków podniebiennych (złogi PrP^SC w komórkach dendrytycznych)

W vCJD wykazano obecność PrP^SC nie tylko w tkankach mózgu i rdzenia kręgowego, ale również w tkankach układu limfatycznego (migdałki, kępki Peyera, wyrostek robaczkowy)

Badania molekularne:

- wszystkie przypadki vCJD homozygoty 129 Met/Met

- IV typ glikozylacji z przewagą najcięższych form oliglikozylowanych (z 2 resztami cukrowymi)

ZAKAŹNOŚĆ:

sCJD - wysoko zakaźne:

- mózg

- rdzeń kręgowy

- oko

- mniej zakażne:

- płyn mózgowo-rdzeniowy

- nerki

- wątroba

- płuco

- węzły chłonne

- śledziona

- łożysko

- w krwi zakaźności nie stwierdzono!

vCJD - również inne tkanki

Wariant może się przenosić przez krew!!

Dezynfekcja/ sterylizacja

- materiał jednorazowy - spalenie! w odpowiednio wysokiej temperaturze

- autoklawowanie -134˚C przez 18 min przy ciśnieniu 2 atmosfer

- 2 M NaOH przez 1h

- świeży podchloryn sodu

- 96 % kwas mrówkowy przez 1 h - tylko dla bloczków parafinowych

PROBLEM: endoskopy

Nie było na zajęciach:

CHOROBA GSS

- choroba dziedziczna

- niezwykle heterogenna w obrazie klinicznym (w zależności od mutacji w PRNP)

Mutacje:

- 102^Leu i 129^Met - ataksja, dyzatrie, objawy piramidowo-pozapiramidowe, później otępienie

- 117 Val -..............

- 105^Leu - spastyczna parapereza, ptetrapareza i otępienie, może trwać 12 lat

- 217 Glu.............................

- 198 Ser i Val

neuropatologia - blaszki wielordzeniowe o różnej lokalizacji

FFI

-choroba dziedziczna autosomalna dominująca

- początek 37-61 rok życia

- średnia wieku 51 lat

- mutacja w kodonie 178 (zamian GAC w AAC) i w kodonie

129 - Val to fenotyp CJD

129 - Met to fenotyp FFI

Objawy: postępująca bezsenność, ataksja, mioklonia, objawy piramidowe, otępienie, zaburzenia autonomiczne (nadmierna potliwość, wzrost temperatury), zaburzenia endokrynologiczne

badania:

- TK i MRI - bez zmian

- PET - hipometabolizm w obrębie mózgu

- EEG - całkowicie monomor0?????f. wolny zapis

przypadki o krótkim przebiegu - półsen

przypadki o długim przebiegu - skrócone fazy snu...................................................

KURU

- chorują jedynie członkowie plemienia FORE w Górach Wschodnich Papui Nowej Gwinei

„kuru' w języku Fore = drżeć

- prawie wyłącznie chorują kobiety i dzieci

- obrzędy endokanibalizmu

- zawsze śmiertelna ataksja móżdżkowa z i tu braki.......................................

FAZA I

- niepewny chód

- nie może utrzymać równowagi

- clonus rzepki

- clonus stopy

FAZA II

- nie może chodzić a później siedzieć bez podparcia

- ataksja, dyzartria

FAZA III

- unieruchomiony

- nie trzyma moczu i kału

- brak otępienia

- prymitywne odruchy - ssania, gryzienia

- zmiany nastroju - śmiech - płacz „śmiejąca się śmierć”

neuropatologia - wakuole w cytoplazmie, obkurczone neurony;

móżdżek - neurony ????????????

blaszki kuru - tak jak w vCJD tylko nie są otoczone wianuszkiem wakuoli

ĆW.12 HORMONY I CZYNNIKI WZROSTOWE - ASPEKT MOLEKULARNY

HORMONY STEROIDOWE rozpuszczalne w tłuszczach, więcej info, mogą mieć więcej modyfikacji

Budowa receptora:

• Domena wiążąca hormon

• Domena wiążąca DNA

• Zróżnicowany koniec N-terminalny

NL5 sekwencja lokalizacji jądrowej

Sekwencja palindromowa Nieważne w która stronę się czyta wygląda tak samo

HRE sekwencja palindromowa warunkująca odpowiedź na hormon

Białka transportujące hormony:

• SHBG h. płciowe

• CBG kortykosteroidy

• TBG h.tarczycy

TBG diagnostyka zbadać ilość niezwiązanych z hormonami

Tyreoglobulina - jako marker nowotworowy u pacjentów ze zróżnicowanym rakiem tarczycy

# Transtyretyna - rodzinna amyloidozowa polineuropatia:

• Nierozpuszczalne złogi tego białka

• komórki mogą gromadzic białko, dopiero po przekroczeniu wartości granicznej objawy

• gdy przekroczy pewien poziom tworzy się zawada przestrzenna

• w postaci metamerycznej nie jest funkcjonalna

Testosteron pod wpływem 5α-reduktazy powstaje DTH (dihydrotestosteron) główny czynnik przerostu prostaty

Androgeny aromataza estrogeny

Niedobór α1-hydrosylazy krzywica zależna od Wit.D typ1

Preproinsulin proinulina insulina

# Mutacje genu CYP-21 (21-dehydroksylaza - 6p21.3) wrodzony przerost nadnerczy

Niedobór kortyzolu, aldosteronu nadczynność przysadki przerost nadnerczy nadmiar androgenu

POMC - przebarwienia skóry

# ERα i ERβ patogeneza raka sutka, prostaty i jelita


Nabłonek jelita grubego ERβ wysoka ekspresja

Rak okrężnicy i odbytnicy (niska ekspresja ERβ)


Prawidlowa tkanka ERβ wysoka ekspresja

Ochronne działanie estrogenów!!!

Rak sutka i gruczołu krokowego (niska ekspresja ERβ)

Rak jądra nadmierne wydzielanie gonadotropiny kosmówkowej, LH i FSO

*Nieprawidłowa synteza receptorów hormonów bez sensu terapia hormonalna (gdyż defekt receptora)

Mutacje receptorów należących do nadrodziny receptorów steroidowych:

• zespół feminizujących jąder

• pseudohipoaldosteronizm

• krzywica witamino-D zależna

• oporność na hormony tarczycy (mutacja rec. T3)

Antagoniści receptorów:

• w nowotworze łagodnym gruczołu krokowego

• nadczynność tarczycy

• rak sutka antagoniści estrogenów (temoksyfen i raloksyfen) i aromatazy (anastrozol i letrozol)

• środek poronny (mifepriston - RU486; progesteron)

Ciągłe podawanie antagonisty hamuje działanie hormonu!

# Translokacja genu RARα (gen palca Zn) - ostra białaczka promielocytarna (zaburzenie dojrzewania granulocytów)

RARα receptor dla kwasu retinowego mutacja nie może przekazywać sygnału od kwasy retinowego

# Dziedziczna mutacja w obrębie receptora wazopresyny typ 2 - moczówka prosta nefrogenna

*wzajemne oddziaływanie hormonów:

kosmówczaki złośliwe stężenia βhCG łagodna nadczynność tarczycy

gonadotropina może stymulować rec. TSH większe powinowactwo do gonadotropiny

*Diagnostyka gigantyzmu (akromegalii u dorosłych) testy diabetologiczne test tolerancji glukozy (brak odpowiedzi na podaną glukozę)

# Choroby autoimmunologiczne!!!!(w zaburzeniach endokrynnych)

• cukrzyca typy II przeciwko receptorowi

• sporadyczna postać choroby Addisona przeciwko hydroksylazie (enzym katalizujący w syntezie kortyzonu)

• zapalenie tarczycy typu Hashimoto przeciwciała przeciwko tyreopeptydazie

• choroba Gravesa przeciwciała aktywują wydzielanie TSH

*Czynniki wzrostu:

• IGF - insulinopodobny czynnik wzrostu

• EGF - czynnik wzrostu naskórka

• PDGF - płytkopochodny czynnik wzrostu

• TGFβ - transformujący czynnik wzrostu β (działa antyproliferacyjnie)

• TGFα - transformujący czynnik wzrostu α (mitogen)

GH (hormon wzrostu) niezależnie od IGF (bezpośrednio wspomagające działanie insuliny) m.in. przyrost kości na długość

# !!!!!Rak gruczołu krokowego pod wpływem protezy serynowej rozczepia IGFBP zwiększa dostępność IGF

# Guz zaotrzewnowy włókniakomięsak nadekspresja IGF II aktywacja receptora insuliny hipoglikemia

# Karłowatość:

• Receptor GH

• Gen GH1

• Pit1 czynnik transkrypcyjny

# wysokie stężenie IGF I czynnik ryzyka nowotworów gruczołu krokowego, sutka, jelita grubego, okrężnicy

# DHT + rec. androgenowy PSA (prostate specific antygen) wiąże IGF BP






IGF BP ligand dla TGFβ (rec. dla supresora-`supresja') więcej wolnego IGF

wzrost guza prostaty

# rak gruczołu piersiowego receptor ER elementy odp. zlokalizowane w sekwencji poprzedzającej TGFα wzrost tkanek z receptorem ER



# EGF gdy nadmiar polipy guz

odporność na kwaśne środowisko + gojenie ran

*amplifikacje EGFR (guzy mózgu i rak płaskokomórkowy)

# Nadekspresja ErbB2 (sam nie jest zdolny do przekazywania sygnału)


nie przekazuje sygnału, ale dimeryzuje z innymi które to robią




selekcja ”najlepszych” klonów

zdrowa tkanka nadekspresja ErbB2 wykrywana przez P53 kieruje do apoptozy


# HGF (poprzez gen Met) regeneracja wątroby i nerek




wzrost, niekontrolowane podziały nowotwór

*protoonkogen sis homologia z PDGF, ale aktywuje wszystkie receptory PDGF niekontrolowany wzrost

# translokacja chromosomalna białko fuzyjce PDGF (telomeraza) przewlekła białaczka mielocytarna

* tkanki łatworegenerujące częste przerzuty

tkanki nie ulegające regeneracji

# TGFβ we wczesnych fazach rozwoju dzialanie antyproliferacyjne późne stadium, np.: raka gruczołu krokowego działa mitogennie promowanie wzrostu

25% nowotworów jelita grubego grubego okrężnicy związanych jest z mutacja TGFβ RII

* EGF + PDGF-A + PDGF-B + TGFβ gojenie ran

* PDGF IGF I nowotwór + zwłóknienie

# mutacja receptora hormonu luteinizujacego pseudohermafrodytyzm

# mutacja SMAD:

• 50% nowotworów trzustki (SMAD4)

• nowotwory okrężnicy i odbytnicy (SMAD4, SMAD3, SMAD2)

• nowotwory płuc (SMAD2)

• nasieniak jądra (SMAD4)

• polipowatość młodzieńcza

PYTANIA!!!

1. znaczenie TBG w diagnostyce może fałszować wyniki

2. tyreoglobulina jako marker nowotworowy u pacjentów ze zróżnicowanym rakiem tarczycy

3. transtyretyna rodzinna amyloidozowa polineuropatia

4. POMC w raku drobnokomórkowym płuca prekursor wielu hormonów

5. CYP21 wrodzony przerost nadnerczy

6. translokacja genu RARα ostra białaczka promielocytarna

7. choroby autoimmunologiczne!!!!

8. guz zaotrzewnowy włokniakomięsak hipoglikemia

9. DHT + rec.androgenowy stymuluje wytwarzanie proteazy gen PSA ”drzewko w tekście”

10. translokacja chromosomalna przewlekła białaczka mielocytarna

ĆW. 13 RECEPTORY A CHOROBY

Mutacja genu RET(koduje kinazę) nowotwory MEN2a i MEN2b, choroba Hirschprunga

Mutacje:

• aktywujące - głównie MEN2a i słabiej MEN2b

• inaktywujące - ch. Hirschprunga czynnik wzrostu nie powoduje aktywacji komórki

ch. Hirschprunga -brak unerwienia fragmentu jelita, urodzone dziecko po pewnym czasie wymiotuje kałem

RET jest onkogenem koduje receptor dla czynnika wzrostu

MEN2a i MEN2b guz chromochłonny nadnerczy, rak rdzeniasty tarczycy rodzinny, nerwiaki? wspólna embriogenez tych komórek z których rozwijają się nowotwory

Dziedziczenia:

• ch. Hirschprunga - dla pełnego fenotypu homozygota recesywna

• MEN2a i MEN2b - autosomalnie dominująco

*większość chorób nowotworowych dziedziczy się autosomalnie dominujaco

100% penetracja nowotwory bo RET jest onkogenem

Mniejsza gdy gen w którym jest mutacja jest białkiem supresorowym

Hipercholesterolemia rodzinna - receptor LDL

W obrębie tkanek gromadzą się olbrzymie ilości LDL (LDL na siłę wpychają się między tkanki) tłuszczaki (tęczówka, ściegna, powieka)

Dziedziczenie dominujące!

Już przy jednym uszkodzonym allelu są objawy 50% receptorów prawidłowych i 50% uszkodzonych nie jest to ilość wystarczająca do prawidłowego wychwytywania LDL gwałtowny wzrost poziomu LDL w osoczu

Hemochromatoza rodzinna - białko HFE - receptor transferyny

Białko HFE reguluje wchłanianie Fe ograniczona ilość wchłanianego Fe

HFE zabezpiecza przed nadmiarem Fe nadmierna ilość Fe jest wchłaniana

Dysfunkcje receptora dla transferyny.

Agammaglobulinemia Brutona - receptor BCR

Dziedziczenie sprzężone z chromosomem X

U kobiet ze zmutowanym tylko jednym chromosomem (heterozygoty) już są objawy,

Nie ma tego w przypadku hemofilii a dziedziczy się tak samo!

Kobiety maja dwa chromosomy X ale w każdej komórce funkcjonuje tylko jeden.

W hemofilii <5% komórek wątroby jest prawidłowych produkujących czynnik VIII to dopieo wtedy są objawy!

W agammaglobulinemi już brak 50% objawy!!!!

Trombastenia Glanzmana - receptor integrynowy IIbIIIa

Uszkodzenie genu kodującego integryne brak czopu hemostatycznego

Płytki krwi łączone są poprzez fibrynogen, który łączy się z receptorami integrynowymi na ich powierzchni.

Fibrynogen + receptory pod wpływem cz.II powstaje fibryna (cz.XIII) wiązanie kowalencyjne cementuje wiązanie fibryny

Hemofilia płytki działaja prawidłowo czop hemostatyczny

Brak czynnika VIII płytki sprawnie działają fibrynogen się rozwinie, na chwilę tworzenie skrzepu, ale zw na brak kaskady czynników krzepnięcia (brak VIII) krwawienie wraca!

Trombastenia - płytki nieprawidłowe przedłużony czas krwawienia!!

Trombina

niesamowicie silny aktywator płytek krwi

jeśli połavczy się ze swoim receptorem aktywuje go permanentnie

odcina fragmenty receptora które są aktywatorem dla tego receptora

powoduje przekształcenie fibrynogenu w fibrynę

Receptor bilirubiny - Zespół Gilberta

BCR/ABL - przewlekła białaczka szpikowa

Receptor EGF - glejak wielopostaciowy

Receptor NO - zaburzenia erekcji

Receptor insuliny - cukrzyca II typu

Receptory szlaków Hedgehog i WNT - nowotwory

Receptor GABA - Date Rate Drugs

Aktywacja receptora GABA wpuszcza jony chlorkowe do wnętrza komórki nerwowej obniża jej potencja utrudnione pobudzenie komórki

Wolne białko GP RO? Wirusa HIV wiąże się z białkiem CD4 limfocyta, przeciwciało anty-HIV łączy elementy CD4 i generuje ekspresję cząsteczki FAS na powierzchni limfocyta. Przyłączenie antygenu powoduje ekspresje ligandu Fas. Połączenie cząsteczki Fas z ligandem Fas tej samej bądź innej komórki powoduje uruchomienie procesu apoptozy i obumieranie komórek!




4

G.B.&M.C.

G.B.&M.C.